胶原蛋白几乎占我们身体所有蛋白质的30%(1). 在29种胶原类型中，IV型胶原是基底膜的主要和关键成分(2). 不同类型的胶原蛋白聚集成不同的结构。这些结构的例子包括原纤维（I型、II型和III型胶原）和网络（IV型和VI型胶原）(1). 胶原蛋白链的适当翻译后修饰对最终四元结构的形成和功能至关重要。胶原蛋白的翻译后修饰包括脯氨酰4-羟基化、赖氨酰羟基化和糖基化以及脯氨酰基3-羟基化(三). 脯氨酰3-羟化酶家族（P3H1、P3H2和P3H3）负责脯氨酰3-羟基化的过程。这些酶将GlyProHyp[Hyp是4（R）-羟脯氨酸]序列中的特异性脯氨酸修饰为3（S）-羟脯氨酸（3Hyp）(4). 虽然脯氨酸4-羟基化几乎发生在Gly-Xaa-Yaa胶原重复序列中的每个Yaa位置脯氨酸，但脯氨酸3-羟基化仅发生在少数特定的Xaa位置脯氨酸。
P3H1是修饰I型胶原蛋白的主要酶。已发现P3H1突变可导致人类和小鼠严重成骨不全（OI）(5，6). OI表型的致病分子机制尚不明确。关于P3H2和P3H3家族成员的底物特异性的信息有限。尽管细胞培养研究表明P3H2对形成纤维的胶原蛋白有一定的活性(7)，IV型胶原被认为是该酶的主要底物(8).
IV型胶原蛋白的3-羟基化数量最高，大约每1000个氨基酸中有6到16个3Hyps。然而，之前在特定序列中只发现了两个位点(9). 这种胶原蛋白在小鼠胚胎发育的早期就出现了。植入时已在基底膜中检测到(10). 外胎盘锥体的基底膜形成滋养层细胞被母体血液浸润。因此，胚胎IV型胶原蛋白在胚胎第6天左右与母血直接接触(11). 缺乏IV型胶原α1-和α2-链的小鼠在E10.5和E11.5之间具有胚胎致死性。它们以预期的孟德尔比率发展到E9.5，表明IV型胶原蛋白在早期发育过程中不是必需的，但对基底膜的稳定性至关重要(12). 即使是缺乏脯氨酰4-羟化酶的小鼠也会发育到E9.5，这表明发育到这个阶段通常不需要胶原蛋白(13).
内皮下胶原（I型和III型）与血小板的相互作用通过在血管损伤时引发血栓形成，在维持止血方面发挥着核心作用。血小板特异性糖蛋白VI（GPVI）是通过与这些胶原蛋白结合而启动血小板聚集的主要因素(14). 已经证明GPVI与重复（GlyProHyp）结合n个胶原蛋白序列(15). 胶原蛋白相关肽（CRP）也显示与GPVI相互作用并启动血小板聚集(16). 然而，血小板不会与基底膜发生强烈反应(17). 尽管存在大量（GlyProHyp）n个在IV型胶原序列中重复，这种胶原类型不会引起显著的血小板聚集(17).
本文使用P3H2 KO小鼠模型研究了P3H2的作用和3Hyps在IV型胶原中的功能。
结果
P3H2-Null小鼠的生产。
显示了针对P3H2-null小鼠生产的Leprel1基因的靶向破坏设计。在129xC57BL混合背景中含有杂合Leprel1基因座的小鼠没有明显的表型，繁殖正常。然而，没有因P3H2而出生的空白小鼠+/−/第3H2页+/−育种。为了确定胚胎在什么发育年龄死亡，在不同阶段杀死了怀孕的杂合子雌性。在研究的任何阶段，均未观察到纯合P3H2-null小鼠的预期孟德尔比率(). 因此，大多数P3H2-null小鼠在E8.5之前是胚胎致死小鼠。
P3H2-全部生产的目标载体。图示了跨越15个外显子的小鼠Leprel1基因。在该基因的第2外显子中进行了含有新资产（NEO）的靶向破坏。将跨越外显子2（内含子1-2的一部分）和大部分内含子2-3的9-kb Bsa1限制性片段亚克隆到p26载体中，并使用AvaI限制性位点在外显子2中克隆新盒。
表1。
| 阶段 | 垃圾数量 | 幼崽/胚胎数量 | 第3H2页+/+ | 第3H2页+/− | 第3H2页−/− |
| 第21页 | 15 | 120 | 38 | 82 | 0 |
| 图13.5 | 2 | 15 | 5 | 10 | 0 |
| 图12.5 | 2 | 16 | 5 | 11 | 0 |
| 图11.5 | 4 | 24 | 7 | 15 | 2* |
| 公式9.5 | 5 | 31 | 9 | 21 | 1† |
| E8.5段 | 4 | 27 | 10 | 16 | 1† |
考虑到当IV型胶原蛋白的两条α链都被消融时，胚胎仍然至少存活到E9.5，这一结果非常令人惊讶(12). 虽然P3H2缺乏的胚胎可能缺乏IV型胶原蛋白序列中的3Hyps，但该蛋白仍然存在。为什么蛋白质翻译后修饰的缺失会比蛋白质本身的缺失造成更大的影响？
母体血小板聚集对早期发育的P3H2的反应−/−胚胎。
怀孕6.5天时，一些胚胎附近出现血块()表明母体血液对这些胚胎的反应异常凝固。母体血栓的形成可能是由胚胎IV型胶原改变引起的。为了研究这一点，我们对三个杂合杂交后代的全蜕膜进行了切片和分析。典型的未染色蜕膜切片如所示P3H2 KO胚胎周围的母体组织中有明显的血栓形成(). 赖特染色法用于观察聚集在空胚外胎盘锥周围的母血小板(). 此外，对血小板特异性GPVI进行了免疫荧光染色，并证实了与突变胚胎相关的母体血小板聚集。因此，在每个分析的凋落物中，形态正常的P3H2−/−发现母体血小板聚集物包围的胚胎(和). 携带WT或杂合胚胎的蜕膜中没有血小板聚集(和). IV型胶原在正常胚胎和突变胚胎中的存在在因此，P3H2−/−大约在母体血液渗入胚胎的时间E6.5，即母体血液血栓形成时，胚胎被破坏(11).
P3H2 KO和受孕后6.5天的正常窝友。(A类和B类)E6.5分离胚胎。两个胚胎在形态上都正常。箭头指向母体血液附近的胚胎。图中胚胎附近有一块血块B类正常和P3H2-全E6蜕膜的代表性切片未染色(C类和D类)染上了莱特的污渍(E类和如果). 箭头表示母体血液侵入外胎盘锥体。在突变胚胎（E）旁边观察到血栓形成D类和如果.Wright染色显示母体血小板呈紫色(如果，箭头）。请注意，红细胞呈现橙色到粉红色，很难与紫色血小板区分开来。（比例尺：A类和B类，200微米；C类–如果，100μm）
早期胚胎的免疫荧光分析。妊娠后7天蜕膜切片中，母体血小板聚集在P3H2-全胚胎周围(B类)与正常胚胎周围无血小板聚集相比(A类). 在这两幅图像中，母亲的血小板都用红色的抗GPVI抗体进行了免疫标记(C类和D类)在E6（绿色），P3H2-完整胚胎和对照胚胎中均存在IV型胶原蛋白。colIV，IV型胶原蛋白。(E类和如果)组织覆盖实验的结果。重组GPVI（gpVICBD）与E6蜕膜切片孵育，然后用抗His-tag抗体检测。只有与P3H2结合的重组蛋白-含有基底膜的全胚胎IV型胶原在如果（红色染色）。正常胚胎IV型胶原与GPVI不相互作用，导致基底膜无染色E类用DAPI染色（蓝色）显示细胞核。（比例尺：100μm）
IV型胶原中3Hyps的鉴定。
为了确定IV型胶原中脯氨酰3-羟基化的程度，对牛晶状体囊IV型胶原α1-链的溴化氰（CNBr）肽进行了测序，并确定了6个3Hyp残基的序列位置以及之前已知的两个位点。有趣的是，发现了两组重复的含3Hyp的三肽单元，这在内皮下胶原中是没有观察到的(). 因此，（GlyProHyp）中脯氨酸的重复3-羟基化n个IV型胶原的序列将其与原纤维胶原区分开来。
IV型胶原中3-羟基脯氨酸的鉴定。描述了牛晶状体囊IV型胶原α1-链的CNBr肽的氨基酸序列。下划线序列对应于通过N末端（Edman）测序得到的CNBr肽的蛋白水解肽。粗体P表示之前发布的3-Hyps，也由我们测序。红色粗体P表明之前通过测序确定的未知3-Hyp。花括号表示除测序外，还经MS确认的3-Hyps。常规括号表示仅由MS识别的3-或4-羟脯氨酸。
假设。
IV型胶原不会引起显著的血小板聚集，而纤维型胶原会引起血小板聚集(18). 是（GlyProHyp）的重复3-羟基化n个IV型胶原中的序列需要避免GPVI的结合和随后的血小板聚集，以响应IV型胶原？如果是，P3H2−/−胚胎中IV型胶原中不含3Hyps，将启动母血小板的聚集。
3-羟基化消融GPVI的结合并防止血小板聚集。
比较了GPVI单体胶原蛋白结合域（gpVICBD）与I型和IV型胶原蛋白的相互作用(). 先前的研究发现，GPVI对IV型胶原的亲和力较弱，这归因于I型胶原的污染(18). 牛晶状体囊不含I型胶原；因此，在这些实验中，该组织被用于纯化IV型胶原蛋白。显示了表面等离子体共振（SPR）实验，该实验表明gpVICBD与I型胶原结合，但不与IV型胶原结合。这表明GPVI在正常情况下不会与IV型胶原相互作用。
血小板聚集试验证明gpVICBD与I型和IV型胶原及CRP的结合。(A类)0.1 mg/mL gpVICBD与固定在Biacore芯片表面的I型和IV型胶原蛋白的相互作用。I型胶原检测到低亲和力相互作用，但IV型胶原未观察到结合。RU，响应单元。(B类)gpVICBD与表面固定化（GlyProHyp）的相互作用9和（Gly3HypHyp）9肽。3-羟基化肽未观察到结合。(C类)人类富含血小板的血浆聚集物对不同激动剂的反应。监测溶液的浊度。使用了以下激动剂：浓度为50μg/mL的I型胶原蛋白（对照）和胶原蛋白样肽（GlyProHyp）10和（Gly3HypHyp）10浓度为200μg/mL。3-羟基化肽不会启动血小板聚集。
确定GPVI是否绑定到（GlyProHyp）n个肽受Pro改性为3Hyp的影响，测量了相应的Biacore（Biacore-Life Sciences，GE Healthcare）结合曲线。显示gpVICBD与（GlyProHyp）的绑定9肽。不与（Gly3HypHyp）结合9检测到肽。
血小板聚集分析()证明（Gly3HypHyp）10肽不能诱导可检测的血小板聚集，而（GlyProHyp）10工作得相当好。因此，3-羟基化可防止GPVI和CRP结合，并消除血小板聚集。
使用组织覆盖试验证明GPVI与P3H2-全胚胎中的非3-羟基IV型胶原结合。重组GPVI（与用于Biacore测量和血小板聚集分析的GPVI相同）与组织切片孵育，然后遵循标准免疫荧光方案。表示此实验的结果。如果P3H-缺失胚胎（红色，)而对照组中未观察到染色().
P3H2/GPVI双KO小鼠可以存活。
生化和组织学数据有力地支持了这一假设。为了获得体内概念验证，生成了P3H2/GPVI双KO小鼠。GPVI缺陷小鼠之前的特征是没有胶原蛋白诱导的血小板聚集，但在其他方面没有表现出表型(19). 为了确定P3H2/GPVI双KO小鼠是否比P3H2-nulls存活更长时间，我们培育了P3H2杂合和GPVI纯合的小鼠。引人注目的是，P3H2/GPVI双KO出生时具有预期的孟德尔比率，存活至成年，并且能够繁殖(). P3H2无明显表型−/−/全球产品虚拟指数−/−观察小鼠。
表2。
| 发育阶段 | 垃圾数量 | 小鼠数量 | WT（重量） | P3H2杂合小鼠 | P3H2纯合小鼠 |
| 第21页 | 7 | 51 | 14 | 26 | 11 |
GPVI直接与组织中的非3-羟基IV型胶原结合。
如所示，gpVICBD与改变的胚胎IV型胶原结合。为了证明在成人组织中的这种相互作用，用gpVICBD预孵育双核和对照眼切片，然后采用标准的免疫荧光标记方案(). 由于本实验中使用的小鼠是GPVI中的纯合null，因此唯一的抗体识别位点由外源性预结合gpVICBD表示。证明重组GPVI与P3H2结合−/−/全球产品虚拟指数−/−角膜基底膜，而P3H2中没有这种结合+/+/全球产品虚拟指数−/−控制部分。因此，重复的脯氨酰3-羟基化可在体内外阻止GPVI与胶原蛋白的结合。
重组GPVI与P3H2/GPVI双缺失小鼠眼角膜中的基底膜结合。(A类)用抗GPVI抗体对小鼠眼切片进行免疫荧光染色。在应用标准免疫染色方案之前，用重组GPVI（gpVICBD）对切片进行预培养。注意双突变体基底膜的特殊染色。对照组未见基底膜特异性染色。(B类)类似切片对IV型胶原的免疫染色。所有图像都是在相同的设置下采集的。（比例尺：20μm）
缺乏母亲GPVI时GPVI-阳性胚胎的命运。
在正常小鼠发育过程中，血小板首先由E10.5出现(20). 如果孕妇而非胎儿的血小板缺乏GPVI，可以合理地预计，胚胎内部血栓形成将发生在胎儿产生自身血细胞的发育后期。双P3H2/GPVI阴性雌性小鼠与携带WT-GPVI的P3H2杂合雄性小鼠交配。由此产生的后代在GPVI中是杂合的，其中一半在P3H2中预计为空。在两个分析的幼崽中，出生时未发现P3H2-缺失小鼠，表明P3H2−/−/全球产品虚拟指数+/−表型为胚胎致死。两名怀孕女性在E8.5死亡。正如预期的那样，这些幼崽中大约一半的胚胎（八个胚胎中的四个，七个胚胎中三个）是P3H2−/−/GPVI公司+/−P3H2-完整胚胎的形态和发育正常。因此，如果母体GPVI不存在，携带杂合子GPVI的P3H2-完整胚胎至少存活到E8.5，但直到出生才存活。需要对发育后期的胚胎进行进一步详细分析，以确定这种胚胎致死的原因和时间点。
讨论
总之，P3H2缺乏导致小鼠早期（约E6.5）胚胎死亡。非3-羟基化IV型胶原蛋白通过母体血液血栓形成破坏P3H2-完整胚胎。已知两种受体负责胶原蛋白诱导的血小板聚集的启动：GPVI和整合素α2β1.尽管整合素α2β1可能与P3H2-完整胚胎的致死性有关，其已知的结合位点不涉及Gly-Pro-Hyp序列，并且结合序列远离IV型胶原中的3-羟脯氨酸(21). 本文中的数据，特别是双P3H2/GPVI KO的拯救，清楚地表明血栓的形成是由未修饰的IV型胶原（GlyProHyp）的相互作用引起的n个血小板特异性GPVI序列。这种先前公认的相互作用在内皮下胶原引起的凝血反应中起着重要作用(15). 内皮下胶原蛋白通常不会暴露于血液中，除非发生损伤。IV型胶原蛋白的情况不同。几乎每个组织都有基底膜。胚胎基膜在发育过程中很早就与母体血液接触。IV型胶原蛋白中的脯氨酸3-羟基化保护其免受与GPVI的相互作用，从而削弱该胶原蛋白类型启动血小板聚集的能力。这确定了胶原蛋白中脯氨酰3-羟基的直接分子功能和重要生物作用。
暗示小鼠和人类胚胎发育的相似性，3-羟基化也可能是人类IV型胶原蛋白的需求。然而，最近在一个以色列贝都因血缘关系密切的大家族中发现了P3H2失活突变，并发现该突变可引起高度近视(22). 显然，这些个体存活到成年，并逃脱了本文所述的胚胎致死机制。对于小鼠和人类之间的这种差异没有简单的解释，但目前对GPVI多态性的了解允许一些猜测。已确定健康个体中GPVI的许多多态性变异(23–25). GPVI有两个常见的等位基因（“a”和“b”），不同于五种氨基酸，出现频率分别为0.85和0.13(26). b等位基因纯合的个体血小板表面GPVI密度较低，胶原蛋白导致的血栓形成性降低(26，27). 因此，上述P3H2突变的家族可能携带GPVI的低频b等位基因，这使他们能够逃避母亲对非3-羟基IV型胶原的血小板聚集反应。
最近，其他GPVI多态性与某些胎儿损失病例中的血小板高聚集性相关(28). 在原因不明的反复妊娠损失中，通常在母体/胎儿界面观察到血栓形成(29). 胚胎IV型胶原的不完全脯氨酰3-羟基化可能是这种疾病的发病机制之一。
IV型胶原和GPVI之间的异常相互作用似乎对某些癌症很重要。表观遗传失活下调乳腺癌细胞中P3H2的表达(30). 在没有P3H2的情况下表达IV型胶原的转移肿瘤细胞可能会促进与血管系统中血小板的相互作用，从而保护这些循环肿瘤细胞免受剪切应力和自然杀伤细胞的影响(31，32). GPVI-null小鼠实验性肿瘤肺转移减少50%也支持这种机制(33).
因此，本研究中阐述的凝血和ECM之间的联系为妊娠损失和癌症研究领域开辟了独特的领域。
材料和方法
P3H2-Null和P3H2/GPVI双满小鼠的产生。
所有涉及动物的程序均由俄勒冈州健康与科学大学机构动物护理和使用委员会批准。跨越15个外显子的小鼠Leprel1基因在在该基因的外显子2中进行了含有新盒的靶向破坏。将一个跨越外显子2、部分内含子1-2和大部分内含子2-3的9kb Bsa1限制性片段亚克隆到p26载体中，并使用AvaI限制性位点在外显子2序列中克隆新资产。将阳性ES细胞显微注射到129/SvJ小鼠囊胚中，并植入假孕雌性体内。将嵌合小鼠培育成C57BL/6J小鼠，以检测生殖系传播。通过毛色传递评估，来自不同ES细胞的两个嵌合体小鼠产生了生殖系后代。杂交杂合小鼠。
产生P3H2/GPVI双零，P3H2杂合（P3H2赫特)小鼠首先在GPVI-null（GPVI）上繁殖无效的)背景(19). P3H2赫特/全球产品虚拟指数无效的将小鼠杂交产生所有三种P3H2基因型(). P3H2/GPVI双零小鼠产生的遗传背景是混合的（129/SvJ×C57BL/6J×Black Swiss）。
IV型胶原的酶切和Edman测序。
牛晶状体囊IV型胶原在70%（vol/vol）甲酸中于室温下用CNBr消化过夜。将消化后的溶液冻干，并使用Akta FPLC系统（Amersham Biosciences）在串联Superose12柱上进行筛分色谱，以在0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中分离碎片。单个CNBr片段用胰蛋白酶消化，所得肽在Vydac C18（218TP52）柱（Grace）上分离。根据需要对胰蛋白酶肽进行额外的裂解，以使用嗜热菌素（钙生物化学）、天冬氨酸-N（普林斯顿分离系统）或两者释放单个含3Hyp的肽。将反相部分冻干，再悬浮在50μL 0.1 M碳酸氢铵（pH 7.4）和0.5–1.0μg酶中，并在室温下消化过夜。分离消化混合物，并在ABI Procise蛋白质测序仪（Applied Biosystems）上对级分进行测序。
MS分析牛晶状体囊IV型胶原中3-羟基脯氨酸的鉴定。
用胰蛋白酶对1D SDS/PAGE条带进行凝胶内消化，采用与所述类似的方案(33). 在配备电喷雾电离源的Q-TOF微型质谱仪（Waters）上对含有3-羟脯氨酸的肽进行鉴定。使用MassLynx（4.1版；Waters）数据采集软件收集数据，并使用Mascot Distiller（矩阵软件）进行处理。使用75μm×100 mm 3-μm Atlantis dC18分析柱，使用纳米Acquity系统（Waters）进行HPLC。通过对国家生物技术信息中心非冗余数据库（分类：哺乳动物）的马斯科特搜索，从所有MS/MS光谱中鉴定出色氨酸肽。脯氨酸和赖氨酸氧化被指定为可变修饰，MS和MS/MS扫描的搜索耐受性均为1.0 Da。经鉴定在X位含有羟脯氨酸的肽被标记为含有潜在的3-羟脯氨酸，并通过MS/MS数据的目视检查进行验证。
人GPVI的单体重组胶原蛋白结合域。
为了促进GPVI胞外胶原蛋白结合域的表达和纯化，克隆了其cDNA序列，作为与His标记硫氧还蛋白和氨基末端凝血酶裂解位点的融合分子的一部分。得到的序列和有关表达、重折叠和纯化的详细信息见SI材料和方法.
血小板聚集试验。
血小板聚集仪研究中使用富含血小板的血浆或洗涤过的血小板。将20毫升供体血液抽取到标准的柠檬酸葡萄糖抗凝剂中，在室温下以1000×克使红细胞颗粒化并获得富含血小板的血浆。将一等分富含血小板的血浆上清液以10000倍离心10分钟克以获得贫血小板血浆，该血浆用于空白聚集蛋白计（Bio/Data）。用50μg/mL I型胶原和200μg/mL（GlyProHyp）激活富含血小板的血浆（0.45 mL）10肽或（Gly3HypHyp）10肽诱导聚集，并在37°C下监测聚集6 min。
SPR。
使用BIAcoreX（Biacore Life Sciences，GE Healthcare）进行结合分析。根据制造商的说明（Biacore Life Sciences，GE Healthcare），将I型胶原蛋白（从小鼠皮肤中提取）、IV型胶原（从牛晶状体囊中提取）或合成肽共价偶联到CM5传感器芯片（研究级）。gpVICBD在HBS缓冲液[20 mM Hepes缓冲液（pH 7.4）中稀释，其中含有0.15 mM NaCl]，并在固定化配体上以不同浓度和不同流速注入。由于分析物与表面偶联配体的相互作用而产生的结合反应通过减去与普通控制流细胞的背景结合来标准化。结合分析在25°C下进行。
小鼠组织学和免疫荧光。
切片使用徕卡CM 1850紫外线冷冻器制作。Wright的染色剂是从Fisher Scientific购买的，并按照制造商的说明使用。使用激光捕获显微镜（PIXCELL II；Arcturus Engineering）直接从载玻片上对E6.5胚胎进行基因分型。
新鲜切下的组织切片在冷丙酮中固定10分钟，并在室温下用5%山羊血清封闭1小时。以下抗体用于免疫荧光实验：兔多克隆抗GPVI抗体（Thermo Scientific）、兔多克隆对抗IV型胶原抗体（针对从HR9细胞纯化的IV型胶原自制）和兔多克隆抗体6His（Abcam）。通常，一级抗体在含有0.1%吐温和0.5%山羊血清的PBS缓冲液中以1:1000稀释，然后与切片在冷藏室中孵育过夜。用PBS洗涤三次15分钟后，应用二级抗体，并在室温下与切片孵育1.5小时，然后进行几个洗涤步骤。山羊抗兔IgG与罗丹明（EMD Millipore）结合，选择Alexa Fluor 568或Alexa Fuor 488（分子探针）作为二级抗体。
组织覆盖试验。
蜕膜或眼部切片最初与gpVICBD在冷藏室中孵育过夜，并进行广泛洗涤。然后应用上述标准免疫染色方案，固定步骤除外。
从组织中提取胶原蛋白。
如前所述，从小鼠皮肤中提取用于SPR实验的I型胶原蛋白(6). 从牛晶状体胶囊（顺治制衣厂的礼物）中提取的IV型胶原蛋白用于3-羟脯氨酸的鉴定和结合实验。
