Conditional and targeted overexpression of vascular chymase causes hypertension in transgenic mice

doi:10.1073/pnas.131147598

.2001年6月19日；98(13):7469-74.

doi:10.1073/pnas.131147598。

血管糜蛋白酶的条件性和靶向过度表达导致转基因小鼠高血压

H Ju公司¹, R Gros公司, X你, S Tsang先生, M Husain先生, M拉比诺维奇

附属公司

PMID： 11416217
预防性维修识别码：项目经理34692
内政部： 10.1073/pnas.131147598

血管糜蛋白酶的条件性和靶向过度表达导致转基因小鼠高血压

H Ju公司等。美国国家科学院程序. 2001.

.2001年6月19日；98(13):7469-74.

doi:10.1073/pnas.131147598。

作者

H Ju公司¹, R Gros公司, X你, S Tsang先生, M Husain先生, M拉比诺维奇

附属

¹加拿大安大略省多伦多市多伦多大学多伦多医院心血管研究中心病童医院研究所心血管研究科M5G 1X8。

PMID： 11416217
预防性维修识别码：项目经理34692
内政部： 10.1073/pnas.131147598

摘要

我们从平滑肌细胞（SMC）克隆了一种大鼠血管糜酶（RVCH），该酶将血管紧张素I转换为II，并且在自发性高血压大鼠与正常血压大鼠的SMC中上调。为了确定RVCH活性的增加是否足以导致高血压，使用四环素控制的反式激活剂（tTA），利用RVCH对SMC的靶向条件表达制备转基因小鼠。我们通过mRNA、蛋白质和乳糜酶活性证实了在无多西环素的情况下（但不存在）RVCH的条件表达。在10-12周龄时，通过颈动脉插管测量的tTA+/RVCH+小鼠的收缩压（mmHg）高于非二元转基因同窝小鼠（136+/-4对109+/-3）（P<0.05），舒张压和平均压也是如此。强力霉素可完全逆转高血压，提示与糜蛋白酶表达存在因果关系。tTA+/RVCH+小鼠与同窝鼠肠系膜动脉内侧增厚（0.82+/-0.1 vs.0.42+/-0.02）（P<0.05）与使用增殖细胞核抗原抗体的阳性免疫反应判断的SMC增殖增加有关。这些结构变化被强力霉素阻止。tTA+/RVCH+小鼠肠系膜动脉的灌注肌电图也显示，与窝友对照组或多西林治疗组相比，苯肾上腺素引起的血管收缩增加，异丙胆碱诱导的血管扩张受损。我们的研究表明，这种血管糜蛋白酶的上调足以导致高血压动脉病，RVCH可能是高血压患者的候选基因和治疗靶点。

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图1
为了记录转基因小鼠SMC中RVCH的条件和靶向表达，我们使用Tet-Off二进制系统。制作了一种转基因小鼠系，其中RVCH-HA构建物由一个复合启动子（TRE-PminCMV）控制，该启动子沉默，不与四环素反式激活子（tTA）结合。在动脉SMC特异性启动子SM22α的控制下，设计第二个转基因小鼠系来表达tTA。当这两个品系繁殖时，产生了双转基因小鼠tTA+/RVCH+，其中RVCH仅在动脉SMC中表达。为了有条件地关闭RVCH的表达，在饮用水中给小鼠注射改变tTA构象的多西林。

图2
RVCH的条件性和靶向表达。(A类)通过RT-PCR评估RVCH的靶向表达，如*材料和方法*RVCH mRNA主要在tTA+/RVCH+小鼠的主动脉（AO）中发现，而在同窝对照的AO中未发现。RVCH mRNA低于心脏（HT）、肺（LU）、肾（KD）、膀胱（BL）、肠（IT）和胃（ST）的检测水平。(B类)为了确认转基因小鼠中RVCH的条件表达，我们使用RT-PCR显示，在饮用水中喂养转基因小鼠强力霉素（Dox）（200μg/ml）1周后，RVCH mRNA表达受到抑制。(C类)每组共收集10条主动脉，使用抗HA标记RVCH的高亲和力鼠单克隆抗体进行免疫沉淀。在tTA+/RVCH+小鼠中检测到RVCH蛋白，但在tTA−/RVCH+小鼠中未检测到。在Dox处理的tTA+/RVCH+小鼠中，RVCH的表达被完全消除。

图3
SMC中RVCH酶活性的条件调节。使用特定的荧光底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7-氨基-4-甲基香豆素来测量乳糜酶活性。与同窝对照组（tTA−/RVCH+）相比，来自乳糜蛋白酶过度表达小鼠（tTA+/RVCH+）的SMC中的乳糜酸酶活性显著升高。强力霉素（Dox）（200μg/ml）完全逆转了tTA+/RVCH+小鼠糜酶活性的增加，而对tTA-/RVCH+小鼠SMC糜酶的活性没有影响。数据描述为六个独立实验的平均值±SEM。*，*P（P）*与所有其他组相比<0.05。

图4
在10-12周龄转基因小鼠右颈动脉使用Millar导管插管测量血压（mmHg）。收缩压显示为开杆，舒张压显示为实心杆，平均动脉压显示为条纹杆。tTA+/RVCH+组的所有三个数值均高于对照窝友。在6~12周龄的饮用水中以200μg/ml的剂量给予强力霉素（Dox）的tTA+/RVCH+小鼠亚组中，其值与对照鼠±Dox的值无明显区别。数值描述为8–20个独立实验的平均值±SEM。*，*P（P）*与所有其他组相比<0.05。

图5
10至12周龄小鼠肠系膜动脉内侧增厚。(A类)代表性的Movat五色染色显示tTA+/RVCH+小鼠肠系膜动脉中层增厚。(一)tTA−/RVCH+；(b条)tTA+/RVCH+；(*c（c）*)tTA−/RVCH+与强力霉素（Dox）；。(d日)tTA+/RVCH+带Dox。(B类)中腔比定量显示，与同窝对照组相比，糜蛋白酶过度表达的小鼠肠系膜动脉增加了93%。通过在6-10周龄的小鼠饮用水中以200μg/ml的剂量给高表达糜蛋白酶的小鼠喂食Dox，可以完全防止肠系膜动脉的内侧增厚。Dox对室友对照组的中腔比没有影响。数据描述为8-10个独立实验的平均值±SEM。*，*P（P）*与所有其他组相比<0.05。

图6
用抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体进行免疫组织化学染色。(一)tTA−/RVCH+。(b条)tTA+/RVCH+。(*c（c）*)tTA−/RVCH+与强力霉素（Dox）。(d日)tTA+/RVCH+带Dox。我们在糜蛋白酶过度表达小鼠（tTA+/RVCH+）肠系膜动脉的中层发现大量PCNA阳性细胞（箭头所示），而在对照组的室友中，或在6–12周大的Dox后的任何一组中，PCNA阳性都很少见。

图7
苯肾上腺素诱导转基因小鼠肠系膜动脉收缩。在tTA−/RVCH+小鼠中观察到剂量依赖性苯肾上腺素诱导的血管收缩。在糜蛋白酶过度表达小鼠（tTA+/RVCH+）中观察到对苯肾上腺素的反应性增强，并通过强力霉素（Dox）治疗（200μg/ml）完全阻止。数据描述为4-5个独立实验的平均值±SEM。*，*P（P）*与所有其他组相比<0.05。

图8
在转基因小鼠中，去甲胆碱介导的苯肾上腺素预狭窄肠系膜动脉舒张。对照tTA−/RVCH+小鼠肠系膜动脉中的甲胆碱诱导的剂量依赖性舒张。与窝友对照组相比，在糜蛋白酶过度表达小鼠（tTA+/RVCH+）肠系膜动脉中观察到血管扩张受损。多西环素（Dox）（200μg/ml）完全消除了tTA+/RVCH+小鼠受损的血管舒张反应。数据描述为3-5个独立实验的平均值±SEM。*，*P（P）*<0.05和**，*P（P）*与所有其他组相比<0.001。

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