Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach

doi:10.1074/mcp.M111.008128

.2011年8月；10（8）：M111.008128。

doi:10.1074/mcp。M111.008128。 Epub 2011年5月18日。

人类腹主动脉瘤细胞外基质组成和重塑：蛋白质组学方法

阿萨纳西奥斯·迪丹杰洛斯¹, 尹晓科, 考希克·曼达尔, 安吉丽卡·萨耶, 阿尔贝托·史密斯, 徐庆波, 马尔扬·贾汉吉里, 曼努埃尔·迈尔

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人类腹主动脉瘤细胞外基质组成和重塑：蛋白质组学方法

阿萨纳西奥斯·迪丹杰洛斯等。分子细胞蛋白质组学. 2011年8月.

.2011年8月；10（8）：M111.008128。

doi:10.1074/mcp。M111.008128。 Epub 2011年5月18日。

作者

阿萨纳西奥斯·迪丹杰洛斯¹, 尹晓科, 考希克·曼达尔, 安吉丽卡·萨耶, 阿尔贝托·史密斯, 徐庆波, 马尔扬·贾汉吉里, 曼努埃尔·迈尔

附属

¹英国伦敦国王学院国王英国心脏基金会中心。

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内政部： 10.1074/mcp。2008年11月28日

摘要

腹主动脉瘤（AAA）的特征是主动脉细胞外基质（ECM）的病理重塑。然而，除了特征明确的弹性溶解和胶原酶溶解外，对其他ECM蛋白的变化知之甚少。先前关于AAA的蛋白质组学研究集中在细胞变化上，而没有强调ECM。在本研究中，使用基于溶解性的亚分馏方法从动脉瘤和对照主动脉中选择性提取ECM蛋白及其降解产物，并通过凝胶液相色谱串联质谱和无标签定量分析。蛋白质组学分析显示AAA的ECM发生了新的变化，包括XII型胶原、血小板反应蛋白2、主动脉羧肽酶样蛋白、骨膜炎素、纤维连接蛋白和tenascin的表达增加和降解。蛋白质组学也证实了巨噬细胞金属弹性蛋白酶（MMP-12）的积累。用重组MMP-12孵育对照主动脉组织导致这些糖蛋白的广泛裂解，其中大多数是MMP-12的新底物。总之，我们的蛋白质组学方法首次对AAA中的ECM进行了详细分析，并确定了与MMP-12活性相关的病理性ECM重塑标记物。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**临床标本的特征。**AAA的代表部分(A类)和控制主动脉(B类)用苏木精和伊红以及单核细胞/巨噬细胞标记物CD68抗体染色(C). 免疫反应呈棕色，细胞核用迈耶苏木精复染。比例尺，5x:100μm和20x:25μm。天在AAA的细胞提取物（0.08%SDS）中，平滑肌肌动蛋白（SMA）与CD68呈负相关。

**图2。**
**蛋白质组学工作流程。**该方法基于血管蛋白质组的三步亚分馏(A类)丰富ECM及其相关蛋白质和降解产物。首先，将样本提取为0.5米氯化钠。该缓冲液溶解与ECM弱结合的蛋白质或蛋白质片段，包括新合成的ECM蛋白质和降解产物。此外，还提取了MMPs等分泌性蛋白酶。其次，用0.08%的十二烷基硫酸钠对标本进行脱细胞处理，以耗尽细胞蛋白质。最后，用4米胍溶解紧密相互作用的交联基质。第二阶段(B类)通过将健康组织与重组酶孵育，进一步研究已鉴定的基质金属蛋白酶，以确定新的蛋白水解靶点并表征其在疾病中的蛋白水解活性。

**图3。**
**细胞外蛋白的溶解度差异。** A类，维恩图显示了用0.5提取的ECM和相关蛋白质的数量米氯化钠或4米胍。每个提取物都有唯一识别的蛋白质的SwissProt输入代码。表一和表二列出了所有标识。B类，在0.5中米与对照主动脉（CON）相比，AAA样品中氯化钠提取物的ECM蛋白光谱计数显著增加。已识别光谱的总数相似。C，在4中米胍提取物对ECM蛋白的光谱计数和总光谱数在对照组和AAA组之间均无显著差异。数值为平均值±S.E***第页≤*0.001.*使用双尾、非配对进行统计分析t吨测试。

**图4。**
**细胞外蛋白的层次聚类。**树状图显示了0.5米氯化钠提取物(A类)和在4中米胍提取物(B类). “R”表示使用RePlay设备为每个临床样本获得的技术复制。如图所示，对光谱计数差异进行彩色编码。

**图5。**
**ECM重塑标记物的验证。**光谱计数(左边胶原XII、tenascin、血小板反应蛋白2、纤维连接蛋白和ACLP（别名：脂肪细胞增强结合蛋白1；AEBP-1）在0.5米与对照组相比，AAA的氯化钠提取物。数值为平均值±S.E***第页≤*0.001*, **第页≤*0.01*, **第页≤*0.05*，纳秒*不重要*使用双尾非配对进行统计分析t吨测试。免疫印迹(*中间的*小组）证实了AAA中这些ECM蛋白的水平增加以及片段化。免疫印迹法也证实了AAA中eSOD的丢失以及MMP-12和TIMP-1的积累。箭头表示全长蛋白质的预期分子量。除骨膜炎和MMP-12外，两者之间存在高度相关性（Spearman相关性第页≥*0.8磅*≤*0.05*)通过光谱计数和蛋白质印迹测定蛋白质丰度(*正确的*面板）。

**图6。**
**新型MMP-12靶点。** A类，彩色热图显示了0中6种糖蛋白的识别光谱数量。5米对照和AAA样品中的NaCl提取物及其SDS-PAGE后的分子量分布。B类，将一个正常主动脉标本切割成三个相等的块，并用50p米MMP-9，50便士米MMP-12，或在37°C的MMP反应缓冲液中未经处理（CON）24小时。通过免疫印迹法分析产生的上清液中的胶原蛋白XII、tenascin、血小板反应蛋白2（TSP2）、纤维连接蛋白、ACLP和骨膜炎素。箭头表示MMP-12处理产生的蛋白水解片段。C将10μg人纯化纤维连接蛋白和10μg重组人骨膜蛋白和TSP2在37°C的普通MMP反应缓冲液中培养16小时或补充50 p米MMP-12（+MMP-12）。蛋白质混合物通过一维SDS-PAGE分离，并在0.05%w/v Coomasie G-250，5%v/v冰醋酸溶液中染色，以监测底物降解。

**图7。**
**ACLP和MMP-12的免疫组织化学染色。**连续的AAA组织连续切片用ACLP抗体染色(A类和B类)或MMP-12(C和天). ACLP发现于两个具有剩余弹性层的亚细胞区域(A类)以及有结缔组织破坏迹象的介质无定形炎症区域(B类). MMP-12主要存在于炎症区域(天). 用二氨基联苯胺（DAB）产生辣根过氧化物酶结合二级抗体，显示出棕色，表明免疫染色阳性。阴性对照用同型对照抗体孵育(E类和F类). 用迈尔苏木精对细胞核进行复染。放大20倍。比例尺：25μm。

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