静脉高压引起的细胞外基质重塑：人类静脉曲张的蛋白质组学

2.1. 学科

调查符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则。在马萨诸塞州总医院机构审查委员会（IRB；方案2010P002776）批准和书面知情同意后，对大隐静脉曲张标本进行检查(n个=6）在膝盖水平的穿刺切口静脉切除术中被手术切除。正常隐静脉标本(n个=6）在接受冠状动脉搭桥手术的患者中通过手术切除获得；收集每个患者膝关节附近的隐静脉段进行分析。本研究招募的所有患者的临床特征总结如下在线补充材料，表S1两个队列在年龄和性别方面具有可比性。手术切除后立即处理所有静脉样本，即修剪脂肪组织并用冷盐水冲洗血液。将每个患者的静脉组织段置于福尔马林中进行后续组织学分析，或在液氮中快速冷冻并储存在−80°C下以供未来分析。

2.2. ECM蛋白富集

静脉组织按照前面描述的顺序进行提取。⁷简而言之，用冷PBS短暂清洗血管，在0.5 M氯化钠（NaCl）加蛋白酶和磷酸酶抑制剂中培养4 h，然后使用0.08%SDS脱细胞，并使用4 M盐酸胍（GuHCl）提取ECM蛋白48 h，然后进行蛋白质组学分析。详细信息见在线补充材料.

2.3. 质谱分析

在质谱分析之前，在纳米流液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific，Ultimate 3000 RSLC nano）上分离处理过的NaCl和GuHCl提取物中的胰蛋白酶肽。对于gel-LC-MS/MS分析，在质量-电荷全离子扫描模式下，从Orbitrap质量分析仪（LTQ-Orbitrap-XL，Thermo Fisher Scientific）收集光谱(米/z)范围450–1600。使用启用动态排除的数据相关采集模式，对每个MS扫描中的前六个离子进行MS/MS。对于溶液内LC-MS/MS分析，在质量-电荷全质谱模式下，从Q Exactive Plus仪器（赛默飞世尔科学公司）收集光谱(米/z)范围350–1600。使用启用动态排除的数据相关采集模式，对每次MS扫描中的前15个离子进行MS/MS。对于多反应监测（MRM），将色谱柱连接到三重四极杆质谱仪（TSQ Vantage，Thermo Fisher Scientific）进行预定测量。使用Skyline软件（2.6版，MacCoss Lab software）生成具有预测碰撞能量以及优化过渡和保留时间的过渡列表。每个肽至少选择四个转换。更多详细信息见在线补充材料.

2.4。人隐静脉平滑肌细胞的培养

从接受选择性冠状动脉旁路移植手术的患者中采集隐静脉样本(n个=6）利兹总医院。提取并扩增大隐静脉平滑肌细胞（SMC），详见在线补充材料将SMC接种到6孔组织培养板中。接种后24小时，细胞被血清饥饿1小时。所有处理24小时，以下刺激物在无血清DMEM中稀释，浓度为：人转化生长因子β-1（TGFβ-1，R&D系统）10 ng/mL，重组小鼠TNFα（R&D系统）100 ng/mL，以及对应于人类血管紧张素II（Ang II，Sigma-Aldrich）100 ng/mL的合成肽。刺激后基因表达的变化通过RT-qPCR使用针对相应人类靶点的探针进行测量（有关使用的所有探针的列表，请参阅在线补充材料，表S2).

2.5.体外NSV消化

NSV公司(n个=5）根据制造商提供的方案，用重组人糜蛋白酶（1µg/mL，研发系统）或类胰蛋白酶β1（250 ng/mL，研发系统）消化。对照组在不含酶的酶缓冲液中培养(n个= 5). 在缓冲液交换后，如前所述，通过蛋白质组学对消化物进行分析。⁸对消化后释放的蛋白质进行浓缩，并通过SDS–PAGE进行分离。蛋白质的凝胶分离有助于蛋白质降解的研究，因为蛋白质阶梯导致肽在多个凝胶带上的鉴定。切除整个通道，进行凝胶内胰蛋白酶消化，并通过LC-MS/MS进行分析。降解证据(P（P）<0.05）通过western blotting进一步验证。

3.2. 发现ECM的蛋白质组学

组织学确认后，对静脉组织的连续片段进行蛋白质组学分析(图1B类). 将VSV和NSV切成小块，并按照前面所述进行三步提取程序。⁷静脉样品与0.5 M NaCl、0.08%SDS和4 M GuHCl连续孵育，以脱细胞并依次提取细胞外空间蛋白。随后，采用了两种蛋白质组学工作流程：首先，用SDS-PAGE分离NaCl和GuHCl提取物，以降低样品复杂性；整个泳道被分成一系列凝胶带；如前所述，对它们进行蛋白质组学分析。⁷其次，对NaCl和GuHCl提取物进行溶液内消化。该MS/MS数据集存放在质谱数据的公共存储库中(http://www.ebi.ac.uk/pride，项目登录号：PXD002555）。溶液中消化法与更快、更灵敏的质谱仪相结合，在GuHCl提取物中检测到152个ECM蛋白质，在NaCl提取物中检测出136个ECM蛋白，而在凝胶-LC-MS/MS方法中分别检测到90个和115个ECM蛋白质（参见在线补充材料，图S1，包括代表性MS光谱）。

3.3. 静脉ECM成分

正如我们的亚分馏程序所预期的那样，氯化钠提取物富含细胞外空间的蛋白质和新合成的ECM蛋白质，这些蛋白质在间质基质中没有严重交联（参见在线补充材料，表S3). 纤维蛋白、ECM-相关肽酶或具有中断三螺旋的纤维相关胶原蛋白（FACITs）已通过与0.5 M NaCl的孵育溶解。相反，GuHCl提取物主要含有可溶性较低的蛋白质，如网状胶原蛋白、与胶原蛋白相关的蛋白质、层粘连蛋白或大聚集蛋白聚糖（参见在线补充材料，表S4). GuHCl和NaCl提取物之间的蛋白质鉴定差异突出显示在在线补充材料，图S2值得注意的是，在静脉ECM中首次鉴定出48种蛋白质(表1; 看见在线补充材料，表S5对于扩展版本）。

3.4. NSV和VSV的蛋白质组学比较

总的来说，在溶液中消化物中发现了更多差异表达的蛋白质(表1; 看见在线补充材料，表S5扩展版本），而不是gel-LC-MS/MS方法（参见在线补充材料，表S6)与NaCl提取物相比，GuHCl提取物中差异表达的蛋白质更多(图1C类). 在NaCl提取物中，VSV中TGFβ诱导蛋白ig-h3（BGH3）和血小板反应蛋白-1（TSP1）上调，后者是TGFβ活性的标志物。在GuHCl提取物中，I型胶原链α-1和α-2（CO1A1和CO1A2）以及层粘连蛋白β-1、β-2和γ-1（LAMB1、LAMB2和LAMC1）增加。然而，大多数调节性ECM成分都减少了，尤其是负责胶原纤维形成的富含亮氨酸的小蛋白聚糖（SLRP），对血管ECM的正确形成很重要(图2).

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图2

蛋白质组学揭示了NSV和VSV中不同的ECM组成。基于归一化蛋白质丰度的NSV和VSV中NaCl和GuHCl提取物的热图，以表示不同丰度的蛋白质(n个=每组6人）。划线蛋白通过MRM或western blot分析进行验证。用RT-qPCR在转录水平上分析粗体蛋白。未检测到其中一组的蛋白质用星号（*）标记。有关详细信息，请参阅表1.统计显著性(P（P）<0.05）使用Student’st吨-测试。

所有胶原蛋白都形成三个螺旋，但对拉伸应力的抵抗在有助于纤维形成的胶原蛋白中尤为重要。在这些原纤维胶原蛋白中，胶原蛋白I、III和V在血管系统中丰富。⁷VSV中CO1A1和CO1A2（即形成纤维的胶原蛋白）的增加与其他胶原蛋白家族相比，后者普遍减少(图三A类). 蛋白质组学方法定量准确性的证据是：(第页>0.9）不同胶原蛋白亚基丰度之间(图三B类).

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图3

VSV胶原蛋白组成的改变。(A类)NSV GuHCl提取物中纤维形成胶原蛋白的丰度与其他胶原蛋白家族的比较(n个=6）和VSV(n个= 6). 出于可视化目的，在左侧面板中将CO5A1和CO5A2的总离子电流（TIC）放大10倍。CO6A1和CO6A3在右侧面板中缩小了五倍。(B类)不同的链在血管组织中形成交联胶原蛋白聚合物。蛋白质丰度散点图（以TIC表示）表明同一胶原蛋白的不同链具有高度相关性。(C类)与VSV相比，NSV胶原蛋白中羟基脯氨酸的比例。与其他家族相比，纤维形成胶原蛋白的比例要高得多。VSV中胶原蛋白含量的失调不影响胶原蛋白羟基化的速率。使用Student’st吨-测试。*表示P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.

X-Pro-Gly三联体中胶原蛋白在脯氨酸上的羟基化是纤维形成的关键过程。⁹平均而言，96%属于纤维胶原的肽含有这种翻译后修饰。其他胶原蛋白中羟基化较少(图三C类). 虽然可检测到的羟基化Pro-Hyp-Gly序列是脯氨酸-3-羟化酶的靶点，⁹赖氨酸的羟基化¹⁰不太常见（参见在线补充材料，图S3). NSV和VSV之间的胶原羟基化没有差异。

3.5. 靶向蛋白质组学验证

我们利用了来自不同心血管领域的MS数据^5——8以及选择其他蛋白型肽进行靶向MRM分析（参见在线补充材料，图S4和表S7)确认VSV中LAMB2和LAMC1的增加，以及核心蛋白（PGS2）、阿司匹林（ASPN）、肾小管间质性肾炎抗原样蛋白（TINAL）、皮桥蛋白（DERM）、卵黄凝集素（VTNC）和聚集蛋白（PGCA）的丢失。MRM分析也证实了上述VSV中CO1A1和CO1A2的增加(图4A类). 通过为同一蛋白质选择两种不同的蛋白型肽，证明了MRM方法的准确性(图4B）对于大多数蛋白质，同一蛋白质的两个不同肽之间的相关性很高（即。第页> 0.95). 一个例外是聚集蛋白聚糖，可能是因为所选肽位于普通聚集蛋白酶裂解位点的相反位置。

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图4

靶向蛋白质组学（MRM分析）验证蛋白质组学发现。(A类)MRM分析用于验证NSV中额外ECM蛋白的差异表达(n个=6）和VSV(n个= 6). 层粘连蛋白亚基β2；LAMC1，层粘连蛋白亚单位γ1；PGS2，花色；ASPN，阿司匹林；小管间质性肾炎抗原样蛋白；DERM，皮桥蛋白；VTNC，卵黄凝集素；PGCA，聚集聚糖；CO1A1和CO1A2，胶原蛋白α1（I）和α2（I）链。(B类)同一蛋白质的两个肽的MRM分析显示出高度相关性，这表明我们的测量结果具有稳健性。只有聚集蛋白聚糖（PGCA）相关性较差。使用Student’st吨-测试。*表示P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.

3.6. 通过独立技术验证

相同组织中的基因表达分析表明，ECM蛋白丰度的大多数变化并没有伴随相应的基因表达变化(图5A类). 在蛋白和转录水平上，仅观察到VSV中mimecan（MIME）和aggrecan（PGCA）的下调。纤维连接蛋白（FINC，表1)VSV中的半乳糖凝集素-1（参见在线补充材料，表S6)经免疫组织化学证实（参见在线补充材料，图S5). 对mimecan、fibronectin、TGFβ诱导蛋白ig-h3、gelsolin（GELS）和decorin进行额外的免疫印迹，以确认蛋白质丰度的变化(图5B类; 看见在线补充材料，图S5用于通过密度测定进行量化）。通过使用TGFβ-1、TNFα或Ang II刺激的静脉人SMC进一步验证了咪咪康的下调作用。TGFβ-1和TNFα，而不是Ang II，能够诱导mimecan基因表达的抑制(图5C类).

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图5

ECM中的蛋白质丰度与相应的基因表达水平之间的差异。(A类)ECM靶基因的相对表达(图2)在NSV和VSV中。NSV和VSV的蛋白质组学分析后检测到的蛋白质丰度水平显示用于比较（左图）。为了比较具有不同基础值的转录物和蛋白质，NSV的蛋白质丰度和基因表达水平设置为“1”。水平线表示NSV和VSV的SEM(n个=每组6人）。黑色方块表示显著(P（P）<0.05）学生决定的变化t吨-测试。(B类)mimecan（MIME）、fibronectin（FINC）、TGFβ诱导蛋白ig-h3（BGH3）、gelsolin（GELS）和decorin（PGS2）的免疫印迹。(C类)来自六名与TGFβ-1和TNFα孵育的供体患者的静脉人SMC显示出模拟物表达减少。用Ang II孵育不影响模拟物的表达。未模拟控制单元的表达级别由虚线表示。使用带有Dunnett校正的ANOVA检验计算统计显著性。***表示P（P）< 0.001.

4.1、。静脉ECM重塑

肝、内脏和外周循环中的静脉高血压影响大量肝肾和心血管疾病患者。虽然静脉高血压的病因可能是多因素的，但静脉壁水平的表观遗传因素也可能参与介导易感性。静脉曲张是当今最常见的医疗问题之一，据估计，全球女性和男性的发病率分别高达73%和56%。¹¹它与严重的发病率相关，并具有相当大的经济影响，造成估计200万个工作日的损失，仅在美国治疗就要花费30亿美元。¹²静脉曲张的发病机制与许多诱发因素有关，包括妊娠、创伤、肥胖和站立时间延长。然而，越来越明显的是，其发展更为复杂，可能涉及先天性、表观遗传或局部遗传特征，这些特征可能在增加静脉曲张的易感性方面发挥关键作用。^三

到目前为止，还没有对包括NSV和VSV的ECM部件进行全面分析。近年来，我们小组利用蛋白质组学研究了不同心血管疾病中的ECM重塑，包括主动脉标本中的ECM重构。^5,6,13与其他组织相比，去细胞化步骤是减少复杂性和减少心血管组织中细胞和血液衍生蛋白质携带的关键。¹⁴凝胶LC-MS/MS方法的一个警告是，非常大的ECM蛋白质可能不会迁移到凝胶中。¹⁵另一方面，这些高Mw蛋白的存在可以掩盖不太丰富的ECM蛋白的存在，因为它们产生的胰蛋白酶肽比低Mw蛋白多得多。同样，在本研究中，这两种方法都揭示了有趣且互补的蛋白质变化，并通过独立技术进行了验证，包括western blot和MRM分析。

在VSV中，血管周间隙被ECM蛋白包围。血管周围袖带是对机械负荷增加的初始反应，并伴有胶原沉积。然而，胶原纤维显示出异常的分布和形态。免疫组织化学分析表明，VSV具有不规则的胶原纤维生成和多余的BM层。¹⁶我们的蛋白质组学结果通过显示VSV中I型胶原链和层粘连蛋白的增加证实了这些组织学发现。胶原蛋白纤维的组装、大小和结构所需的其他BM蛋白和胶原蛋白结合蛋白显示慢性静脉功能不全显著减少。TGFβ诱导蛋白ig-h3（一种TGFβ活性的下游标记物）和血小板反应蛋白-1（一种关键的TGFβ激活物）的表达增加，证实了之前关于VSV局部TGFβ水平加剧的报道。¹⁷此外，我们的蛋白质组学研究显示SLRP减少。¹⁸在静脉血管中检测到的所有SLRP（decorin、mimecan、biglycan、fibromodulin、prelrgin、lumican、asporin和podocan）都具有马蹄形，并包裹胶原纤维，以确保适当的口径、形状和配置。¹⁹此外，核心蛋白、二聚糖、纤维调节蛋白和阿司匹林结合TGFβ，抑制促纤维化途径的激活。¹⁸具有TGFβ结合活性的SLRP和TGFβ隔离蛋白（如软骨中间层蛋白1（CILP1，图2)支持慢性静脉功能不全时TGFβ活性加剧的观点。¹⁷此外，我们的数据表明，在静脉平滑肌细胞中，其他SLRP的表达，如咪咪康，不仅对促炎症细胞因子TGFβ-1有反应，而且对促炎细胞因子TNFα也有反应，已知在静脉溃疡患者中升高。²⁰

4.2. 血管蛋白酶

MMPs具有广泛的底物特异性⁸已被确定为ECM降解的关键驱动因素，特别是在静脉重塑的早期阶段。²¹在我们对GuHCl提取物的蛋白质组学分析中检测到TIMP3（即广谱基质相关金属蛋白酶抑制剂）的蛋白质水平降低(表1)，支持静脉性高血压中蛋白水解活性增加的概念。然而，TIMP3在转录水平上没有改变(图6B类)但以前曾被认为在动脉高血压中保护血管ECM。²²其他金属蛋白酶包括来自ADAMTS家族的聚集酶。ADAMTS酶是分泌的多域锌金属内肽酶，在生理病理重塑、炎症和血管生物学中具有多种作用。²³有趣的是，aggrecan是软骨的主要ECM成分，此前已在主动脉组织中发现。⁷聚合聚糖表面带负电荷的聚糖会吸水，因此具有抗压性。据我们所知，本研究是首次报道静脉组织中聚集蛋白聚糖的鉴定。与NSV相比，VSV中聚集蛋白聚糖的表达在蛋白质和转录水平上降低。聚集蛋白聚糖的丢失伴随着聚集酶表达的减少（ADAMTS1和ADAMTS4）。

我们的蛋白质组学分析返回了额外的蛋白酶，包括糜蛋白酶和类胰蛋白酶β1。这些丝氨酸蛋白酶通常归因于肥大细胞的分泌颗粒，并促进炎症和ECM重塑。^24,25尽管一项研究报告称，静脉曲张和非扩张静脉壁的平均肥大细胞密度没有显著差异，²⁶几组研究表明肥大细胞是VSV的主要细胞类型。²⁷有趣的是，VSV中的糜蛋白酶染色很少与类胰蛋白酶β1共存(图6C类). 自发性高血压大鼠的动脉中曾报道过血管SMC表达的糜蛋白酶。^28,29虽然观察到的染色模式表明包括SMCs在内的VSV中普遍存在糜蛋白酶，但培养的人静脉SMCs中缺乏糜蛋白酶表达则相反，TGFβ-1、Ang II和TNFα刺激未能诱导表达（数据未显示）。尽管我们观察到VSV中巨噬细胞谱系标记CD68的丰度增加，Shankman最近的一篇论文等。³⁰证明CD68和其他非SMC标记物的表达可以在动脉粥样硬化斑块内的SMC中诱导。因此，需要进行谱系追踪而不是联合染色来确定病变组织中的细胞起源。

除了血管壁中依赖于糜蛋白酶的血管紧张素Ⅱ生成途径外，^28,31乳糜酶还可能通过其他几种机制影响血管，特别是影响SMC。³²例如，Leskinen等。^33,34证明了糜蛋白酶通过降解细胞周ECM成分纤维连接蛋白，导致局部黏附复合体破坏和Akt去磷酸化，从而促进血管平滑肌细胞的凋亡，这是细胞黏附和存活所必需的。同样，我们观察到纤维连接蛋白降解和通过NSV的糜蛋白酶消化优先释放BM蛋白。另一方面，间质液中存在内源性蛋白酶抑制剂，可抑制糜蛋白酶活性。³⁵最近的一项研究强调了蛋白水解酶活性在壁应激诱导的适应性不良静脉重塑中的重要性；硼替佐米抑制26S蛋白酶体可稳定静止SMC表型。硼替佐米抑制26S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性，经皮给药使小鼠模型中静脉SMC增殖减少80%，并抑制静脉曲张样重构。³⁶值得注意的是，糜蛋白酶具有糜蛋白酶样底物特异性。

我们感谢Athanasios Didangelos博士的技术援助和Sarah Langley博士在统计分析方面的帮助。

利益冲突：没有声明。