SMCs依赖KLF4的表型调制在动脉粥样硬化斑块的发病机制

动脉粥样硬化斑块内的SMC表达Ms、MSCs和MFs公司

在表征这些表型调制的SMC时，我们发现YFP公司⁺病灶内表达标志物的人群百万秒（LGALS3）(图1c),MSC（SCA1）(图1d)、和MF（ACTA2和PDGFβR）(图。第1页). 根据这些数据，我们估计以下分布病灶内SMC衍生细胞：30%M-样（YFP⁺ACTA2公司⁻LGALS3型⁺); 7%MSC类（YFP⁺ACTA2公司⁻SCA1公司⁺); 12%MF类（YFP⁺ACTA2公司⁺血小板生长因子βR⁺), 32–51%未知表型（YFP⁺ACTA2公司⁻LGALS3型⁻SCA1公司⁻)(补充的表1). 此外，这些分析表明，36%的LGALS3型⁺晚期动脉粥样硬化病变内的细胞YFP公司⁺，表明正常情况下约1/3的细胞在该领域的大多数先前研究中被归类为M⁄sSMC，而不是先前假设的髓细胞。

这些初步研究是在石蜡包埋样品中进行的，以维持斑块的超微结构并确定病灶内的各种SMC衍生细胞。然而，这种技术限制了同时检查的标记物的数量。为了进一步表征各种SMC表型，我们对新鲜分离的细胞进行流式细胞仪分析从主动脉根部穿过髂骨分叉。结果表明：大量SMC衍生细胞表达多种额外的M/造血标记物(图。第1页)包括YFP⁺共同表达ITGAM的细胞（CD11b）一个单核细胞/M标记，以及F4/80一个与成熟相关的标记以及树突状细胞标记物ITGAX（CD11c）。此外，流式细胞术分析表明，13%的SMC对MSC呈双重阳性标记SCA1和ENG（CD105）(图。第1页). 通过传统阴性分析YFP+MSC时门控策略（CD45⁻CD34型⁻CDH5型⁻)我们发现在18周的西方饮食中，主动脉内高达45%的MSC样细胞馈电SMC YFP^+/+ 阿波^−/−小鼠为YFP+(补充图。3a年)尽管还不清楚这些是否都位于损伤或它们以前是否也有助于外膜SCA1+细胞由几个组描述^28-32.面向所有人的选通策略流式细胞术实验是基于荧光负一（FMO）测定的控件(补充的图3b，c).

进一步评估形态和可能的功能特性SMC衍生的M样细胞体内我们分析了BCASMC YFP损伤^+/+ 阿波^−/−透射电子小鼠显微镜结合免疫金标记检测YFP表达。作为在中看到图2a和补充的图4，我们确定了YFP⁺单元格包含多个看起来具有吞噬功能的大型脂泡。此外，我们流动分拣的SMC衍生MSC（YFP⁺发动机⁺SCA1公司⁺),非SMC衍生MSC（YFP⁻发动机⁺SCA1公司⁺),和SMC非MSC（YFP⁺发动机⁻SCA1公司⁻)从18周的西方饮食喂养谱系追踪小鼠，以测试它们的能力分化为包括脂肪细胞和成骨细胞在内的多种谱系。之后MSC维护介质中的两个通道，SMC非MSC变得不健康死亡（数据未显示）。SMC衍生MSC设法在MSC中生存下来维护介质出现老化，生长缓慢(图2b). 他们也没有做到分化为任一脂肪细胞(图。2c、d)或成骨细胞（数据未显示）暴露于这些各自的分化介质。相比之下，YFP⁻（非SMC衍生）MSCs生长良好，并表现出高效分化为脂肪细胞(图2c、d)和成骨细胞（数据未显示）。这些数据表明，尽管动脉粥样硬化病变中的SMC衍生细胞表达多种标志物MSCs，我们没有证据表明它们是多功能的，因此似乎没有充当MSC。

在单独的窗口中打开

图2

典型调制的类MSMC具有一些功能Ms的特征，但MSC样SMC显示生长受损非多电位

(一)18周西餐SMC中BCA的免疫电镜研究电子YFP^+/+ 阿波^−/−使用10nm金珠的小鼠结合二级抗体显示YFP脂质过多⁺细胞吞噬邻近细胞。黄色箭头表示免疫金珠。比例棒（从左到右）：2μm、0.5μm、0.2μm。(b条)隔离YFP⁺和YFP⁻MSC（MSC）（SCA1⁺发动机⁺)在间充质干细胞培养基中培养10天镀后，绿色为天然YFP信号。(c（c）)YFP公司⁺和YFP公司⁻MSC（SCA1⁺发动机⁺)之后基于脂肪细胞标记物FABP4染色的脂肪分化。比例巴=200μm。(d日)从五个方面量化脂肪生成每个组的视图字段。误差线=S.D*P（P）< 0.05由学生的t吨-测试。

人类动脉粥样硬化瘤中的SMC表达M标记CD68

独立检测表达LGALS3，为了验证检测人类病变中这些细胞的方法，我们利用一本小说就地杂交近接连接试验（ISH-PLLA）最近由我们实验室开发²⁷.此技术允许识别固定组织中基于检测的表型调制SMCH3K4dime的我的11促进剂（PLA）⁺)，一个SMC特异的表观遗传特征，存在于没有检测到的细胞中SMC标记的表达^27，33。我们首先验证了该方法通过显示YFP⁺LGALS3型⁺我们家族中的SMC追踪小鼠也保留了这种SMC特异的表观遗传特征(补充图。5a级). 我们还发现，培养的RAW 264-7小鼠M⁄电池(补充图5b)或人类单核细胞(补充图。5厘米)展示了H3K4dime我的11暴露时POVPC，一种低密度脂蛋白的氧化产物，可激活单核细胞/M⁄s³⁴.

确定人类SMC是否转变为类M状态我们对人类冠状动脉粥样硬化病变进行CD68和ACTA2和ISH-PLA检测SMC特异性表观遗传标记2011马来西亚令吉H3K4直径。多发性冠状动脉病变分析了12名受试者的切片(补充图。5天). 我们发现了18%的CD68⁺具有高级的单元格人类冠状动脉病变SMC特异性阳性2011马来西亚令吉基于ISH-PLA分析的H3K4dime表观遗传特征(图3a-c),表明它们来源于SMC。为了进一步验证这些发现，我们执行ISH-PLA分析2011马来西亚令吉冠状动脉中的H3K4dime接受过跨性别心脏移植的男性样本(补充图。6)并找到2011马来西亚令吉H3K4dime解放军⁺CD68型⁺Y染色体阴性的细胞(图3d)，与这些一致M-样细胞为SMC，非造血来源。重要的是，我们从未见过2011马来西亚令吉H3K4dime解放军⁺和Y染色体⁺(图。三维以及未公开的数据），从而清楚地证明髓细胞不会获得2011马来西亚令吉H3K4diMe SMC表观遗传甚至在人类动脉粥样硬化病变的情况下也有特征。

在单独的窗口中打开

图3

人类冠状动脉病变内的SMC表达MCD68型

(一)晚期动脉粥样硬化病变标本中的SMC基于PLA检测SMC特异稳定表观遗传签名H3K4dime2011马来西亚令吉²⁷.2011马来西亚令吉H3K4角解放军⁺细胞核内的细胞呈现点状红点，而非核无定形红染色为自体荧光或非特异性染色背景。(一)样本还进行了CD68（绿色）免疫染色，和DAPI（蓝色）。结果显示，在右侧放大的面板，用白色箭头表示：（i）2011马来西亚令吉H3K4dime解放军⁺SMC是CD68型⁻，（ii）2011马来西亚令吉H3K4角解放军⁻CD68型⁺（HSC-衍生Ms），和（iii）H3K4角我11H3K4dime解放军⁺CD68型⁺SMC衍生的M样细胞。比例尺=100μm。(b条)斑块内的肩部区域[用DAPI（蓝色）、ACTA2（绿色）、PLA染色（红色）和CD68（青色）]表现出SMC衍生类M的高发病率单元格(2011马来西亚令吉H3K4dime解放军⁺CD68型⁺)（黄色箭头）和几个CD68阴性的表型调制SMC(2011马来西亚令吉H3K4dime解放军⁺ACTA2公司⁻CD68型⁻)（白色箭头）。比例尺=50μm。(c（c）)SMC衍生类M细胞的定量分析基于人体冠状动脉病变2011马来西亚令吉H3K4角ISH-PLA+/−调整PLA的效率²⁷误差条=12个独立的S.E.M右冠状动脉的人类动脉粥样硬化样本。(d日)表观遗传SMC和遗传HSC交叉性别谱系追踪分析人类心脏移植样本。男性患者冠状动脉标本接受女性心脏手术的患者2011马来西亚令吉H3K4角PLA（红色）、Y染色体FISH（绿色）和CD68染色（黄色）。结果显示细胞2011马来西亚令吉H3K4dime解放军⁺Y染色体⁻和CD68⁺（黄色箭头）反映非造血来源的SMC衍生M样细胞（顶部）。相反，造血起源的Ms是2011马来西亚令吉H3K4角PLA⁻Y染色体⁺CD68型⁺（红色箭头）（底部）。比例尺=50μm。

KLF4在调节SMC表型和总斑块中起关键作用发病机理

我们之前已经证明KLF4，一种ESC和iPS细胞的多能性因素³⁵，是必需的用于几个SMC表型转换在体外^25，36模型。然而，目前还没有证据表明SMC动脉粥样硬化病变内的表型转变依赖于KLF4，如果那么，这些转变在病变发病机制中起什么作用呢。

与我们的假设一致，即KLF4调节表型动脉粥样硬化病变中SMC的转变，我们观察到大量YFP公司⁺喂食SMC的18周西方饮食中BCA病变内的细胞YFP公司^+/+ 阿波^−/−表达KLF4的小鼠(补充的图7a). 确定KLF4是否调节SMC表型转变和整体病变发病机制，我们跨越了SMCYFP公司^+/+ 阿波^−/−鼠标Klf4公司^{飞行高度层/飞行高度层}老鼠。我们观察到非常有效絮状物的重组Klf4公司等位基因(Klf4公司^Δ/Δ)三苯氧胺后处理(补充的图7b、c)包括我们估计接近100%的校正>40%非SMC时主动脉中SMC内的重组根据流式细胞术评估，这些样本中存在DNA(补充图。2亿). 经过18周的西方饮食喂养SMCYFP公司^+/+ Klf4公司^{重量/重量} 阿波^−/−和SMC YFP^+/+ Klf4公司^Δ/Δ Apoe公司^−/−老鼠(图4a)我们确定了损失属于Klf4公司仅在SMC中减少了近50%病变大小(图4b)和多种变化与斑块稳定性增加一致，包括a>纤维帽面积增加2倍(图。4c类)，ACTA2增加⁺中的单元格纤维帽(图4d)、和LGALS3数量减少⁺单元格(图4e).

在单独的窗口中打开

图4

SMC特定Klf4公司条件KO输入阿波^−/−喂食高脂肪食物的老鼠18周后，病变面积减小，斑块指数增加稳定性

SMC eYFP公司^+/+ Apoe公司^−/−老鼠杂交到Klf4公司^{飞行高度层/飞行高度层}给小鼠服用三苯氧胺分析前18周的西方饮食。(一)代表显示病变形态和细胞组成变化的图像。结果表明：(b条)病变总面积减少，(c（c）)纤维帽面积增加（定义为管腔表面30μm内的病变）病变(d日)增加的ACTA2⁺纤维内的细胞盖子(e（电子）)LGALS3分数总体下降⁺细胞，SMC衍生LGALS3的比例大幅下降⁺单元格（YFP⁺LGALS3型⁺), (（f）)增加ACTA2公司⁺病灶内的人群(克)减少SMC衍生细胞（YFP）的增殖⁺MKI67型⁺)、和(小时)总体细胞死亡减少，主要是由于SMC诱导的凋亡（YFP⁺CASP3公司⁺). *P（P）< 0.05, ¥P（P）=0.07，双向分析完成ANOVA比较基因分型和从BCA开始到Tukey的距离测试后，误差条基于S.E.M。量化基于以下分析五个71415μm²三个部分中的每个区域(d日-克)，或两个部分(h、 我)，根据小鼠跨越600μm长的BCA。比例尺=50μm。SMC公司YFP公司^+/+ Klf4公司^{重量/重量}Apoe公司^−/− n个=11，SMC YFP^+/+ Klf4公司^Δ/Δ阿波^−/− n个= 8.

SMC谱系追踪分析表明Klf4公司方案管理委员会内部没有导致方案管理委员会总数的变化（YFP⁺细胞）(补充图。第8页a)但导致SMC表型发生重大变化过渡。这包括类MSMC数量减少53%（YFP⁺LGALS3型⁺/YFP公司⁺)病变内部(图4e)，70%病变下基质中MSC样SMC的减少(补充图。8b个)但病变本身的MSC样SMC无变化(补充的图8c). 与这些结果一致，流式细胞术分析显示SMC衍生的MSC样细胞总数减少（YFP⁺SCA1公司⁺发动机⁺CDH5型⁻PTPRC公司⁻CD34型⁻)(补充的图8d)但MSC总人口没有变化(补充的图8e)或YFP总数⁺细胞(补充的图8f). SMC特定Klf4公司KO小鼠ACTA2总数增加⁺中的单元格纤维帽(图4d)、和病灶内(图4f)，但是减少SMC衍生细胞的增殖(图4g)YFP显著降低⁺SMC公司细胞凋亡(图4h). 这些这些变化与内侧区、管腔区的变化无关(补充图。8克)，YFP百分比⁺PDGFβR⁺SMC公司(补充的图8h)，或YFP⁺ACTA2公司⁺SMC公司(图4f). 在此外，我们没有观察到胆固醇或甘油三酯水平的变化(补充的图8i).

KLF4调节SMC公司

我们之前提供的证据表明Klf4公司是氧化磷脂处理诱导培养的SMC³⁶并抑制SMC标记基因通过多种机制，包括与G/C结合在大多数SMC标记基因启动子中发现的阻遏因子包括Acta2、Tagln和Myh11，并抑制SRF与CARG元素^16，37，38.确定类似机制是否有助于动脉粥样硬化病变中SMC标记基因的抑制在里面活泼地，我们对从BCA区提取的染色质阿波^−/−转基因小鼠含有要么是野生型胶转蛋白启动子驱动lacZ或胶转蛋白GC阻遏因子突变的启动子(胶转蛋白GC阻遏物突变体lacZ小鼠）。结果显示KLF4结合显著富集Acta2、Tagln、Myh11、和Cnn1号机组西方饮食喂养动物的内源性促进剂(图5a). 此外，我们发现KLF4与胶转蛋白发起人是取决于G/C阻遏因子(图。第5页)表明这种抑制是通过GC介导的阻遏物。最后，我们证明了KLF4与胶转蛋白个体表型调节SMC内的启动子（YFP⁺ACTA2公司⁻单元格）内阿波^−/−使用ISH-PLA的损伤(图5c). 拿总之，研究结果提供了令人信服的证据，可以协调抑制SMC标记基因的表达通过KLF4与SMC标记基因的启动子。

在单独的窗口中打开

图5

晚期动脉粥样硬化患者中KLF4与SMC内>800个基因结合损伤

(一)体内18份BCA的ChIP分析每周西方饮食喂养阿波^−/−老鼠与对照组相比，KLF4与SM标记基因启动子的结合增加阿波^−/−老鼠喂食食物。P（P）-值基于Tukey后验的单向方差分析。¥P（P）= 0.07, #P（P）= 0.11, *P（P）< 0.05. 误差条基于S.E.M。(b条)KLF4与胶转蛋白启动子对西方饮食治疗的反应依赖于GC阻遏物元素。阿波^−/−小鼠杂交到任一胶转蛋白野生型（WT）转基因或胶转蛋白G/C阻遏物突变转基因和KLF4 ChIP分析对从BCA区域提取的染色质进行检测。P（P）-值基于双向方差分析和Tukey后验。¥P（P）= 0.06,#P（P）= 0.43, *P（P）< 0.05. 误差线为基于S.E.M。n个=3个独立的集合组，每组5只小鼠治疗组。(c（c）)KLF4与G/C阻遏因子结合这个胶转蛋白发起人体内由确定Klf4公司-胶转蛋白ISH-pa。白色箭头指示KLF4绑定到胶转蛋白a的发起人分化SMC（顶部），而黄色箭头表示表型调制SMC（底部）。比例尺=10μm。(d日)主动脉从主动脉根部和主动脉弓到颈动脉分叉的节段从18周WD馈送的SMCKlf4公司^{重量/重量}电子YFP^+/+ 阿波^−/−(n个=14），SMCKlf4公司^Δ/Δ电子YFP^+/+ 阿波^−/−(n个=14），以及8周龄喂食SMCKlf4公司^{重量/重量}电子YFP^+/+ Apoe公司^−/−(n个=15）只小鼠用于KLF4结合靶点的ChIP-Seq分析。869个目标富含西方饮食处理的SMCKlf4公司^{重量/重量}电子YFP^+/+ 阿波^−/−小鼠与SMC的比较Klf4公司^Δ/Δ电子YFP^+/+ 阿波^−/−老鼠，因此代表推测SMC KLF4靶基因。

我们^21，23和其他^39-42已显示KLF4可以作为转录抑制因子或激活因子细胞类型和基因位点。更全面地定义KLF4的曲目我们对介导SMC表型转换的靶基因进行了KLF4 ChIP-seq我们SMC中BCA的染色质样品分析YFP公司^+/+ Klf4公司 ^{重量/重量} 阿波^−/−与SMC YFP相比^+/+ Klf4公司^Δ/Δ 阿波^−/−老鼠。这需要汇集每组14只小鼠的BCA样本，以获得足够的DNA。值得注意的是，结果显示869个KLF4靶基因(图。5天，补充表2)选择性富集在Klf4公司^{重量/重量}与Klf4公司^Δ/Δ 阿波^−/−西方饮食喂养的小鼠表明它们代表了对SMC选择性的假定KLF4靶基因。这个包括SMC标记基因学报2和胶转蛋白，从而验证了ChIP-Seq分析的准确性。此外，结果提供了基因调控途径中KLF4富集增强的证据可能在病变的发病机制中起重要作用，包括与吞噬、凋亡、细胞迁移和炎症(图5d，补充表2)，这可能有助于实现有利的总体效果的损失Klf4公司SMC内部的病变大小和发病机制。KLF4也绑定附近区域伊特格尔（CD11a），伊特加克斯（CD11b），伊特加姆（CD11c）(图5d，补充表2)、和精氨酸1（数据未显示）Klf4公司^{重量/重量}老鼠，但不是Klf4公司^Δ/Δ老鼠。我们还注意到459个KLF4目标Klf4公司^Δ/Δ 阿波^−/−不存在的样本在里面Klf4公司^{重量/重量} 阿波^−/−样品(补充图9，补充表3).

根据观察，SMC特定损失Klf4公司是与SMC衍生的M样细胞显著减少相关(图4f)，我们确定是否需要KLF4将培养的SMC转变为M-样状态在体外胆固醇负荷后¹².由于最近的争议关于从小鼠血管培养的SMC的来源和纯度^43，44，我们利用我们的SMC-lineage追踪小鼠进行收获8周龄他莫昔芬注射SMC YFP的SMC人群^+/+ 阿波^−/−老鼠。流式细胞术结果显示>98%YFP⁺单元格(补充图。10年)表明它们来源于成熟差异化SMC体内而不是干细胞来源被推测^43，44.胆固醇负荷培养的SMC导致拉加尔3(图6a)、和增加Klf4公司表达式(补充图。10亿)在源自SMC的主动脉SMC中被废除YFP公司^+/+ Klf4公司^Δ/Δ老鼠(图6a). 胆固醇负荷为也与KLF4依赖的吞噬作用增加有关(图6b、c). 最后，我们展示了胆固醇负荷导致促炎细胞因子MCP1、CXCR1、sTNFα、(补充图。10c-e型)，拉加尔3 (图6a)和MSC标记Sca1类和工程(补充图10f，克)，全部通过KLF4依赖机制。相反，尽管胆固醇负荷增加阿布卡1表达式this不依赖于KLF4(附图10h).

在单独的窗口中打开

图6

KLF4依赖激活拉加尔3、MSC标记和胆固醇负荷培养SMC的吞噬活性

(一-c（c）)主动脉平滑肌细胞是从平滑肌细胞中分离出来的YFP公司^+/+ Klf4公司 ^{重量/重量}和SMC YFP^+/+ Klf4公司^Δ/Δ鼠标并使用FACSVantage SE DIVA以确保SMC（YFP+）细胞群的纯度。(一)诱导拉加尔3mRNA表达胆固醇负荷（80μg/mL胆固醇72小时）在源自SMC YFP的细胞^+/+ Klf4公司^Δ/Δ与衍生细胞相比来自SMC YFP^+/+ Klf4公司 ^{重量/重量}老鼠。P（P）-基于双向方差分析的值Tukey后测试*P（P）< 0.05. 数据标准化为Klf4公司 ^{重量/重量}0 ug/mL胆固醇。基于S.E.M.的误差线。n个=3个独立实验。(b条-c（c）)Klf4公司^{重量/重量}和Klf4公司^Δ/Δ将细胞与胆固醇72小时后，0.8μm聚对苯二甲酸乙二醇珠1.5小时加载以诱导类M状态。然后在Amnis上分析细胞ImagestreamX Mark II评估YFP、LGALS3的表达，并识别珠子吸收。(b条)使用Amnis对珠子摄取量进行量化IDEAS软件。对总人口进行归一化后，值为经过Fisher的精确测试，表明Klf4公司^{重量/重量}YFP公司⁺LGALS3型⁺细胞中含有大量(P（P）<0.05）珠子比这个Klf4公司^Δ/ΔYFP公司⁺LGALS3型⁺细胞（代表性实验n个= 2). (c（c）)来自Amnis IDEAS软件，YFP（绿色），LGALS3（黄色），珠子（红色），暗场（品红色）。比例尺=5μm。

动脉粥样硬化斑块分析

石蜡包埋的头臂动脉（BCA）是连续的从主动脉弓到右锁骨下切成10μm厚的切片动脉。用于LGALS3的免疫荧光分析⁺中的SMC，BCA三个截面相距300μm，跨越新加坡建设局。用GFP抗体（Abcam ab6673）、ACTA2抗体（SigmaF3777）、LGALS3（雪松CL8942AP）、MKI67（Abcam ab15580）、CASP3（细胞信号9661S）、KLF4（研发系统AF3158）、MYH11（神谷生物医学MC-352公司）、PDGFβR（Abcam ab32570）和SCA1（Ly6A/E）（Abcamab51317）。使用蔡司LSM700共焦显微镜获得一系列8个z轴叠加图像厚度为1μm，用于进一步分析。五个14283微米²每个BCA的每个z堆栈中的位置是使用Zen 2009 Light Edition软件分析符合单个DAPI的免疫荧光染色⁺原子核到确定每个病变内的平均细胞数量。每架飞机z-stack用于评估细胞标记在单个单元格。管腔30μm范围内的病变区域使用Zen 2009 Light Edition Software确定的边界分析如下确定病变帽的细胞组成，即病变帽内的区域将该区域与动脉粥样硬化病变的整个区域进行比较确定帽面积/病变面积。病变大小的形态分析为使用ImagePro Plus完成，如Alexander et中所述铝⁶¹.研究人员对这些动物的基因型一无所知，直到研究结束分析。

免疫透射电子显微镜

18周WD馈送SMC YFP^+/+ 阿波^−/−小鼠被安乐死一氧化碳₂西餐治疗18周后窒息灌注用0.5%戊二醛固定（电子显微镜科学16300），1XPBS中4%的多聚甲醛（电子显微镜科学15700）。分离腕头动脉，将其冷冻在液氮中，然后送往弗吉尼亚大学高级显微镜核心进行处理。网格为用GFP抗体（Abcam ab6673）染色，然后用兔子抗羊次级共轭到10nm金珠（电子显微镜科学25229). 使用JEOL 1230透射电子显微镜拍摄图像配备超高分辨率拍摄摄像头。

流式细胞术

SMC YFP公司^+/+ 阿波^−/−小鼠被安乐死一氧化碳₂西方饮食治疗18周后出现窒息。老鼠然后从髂分叉处向主动脉灌注10mL PBS在从主动脉根部取出之前，轻轻清除主动脉根部的脂肪和筋膜动物。清洁后，将组织放入含有4U/mL Liberase TM（罗氏05401119001）、0.1mg/mL DNaseI和60U/mL透明质酸酶在RPMI-1640中。一旦浸泡在消化鸡尾酒中，组织就会被切割纵向切碎，置于37°C培养箱中1.5小时。将细胞穿过70μm的过滤器，并在500g下旋转5分钟。将细胞重新悬浮在红细胞溶解缓冲液（BD PharmLyse 555899）中两分钟后，用含血清的培养基灭活，再次旋转，并在200μL 1XPBS中重新悬浮。M⁄标记表达使用F4/80（eBioscience 17-4801）、PTPRC抗体鉴定SMC（电子生物学47-0451）、ITGAM（电子生物学45-0112）、DAPI（Invitrogen）、LGALS3（BioLegend 125405）和ITGAX（eBioscience 25-0114）。MSC（MSC）是使用PTPRC（eBioscience 12-0451-82）、CDH5的阴性门控进行识别（eBioscience 17-1441）和CD34（BioLegend 128611）；和ENG的正门控（电子生物学48-1051-82）和SCA1（电子生物学45-5981-82）。所有样本均已运行在配备405nm、488nm和633nm激光器。使用Becton Dickinson分离间充质干细胞流入细胞分类器。

人类标本

来自患者的未确认冠状动脉标本(n个=12）尸检时采集。这些标本是加工、固定在多聚甲醛中，石蜡嵌块被切割成5μm截面。冠状动脉标本来自一名男性患者从女性捐赠者那里得到了一颗心脏(n个= 1). 机构弗吉尼亚大学审查委员会批准使用所有尸检试样。

ISH-PLA公司

ISH-PLA如前所述执行⁵⁷简而言之，人类2011马来西亚令吉，鼠标我的11、和鼠标胶转蛋白探针是由Nick Translation（Roche）使用生物素14-dATP（Invitrogen）生成。生物素标记探针（40纳克/片）在杂交缓冲液中变性（2×SSC，50%高级甲酰胺，10%硫酸右旋糖酐，1μg人类或小鼠Cot-1 DNA）在80°C下放置5分钟。免疫染色后ACTA2（Sigma F3777），CD68（Santa Cruz sc20060 KP1克隆），载玻片脱水在乙醇系列中，在1mM EDTA（pH 8.0）中培养20分钟。然后在缓冲液（0.05M Tris，2mM CaCl2，0.01M EDTA，0.01M NaCl），37°C，持续20分钟，如前所述⁶².杂交混合物含有生物素标记探针或5-TAMRA-dUTP标记Y染色体探针（克隆RP11-88F4，Empire Genomics）应用于切片。章节为在80°C下孵育5分钟，然后在37°C。杂交后在2×SSC中进行多次洗涤，0.1%NP-40缓冲液。PLA是在ISH后按照制造商的说明（Olink）和前面描述的（自然方法参考）章节与小鼠H3K4dime（5μg/mL，克隆CMA303 Millipore）孵育兔生物素（5μg/mL，#ab53494，Abcam）抗体隔夜4°C。使用Duolink检测试剂盒进行PLA扩增橙色，555nm。最后，使用带有DAPI的安装介质覆盖幻灯片。使用装有Q成像复印机的奥林巴斯BX41采集图像2000R摄像头。使用Q Capture Pro软件进行图像采集（媒体控制论与QImaging Inc）。设置在开始时已修复采集和分析步骤都没有改变。亮度和对比度合并后进行了同等调整。用图像J进行图像分析。为了估计SMC衍生的M-样细胞的百分比CD68型⁺/解放军⁺CD68阳性染色区的细胞人类冠状动脉病变(n个= 12). 我们之前严格估计ISH-PLA方法在小鼠和人体组织中的效率达到65%⁵⁷因此CD68的百分比⁺/解放军⁺人体细胞计数考虑到ISH-PLA的不完全有效性，病变得到纠正。

ChIP分析

如前所述进行细胞培养ChIP⁶³用1%固定细胞多聚甲醛在室温下放置10分钟。交联染色质为超声处理将染色质剪切成200-600个碱基对的片段。这个剪切的染色质用2μg dimeH3K4免疫沉淀（克隆CMA303，Millipore）或KLF4（Santa Cruz sc20691），而阴性对照为用小鼠或兔IgG孵育。免疫复合物被磁性捕获珠偶联蛋白G（Millipore）。洗脱和纯化后基因组DNA（gDNA），在IP和非免疫沉淀上进行实时PCR输入gDNA。底漆组用于我的11，精氨酸1和Cox2公司之前描述过启动子^57，64结果表示为IP/INPT的百分比。体内使用快速冷冻法进行KLF4 ChIP分析喂食18周高脂肪食物或标准食物的小鼠的BCA（哈兰7012）如前所述，从8周龄开始^65，66.

KLF4染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）

主动脉从主动脉弓到主动脉根部直至从18周WD喂养的SMC中分离出颈动脉分叉Klf4公司^{重量/重量}电子青年党^+/+ 阿波^−/−(n个=14），SMCKlf4公司^Δ/Δ电子YFP^+/+ 阿波^−/−(n个=14），以及8周龄喂食SMCKlf4公司^{重量/重量}电子YFP^+/+ 阿波^−/−(n个=15）是在液氮中快速冷冻，然后按照ChIP方法进行处理KLF4装订部分。DNA文库制备和深度测序由哈德逊阿尔法生物技术研究所通过Illumina TruSeq芯片执行库套件符合制造商的协议。质量控制和使用安捷伦2100生物分析仪对DNA和文库进行定量和Kapa Library Quant Kit，符合制造商协议。

ChIP-seq数据处理

Illumina HiSeq的测序读数与小鼠对齐使用BOWTIE比对工具的基因组（mm10）⁶⁷。然后处理这些对齐的读取，并转换为bam/bai(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/bam.html)格式，以及然后加载到集成基因组查看器中(http://www.broadinstitute.org/igv/)用于可视化。这个处理步骤包括使用删除重复读取和格式转换SAM工具⁶⁸一套。这个读取也被转换为BED格式(http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat#format1)获取更多数据峰值呼叫等分析过程。使用MACS14进行峰值查找（参考。69)使用ChIP-seq BED文件作为输入，默认参数（P=1×10⁻⁵). 一旦获得了所有轨迹的峰值，这些轨迹之间的共同峰值和基因轨道已被BEDtools删除⁷⁰intersect命令。上述筛选步骤的结果理论上，导致KLF4中的信号与SMC内的基因结合。使用PANTHER执行功能注释⁷¹和基因本体联盟(http://geneontology.org/)使用PANTHER进行统计过度表征测试⁷¹.GEO加入编号{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE65812”，“term_id”：“65812“}}GSE65812标准.

细胞培养研究

从8周龄的小鼠主动脉平滑肌细胞中分离出原代鼠主动脉平滑肌使用先前的描述的协议⁷².单元格从SMC YFP中分离^+/+ Klf4公司^{重量/重量}和SMC YFP^+/+ Klf4公司^Δ/Δ小鼠被传代三次在对YFP+进行细胞选择性排序之前。胆固醇测定如前所述，使用Sigma（C4951-30MG）的水溶性胆固醇进行出版⁷³带有未成年人改性：在Gibco的DMEM-F12培养基中重组胆固醇包含；0.2%FBS（Gibco）；100 U/mL青霉素/链霉素（Gibco）；1.6毫摩尔/升我-谷氨酰胺（Gibco）。允许细胞生长至~70%转换为0、20、40或80μg/mL胆固醇之前的合流包含媒体。72小时后，收集细胞的mRNA、蛋白质或ChIP分析。人冠状动脉平滑肌细胞购自Lonza并在平滑肌细胞中培养维护媒体（Lonza）。RAW264.7小鼠Ms和人类单核细胞如前所述培养。

珠子吸收分析

用胆固醇治疗原代小鼠主动脉平滑肌细胞如上所述。72小时后，将细胞切换回含有1.5%v/v 0.84μm聚对苯二甲酸珠（Spherotech FP-0870-2）1.5小时。然后收集细胞，用LGALS3（BioLegend 125405）染色，并在Amnis ImageStreamX Mark II使用60X物镜。使用Amnis分析数据IDEAS软件。

间充质干细胞分化

从12周、18周的西方饮食喂养的SMC中分离细胞YFP公司^+/+ 阿波^−/−流中描述的小鼠细胞术切片。接下来，用标记物对细胞进行染色林⁻（CD34⁻生物传奇128611，PTPRC公司⁻电子生物科学56-0451-80，CDH5–电子生物科学17-1441-80); ENG（eBioscience 48-1051-82）和SCA1的正门控（电子生物科学45-5981-82）。YFP用天然荧光检测。细胞是然后分为四类（YFP⁺SCA1公司⁺发动机⁺，YFP公司⁻SCA1公司⁺发动机⁺，YFP公司⁺SCA1公司⁻发动机⁻、和YFP公司⁻SCA1公司⁻发动机⁻)使用Becton Dickinson流入细胞分类器。然后将细胞置于StemXVivo MSC中培养基（研发系统CCM004）培养基，密度为30000个细胞/mm²并以70%的合流率通过（每2-3天更换一次培养基）。YFP公司⁺、SCA1⁺，发动机⁺细胞为p2分化实验和YFP⁻、SCA1⁺，发动机⁺分化开始时细胞为p4实验。使用研发团队提供的试剂盒进行分化实验系统（小鼠间充质干细胞功能分化试剂盒，SC010）。细胞在适当的培养基中分化14天（更换培养基每隔2–3天），然后利用抗体进行固定和免疫细胞化学根据提供的协议执行。

我们要感谢技术人员M.McCanna和M.Bevard协助组织学切割和染色，R.Tripathi协助协助细胞培养工作；J.Lannigan和M.Solga来自流式细胞术UVA核心团队帮助设计流式细胞仪面板，并帮助运行细胞仪；UVA高级显微镜设备的S.Guilot感谢她的帮助负责TEM的J.Roithmayr、N.Hendley、M.Quetsch和M.Goodwin协助免疫荧光图像分析；Y.Babiy设计卡通在里面补充图6，和W.Evans，协助处理统计分析。我们也想感谢弗吉尼亚大学医院病理学系的N.McGinn对于未经鉴定的冠状动脉标本华盛顿为冠状动脉心脏移植标本，来自马克斯·普朗克研究所⁵⁴对于我的11-CreER公司^T2段老鼠，凯斯特纳Klf4公司^{飞行高度层/飞行高度层}（参考。47)小鼠，G.Randolph代表LysM公司^克/克小鼠，以及荷兰阿姆斯特丹荷兰癌症研究所的A.Berns转基因他莫昔芬诱导Cre（ERT-Cre）重组酶小鼠⁵⁵这项工作得到了美国的支持国家卫生研究院R01将HL057353、HL098538和HL087867授予G.K.O。，HL112904给ACS，以及阿斯利康制药的试点拨款弗吉尼亚大学阿斯利康研究联盟；和大西洋中部美国心脏协会奖学金授予11PRE7170008和13POST17080043L.S.S.和D.G。