Changes in the chondrocyte and extracellular matrix proteome during post-natal mouse cartilage development

doi:10.1074/mcp.M111.014159

.2012年1月；11（1）：M111.014159。

doi:10.1074/mcp。M111.014159。 Epub 2011年10月11日。

出生后小鼠软骨发育过程中软骨细胞和细胞外基质蛋白质组的变化

附属公司

¹澳大利亚维多利亚州墨尔本市帕克维尔皇家儿童医院默多克儿童研究所，邮编3052；澳大利亚塔斯马尼亚州霍巴特塔斯马尼亚大学中央科学实验室，邮编：7001。电子地址：richard.wilson@utas.edu.au。
²澳大利亚昆士兰4029赫斯顿皇家布里斯班医院昆士兰医学研究所蛋白质发现中心。
^三科隆大学科隆分子医学中心，德国科隆50931；德国科隆50931科隆大学生物化学中心医学院。
⁴澳大利亚维多利亚州3052，墨尔本，帕克维尔，皇家儿童医院，默多克儿童研究所。
⁵澳大利亚维多利亚州墨尔本市帕克维尔皇家儿童医院默多克儿童研究所，邮编3052；澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学儿科，邮编3052。
⁶德国科隆50931科隆大学生物化学中心医学院。
⁷大阪大学蛋白质研究所，日本大阪住田565-0871。
⁸澳大利亚维多利亚州墨尔本市帕克维尔皇家儿童医院默多克儿童研究所，邮编3052；澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学生物化学和分子生物学系，邮编3052。电子地址：john.bateman@mcri.edu.au。

PMID： 21989018
预防性维修识别码：项目经理3270109
内政部： 10.1074/mcp。M111.014159号

出生后小鼠软骨发育过程中软骨细胞和细胞外基质蛋白质组的变化

理查德·威尔逊等。分子细胞蛋白质组学. 2012年1月.

.2012年1月；11（1）：M111.014159。

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¹澳大利亚维多利亚州墨尔本市帕克维尔皇家儿童医院默多克儿童研究所，邮编3052；澳大利亚塔斯马尼亚州霍巴特塔斯马尼亚大学中央科学实验室，邮编：7001。电子地址：richard.wilson@utas.edu.au。
²澳大利亚昆士兰4029赫斯顿皇家布里斯班医院昆士兰医学研究所蛋白质发现中心。
^三科隆大学科隆分子医学中心，德国科隆50931；德国科隆50931科隆大学生物化学中心医学院。
⁴澳大利亚维多利亚州3052，墨尔本，帕克维尔，皇家儿童医院，默多克儿童研究所。
⁵澳大利亚维多利亚州墨尔本市帕克维尔皇家儿童医院默多克儿童研究所，邮编3052；澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学儿科，邮编3052。
⁶德国科隆50931科隆大学生物化学中心医学院。
⁷大阪大学蛋白质研究所，日本大阪，邮编565-0871。
⁸澳大利亚维多利亚州墨尔本市帕克维尔皇家儿童医院默多克儿童研究所，邮编3052；澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学生物化学和分子生物学系，邮编3052。电子地址：john.bateman@mcri.edu.au。

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摘要

软骨内骨化导致的骨骼生长涉及紧密协调的软骨细胞分化，从而在生长板中形成储备、增殖、前增生和肥大的软骨区。许多人类骨骼疾病都是由软骨细胞外基质（ECM）成分的突变引起的，这些突变破坏了ECM结构和软骨细胞功能。因此，了解正常软骨的发育、组成和结构对揭示这些疾病机制至关重要。为了通过蛋白质组学在体内研究这一复杂过程，我们分析了处于发育阶段的小鼠股骨头软骨，这些软骨富含未成熟软骨细胞或成熟/肥大软骨细胞（分别为出生后第3天和第21天）。使用LTQ-Orbitrap串联质谱，我们鉴定了703个软骨蛋白。差异丰富的蛋白质（q<0.01）包括早期和晚期软骨细胞分化的原型标记物（分别为骺和X型胶原）以及新的ECM和细胞黏附蛋白，它们在软骨发育中没有先前描述的作用（tenascin X、cosclin、Urb、emilin-1和寿司重复蛋白SRPX和SRPX2）。体内软骨发育和体外软骨细胞培养模型的Meta分析（Wilson，R.、Diseberg，A.F.、Gordon，L.、Zivkovic，S.、Tatarczuch，L.，Mackie，E.J.、Gorman，J.J.和Bateman，J.F.（2010）使用连续提取和无标签定量蛋白质组学对软骨细胞外基质的形成和成熟进行全面分析。摩尔细胞。蛋白质组学9，1296-1313）确定了两个系统中涉及的成分，如Urb，以及在体内具有特定作用的成分，包括玻璃蛋白和CILP-2（软骨中间层蛋白-2）。Urb、镜质体和CILP-2的免疫定位显示了它们在不同成熟阶段的特定作用。除了ECM相关的变化外，我们还首次提供了软骨发育过程中内质网功能变化的生化证据。虽然多功能伴侣蛋白BiP没有差异表达，但胶原蛋白生物合成所需的酶和伴侣蛋白，如脯氨酰3-羟化酶1、软骨相关蛋白和肽基脯氨酰基顺反异构酶B复合物，在成熟过程中下调。相反，管腔蛋白钙调素、网织钙素-1和网织钙蛋白-2显著增加，表明向钙结合功能转变。这是第一次对体内软骨发育进行蛋白质组学分析，揭示了小鼠股骨头软骨细胞成熟和ECM重塑过程中蛋白质表达变化的广度。

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数字

**图1。**
**软骨在软骨内骨化中的作用。** A类和B类间充质细胞浓缩并分化形成软骨细胞，合成胶原蛋白II和富含聚集蛋白的ECM，为软骨内骨化提供软骨模板（分析）。C类，当中心软骨细胞成熟并肥大时，初级骨化过程开始。D类和E类，肥大的软骨钙化，为血管侵袭提供了生态位。钙化的软骨被原骨所取代，原骨随后被重塑，形成次生骨和骨髓。这个过程从原基中心向外辐射，发育出高度有序的生长板，将软骨骨骺与骨骨干分开。如果和*G公司*随着骨的生长，软骨细胞在骨骺内形成次级骨化中心，软骨细胞停止增殖并发生肥大。这在不同的骨骺中发生的频率不同。小时在人类中，初级和次级骨化中心在青春期后融合，而在成年小鼠中，生长板软骨的狭窄区域仍然存在。

**图2。**
**组织和细胞水平软骨发育的股骨头模型特征。** A类，苏木精和伊红染色显示出生后发育3天（P3）至21天（P21）之间软骨组织学的变化。假定的骨化中心(*OC公司*)P3软骨由未成熟软骨细胞填充，P21处大部分被肥大软骨取代。在P3软骨中，关节软骨细胞(*自动控制*)均一，而P21软骨表面(箭头)和中间区域(*实心箭头*)关节软骨细胞更容易区分。在这两个阶段，扁平的增殖柱(*公共关系*)生长板中可见软骨细胞。B类P3和P21软骨细胞的荧光激活细胞分选，以区分软骨细胞的分化状态。在三个独立的实验中制备和分选软骨细胞，并显示了代表性的图。所有软骨细胞都标记有CD24a抗体(y轴)，而CD200(X轴)是前增生和肥大软骨细胞的标志物。CD24a比例增加⁺/CD200型⁺单元格(*第2季度*)相对于CD24a⁺/CD200型⁻单元格(*第一季度*)与成熟软骨细胞数量增加一致。

**图3。**
**股骨头软骨的连续提取。** A类采用物理（粉碎）、化学（4）相结合的方法从软骨中提取蛋白质米GdnHCl）和酶（使用软骨素酶ABC脱糖）方法破坏细胞外基质米氯化钠提取物(*E0类*)没有进一步细分，而4米通过离心超滤将盐酸葡萄糖提取物进一步分离为标称低浓度(*E1级*)和高(*E2级*)分子质量分数。B类，股骨头软骨蛋白提取物的SDS-PAGE图谱显示了生物复制品和软骨蛋白有效分割为三个不同部分之间的再现性。三天重复连续提取物的等分(*第3页*)和21天(*第21页*)用Bis-Tris 4–12%NuPAGE解析相当于蛋白质产量2%的软骨，并用银染色观察蛋白质。

**图4。**
**P3和P21股骨头软骨数据集在三种错误发现率下的归一化蛋白计数的全局表示。**每个*数据点*MA图中表示P3和P21软骨中蛋白质的相对丰度。两个轴都是对数₂转换，其中*水平轴*表示光谱计数的乘积*垂直轴*表示光谱计数的比率。这个*实线灰色线*代表相等的丰度*灰色虚线*代表丰度的2倍差异。在*A–C*，的*黑色数据点*代表丰度有显著差异的蛋白质。提供的重要蛋白质数量q个0.001、0.01和0.05的值阈值分别为74、146和282。D类，两个生物复制（P3复制R1和R2）的代表性图，以显示蛋白质的零分布，即那些在数量上没有实际差异的。

**图5。**
**与股骨头软骨发育相关的功能群。**每个*数据点*图中表示P3和P21软骨之间蛋白质的相对丰度，其中高于*水平轴*在第21页更为丰富。两个轴都是对数₂转换，其中*水平轴*表示光谱计数与*垂直轴*表示光谱计数的比率。在A类和B类，彩色数据点代表差异丰富的蛋白质(q个<0.01）和英寸C类，这些蛋白质在丰度上没有显著差异。A类，与内质网相关的三个不同蛋白质组：氧化还原酶活性蛋白质（Lepre1、Plod2、Plod 1、P4ha1和P4ha2）突出显示为*绿色填充圆*，蛋白质二硫键异构酶活性蛋白质（P4hb、Pdia3、Pdia4和Pdia6）突出显示为蓝色*实心圆圈*，和PIRSF036326：网织球蛋白（Calu、Rcn1和Rcn2）突出显示为*红色填充圆圈*。已确定的网织红细胞生成素家族的第四个成员（Rcn3）突出显示为*打开红色圆圈。B类*、核糖核蛋白（Hnrnpab、Hnrnpu、Rpl9、Rpl27a、Rps4x、Rps6、Rps8、Rpl4、Rpl6、Rpl32、Rps15和Rpl22）。C类P3和P21软骨中不存在差异丰富的管家蛋白家族：微管蛋白链Tuba1b、Tuba1a、Tubb2a、Tub2c、Tubb5和Tubb6(*红色填充圆圈*); 14-3-3蛋白Ywhaq、Ywhab、Ywhae、Ywhah、Ywhag和Ywhaz(*蓝色填充圆*); 以及t复合物伴侣蛋白亚基Cct2、Cct3、Cct4、Cct5、Cct6a、Cct7、Cct8和Tcp1(*绿色填充圆*).

**图6。**
**全球评估*在体外*和体内软骨发育模型。**MA图*在体外*(*左侧面板*)和体内(*右侧面板*)光谱计数数据。这个*在体外*光谱计数数据基于P3小鼠膝骨骺软骨和新软骨培养物的蛋白质组比较（12）体内光谱计数数据基于P3和P21股骨头软骨。这个*水平轴*表示光谱计数的乘积*垂直轴*表示光谱计数的比率。轴是对数₂转化。没有差异丰富的蛋白质绘制为*灰色圆圈。A类*，蛋白质丰度差异显著(q个<0.01）或*在体外*或体内由表示*开放的圆圈*，两种发育系统中差异丰富的蛋白质表示为*黑色圆圈。B类*，蛋白质亚群*在体外*和体内按功能术语细胞外基质分类(*发动机控制模块*)，内质网(*急诊室*)和核糖核蛋白(核糖)突出显示为*实心圆圈*不同丰富的蛋白质表示为*黑色填充圆圈*.

**图7。**
**参与软骨成熟的细胞外基质和相关蛋白的比较*在体外*和体内.**与软骨成熟相关的蛋白质*在体外*通过比较P3膝骨骺软骨和新软骨培养物进行鉴定。差异丰富的蛋白质(n个=102），由重要功能术语细胞外基质注释的蛋白质；多糖结合；血小板反应蛋白，C末端；类EGF，类型3；层粘连蛋白G，血小板反应蛋白型，N末端；纤维胶原；和von Willebrand因子，C型包括*在体外*子集。包含体内亚类是与P3和P21股骨头软骨发育相关的ECM和基质相关成分体内表I中详细描述了。A类，蛋白质的维恩图增加在软骨发育过程中*在体外*(我)特别是体内(三)或两者兼而有之*在体外*和体内(二). 第三组中的八种蛋白质在*大胆的*仅在P21软骨中检测到，而在新软骨中也检测到了其余六种蛋白质，但没有显著富集。B类，蛋白质的维恩图降低在软骨发育过程中*在体外*(四、)特别是体内(*不及物动词*)或两者兼而有之*在体外*和体内(*V（V）*). 第五组包括Ucma（独特软骨基质相关蛋白），因为在这两个比较中，它在P3软骨中富集；然而，这只是统计上的显著性(q个<0.01）*在体外*.

**图8。**
**股骨头软骨和3周新软骨培养中镜质、Urb和CILP-2的免疫组织化学。** A类P3和P21股骨头软骨的矢状石蜡切片和3周软骨细胞新软骨培养物的冰冻切片用Urb、coscln和CILP-2抗体孵育。这三种蛋白质的阳性免疫定位表示为*棕色的*染色，组织学/核定位显示为*蓝V柄*苏木精反染剂。B类，展开了*装箱区域*在里面A类P21股骨头软骨的标记区域对应于假定骨化中心的肥大软骨(星号)成熟/前增生软骨细胞区域(*打开的箭头*)和增殖的软骨细胞柱(括号). 假定的骨化中心和下生长板边缘CILP-2染色最强烈的区域标记为*实心三角形*新软骨培养物中Urb染色最强烈的区域显示为箭头.

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