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前细胞神经科学。2016; 10: 124.
2016年5月18日在线发布。 数字对象标识：10.3389/fncel.2016.00124
PMCID公司：项目经理4870264
PMID：27242436

癫痫持续状态所致区域特异性星形胶质细胞死亡中DRP1磷酸化和线粒体动力学的差异

Ah-Reum Ko公司,† 惠元贤,† 苏继敏,和金继恩（Ji-Eun Kim）*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

癫痫持续状态（SE）后，星形胶质细胞对变性的反应和敏感性与星形胶质细胞的独特特性有关，这些特性与血流动力学相关。由于受损的线粒体分裂在有丝分裂、凋亡和程序性坏死中起着重要作用，我们研究了线粒体动力学的独特模式是否与SE诱导星形胶质细胞死亡的特征有关。在本研究中，SE诱导齿状回分子层的星形胶质细胞凋亡，同时线粒体长度减少。相反，CA1区的破细胞树突状（自噬）星形胶质细胞显示出SE诱导的线粒体伸长。Mdivi-1（线粒体分裂抑制剂）有效地减弱了星形胶质细胞的凋亡，但WY14643（线粒体分裂增强剂）加重了这种凋亡。此外，Mdivi-1加速了星形胶质细胞中的碎屑树突状细胞变化。星形胶质细胞中这些区域特异性线粒体动力学与动力相关蛋白1（DRP1；线粒体裂变蛋白）磷酸化密切相关，而非视神经萎缩1（OPA1；线粒体融合蛋白）表达。据我们所知，目前的数据首次证明了DRP1介导的线粒体分裂在星形胶质细胞丢失中的新作用。因此，本研究结果表明，星形胶质细胞线粒体的差异动力学可能参与SE诱导星形胶质细胞死亡的独特特征。

关键词：星形胶质细胞死亡、碎屑树突病、DRP1、线粒体、癫痫持续状态

介绍

线粒体是形态上动态的细胞器，对维持细胞功能、生长和生存至关重要（MacAskill等人。，2010；盛和蔡，2012；Birsa等人。，2013). 线粒体的形态状态与其能量生产能力有关（Bach等人。，2003；Olichon等人。，2003；Chen等人。，2005；贝纳德和罗西诺，2008)和细胞死亡机制（Cheung等人。，2007；Detmer和Chan，2007；Jahani-Asl等人。，2007；陈和陈，2009；林图尔和雷诺兹，2010). 线粒体经历两个相反的过程，分裂和融合（称为线粒体动力学），在平衡状态下运作，形成小个体单位或互联网络。这些过程在线粒体功能和不同细胞中线粒体分布的活性依赖性调节中起着关键作用（Li等人。，2004；Sung等人。，2008). 线粒体动力学由GTPases调节，GTPases是一个进化保守的大蛋白家族（Chen和Chan，2005). 融合相关的GTPases、线粒体融合蛋白1（MFN1）、MFN2和视神经萎缩1（OPA1）增加了细长线粒体的网络（Chen等人。，2003；Rambold等人。，2011). 相反，线粒体裂变蛋白动力相关蛋白1（DRP1）通过与裂变相关蛋白-1（Fis-1）和线粒体裂变因子（MFF；Smirnova等人。，2001；Chen等人。，2003；Cipolat等人。，2004). 其中，DRP1对大多数类型的线粒体分裂至关重要。通过翻译后修饰对DRP1的调节对于DRP1易位到线粒体是重要的（Alaimo等人。，2014). DRP1在Ser 616（S616）通过细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）1/细胞周期蛋白B或CDK5磷酸化促进线粒体在有丝分裂期间分裂（Taguchi等人。，2007；Liesa等人。，2009). 相反，蛋白激酶A（PKA）对DRP1-S637的磷酸化诱导DRP1从线粒体分离并抑制线粒体分裂（Kastatus等人。，2011；Wang等人。，2012). 因此，钙调神经磷酸酶对DRP1-S637的去磷酸化促进其向线粒体的易位，随后增加线粒体分裂，这导致对凋亡刺激的反应增加（Campello和Scorrano，2010). 因此，DRP1 S616/S637磷酸化比率的失衡参与了神经疾病的发病机制（DuBoff等人。，2012；Kim等人。，2014年b).

尽管星形胶质细胞被认为是具有同质特性的简单支持细胞，但许多研究表明，星形胶质细胞的特性在不同的脑区是不同的。事实上，在神经元损伤或反应性星形胶质细胞增生症之前或之后，都报告了星形胶质细胞死亡的区域特异性模式（Borges等人。，2006；Kang等人。，2006；Kim等人。，2014年a). 特别是，癫痫持续状态（SE；长时间发作活动）导致大鼠海马和梨状皮质（PC）中的星形胶质细胞死亡，这显示出区域特定的模式（Kang等人。，2006；Kim等人。，2010年a,b条,2011,2014年a；Ryu等人。，2011年a,b条). 在齿状回的分子层（而不是门）观察到星形胶质细胞凋亡（Kang等人。，2006；Kim等人。，2008,2010年b). 在CA1区，碎屑树突病是一种典型的不可逆星形胶质细胞变性，通过过度溶酶体衍生的自噬，表现为水肿细胞体的空泡化和解体过程（Penfield，1928；Sugawara等人。，2002；Kim等人。，2008,2010年b；Ryu等人。，2011年a,b条). 在PC中，观察到局灶性星形胶质细胞坏死（Kim等人。，2013,2014年a)类似于大脑的各个区域（Ingvar等人。，1994；Schmidt-Kastner和Ingvar，1994；Gualtieri等人。，2012). 此外，我们最近报告称，这些对星形胶质细胞变性的不同反应和敏感性很可能是由于星形胶质细胞以血流动力学诱导依赖的方式具有独特的特性（Kim等人。，2014年a). 由于DRP1磷酸化在有丝分裂、凋亡和程序性坏死中起着重要作用（Taguchi等人。，2007；Liesa等人。，2009；坎佩罗和斯科拉诺，2010；Kashatus等人。，2011；DuBoff等人。，2012；Wang等人。，2012；Kim等人。，2014年b)因此，在本研究中，我们研究了DRP1磷酸化的独特模式是否与SE诱导的星形胶质细胞死亡特征密切相关，线粒体动力学的调节影响区域特异性星形胶质细胞变性对SE的反应。

材料和方法

实验动物和化学品

雄性Sprague-Dawley大鼠（7周龄）取自Daehan Biolink（韩国）。这些动物被提供了商业饮食和水随意在22±2°C、55±5%和12:12光/暗循环条件下。动物实验方案由Hallym大学（韩国春川）动物护理和使用委员会批准。所有试剂均从Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）获得，除非另有说明。

手术和药物输注

用1–2%异氟烷麻醉大鼠2并放置在立体定位框架中。将脑灌注试剂盒1（Alzet，USA）植入右侧脑室（后部1mm；横向1.5mm；深度3.5mm），并连接到渗透泵（1007D，Alzet，USA），渗透泵包含：（1）载体；（2） Mdivi-1（50μM）；或（3）WY 14643（150μM）。Mdivi-1或WY14643预处理不会影响癫痫的易感性或其对匹罗卡品的易感性以及SE后的动物存活率（Kim等人。，2014年b). 泵被放置在肩胛间区的皮下袋中。

SE入职培训

手术后三天，大鼠接受毛果芸香碱（380 mg/kg，i.p.）治疗。为了减少匹罗卡品的外周效应，在单剂量匹罗卡平前20分钟注射甲基溴化阿托品（5 mg/kg，i.p.）。将动物在SE中饲养2 h，然后给予地西泮（10 mg/kg，i.p.）以终止癫痫发作，并根据需要重复。SE后，在小型动物重症监护病房（DW-1，ThermoCare，Paso Robles，CA，USA）观察所有动物，并在乳酸林格溶液中给予5%葡萄糖（液体加热至正常体温后，给予5 ml S.C.）。为了防止眼睛干燥，涂抹了眼部润滑剂。对动物进行持续监测，并在需要时每隔4小时注射5%葡萄糖于乳酸林格溶液中。第二天，动物们被喂食地板笼子上的高脂肪润湿啮齿类食物和苹果片。作为对照，年龄匹配的正常大鼠用生理盐水代替毛果芸香碱治疗。

组织加工和免疫组织化学

在氨基甲酸乙酯麻醉下（1.5 g/kg，i.p.），用4%多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）中经心灌注大鼠。在同一固定液中固定4h后，用30%蔗糖浸润大脑，并用30μm的低温恒温器进行切片。切片在室温下在初级抗血清混合物中培养过夜（表​（表1）1)在含有0.3%Triton X-100的PBS中，随后在FITC-和Cy3-共轭IgG的混合物中（美国新泽西州阿默沙姆）。TUNEL染色也根据制造商的方案进行（美国纽约州普莱西德湖Upstate）。对于阴性对照，将从非SE和SE后动物获得的海马组织与免疫前血清而非一抗孵育。使用Axiocam HRc相机和AxioVision Rel.4.8软件或共焦激光扫描显微镜（LSM 710，Carl Zeiss Inc.，Oberkocken，Germany）拍摄图像。采集监视器上每个部分的图像（每只动物15个部分）。概述区域后，感兴趣的区域（500μm2/从CA1场辐射层和齿状回分子层中选择。通过使用AxioVision Rel.4.8软件调整图像的黑白范围，对每个图像进行标准化。然后通过设置阈值水平（从5个图像输入获得的平均背景强度）来标准化荧光强度。荧光强度值通过减去背景噪声的平均值（阈值）进行校正。对图像的操作仅限于对整个图像进行阈值和亮度调整。

表1

本研究中使用的主要抗体.

抗体主机制造商（目录号）使用的稀释
GFAP公司兔子阿布卡姆（ab7260）1:500
GFAP公司鼠标微孔（Mab3402）1:100
灯1兔子阿布卡姆（ab24170）1:100
线粒体标记鼠标Abcam（ab14705）1:500
（线粒体复合体IV亚单位1，MTCO1）
pDRP1 S616系列兔子细胞信号（4494）1:500
pDRP1 S637系列兔子细胞信号（4867）1:500

细胞计数和线粒体长度测量

为了量化免疫组化数据，采集了监视器上每个切片的图像（每只动物15个切片）。勾勒出区域后，感兴趣的区域（1×105微米2)从CA1区放射层和齿状体分子层中选择。使用AxioVision Rel.4.8软件对20张图像上的细胞进行计数。结果以平均值±S.D.表示。星形胶质细胞中的单个线粒体长度(n个=20/节）也通过使用AxioVision Rel.4.8软件或ZEN lite（Blue Edition，Carl Zeiss Inc.，Oberkocken，Germany）软件进行三维重建（图​（图​2A）。2安培). 细胞计数和线粒体长度的测量由两名不同的研究人员进行，他们对组织的分类一无所知。

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癫痫持续状态（SE）后海马区域特异性星形胶质细胞死亡。（A）齿状回分子层中的星形胶质细胞反应。SE后3天和1周，在该区域观察到大量星形胶质细胞丢失。（B）SE后3天，齿状回分子层TUNEL阳性凋亡。（C）SE后CA1区的星形胶质细胞反应。（D）SE后4周，该区域LAMP1阳性碎屑树突病（圆形水肿细胞体，短钝突起，远端突起缺失，GFAP聚集，核溶解和LAMP-1阳性空泡化）。Bar=100（A、C）和25微米（B、D）.（E）SE后齿状回分子层内总星形胶质细胞中TUNEL阳性星形胶质细胞比例的量化（平均值±SD，n个分别=7）*第页与非SE动物相比，<0.05。（F）SE后CA1区内总星形胶质细胞中LAMP1阳性星形胶质细胞分数的量化（平均值±SD，n个分别=7）*第页与非SE动物相比，<0.05。

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海马内星形胶质细胞线粒体的三维重建。（A）显示线粒体长度测量的代表性图像。五十、 线粒体长度（长轴）。（B）CA1区和齿状回内星形胶质细胞线粒体三维重建的代表性照片。图1-3为GFAP、线粒体标志物和DAPI的合并图像。图4仅显示线粒体标记物的图像。面板c2,3和c2'，3'分别表示反应性星形胶质细胞和碎屑树突状星形胶质细胞。面板2、3是面板1至3中矩形的高倍图像。Bar=30（面板1）、7.5（面板2）和3.75（面板3.4）μm。

数据分析

使用单因素方差分析对定量测量所得的所有数据进行分析，以确定统计显著性。Bonferroni的测试用于事后（post-hoc）比较。A类第页-低于0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

SE诱导的区域特异性星形胶质细胞死亡

在本研究中，免疫组织化学的所有阴性对照均导致任何结构中均无免疫反应性（数据未显示）。首先，我们确认了星形胶质细胞对SE损伤的区域特异性脆弱性。与我们之前的研究一致（Kang等人。，2006；Kim等人。，2010年b,2011)本研究中，SE诱导齿状回分子层中大量星形胶质细胞凋亡。简单地说，SE后3天和7天，32%和51%的星形胶质细胞在该区域显示TUNEL信号（图1A、B、E). SE后四周，在该区域检测到反应性星形胶质细胞（图1A、B、E). 在CA1区，SE后3天和7天观察到典型的反应性星形胶质细胞增生（图1C、D、F). SE后4周，13%的CA1星形胶质细胞表现出典型的碎屑树突病，其具有圆形水肿细胞体、短而钝的突起、远端突起缺失、GFAP聚集、核溶解（无核或水性淡核染色）和LAMP-1阳性溶酶体（图1C、D、F). 这些发现表明SE可能导致海马区特定区域的星形胶质细胞死亡。

SE后星形胶质细胞的区域特异性线粒体动力学

为了研究线粒体动力学是否与SE诱导的星形胶质细胞死亡相关，我们分析了星形胶质细胞的线粒体长度。在非SE动物齿状回的分子层中，星形胶质细胞的线粒体长度约为1μm（图​（图2B，2B型,3A、B). SE后3天，星形胶质细胞线粒体长度减少至<0.2μm(第页<0.05与非SE动物，图​图2B，2B型,3A、B). SE后四周，线粒体长度增加至1.64μm，线粒体的形态在反应性星形胶质细胞中呈球形（球形形成，第页<0.05与非SE动物，图3A、B).

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齿状回分子层内星形胶质细胞线粒体形态的变化。（A）与非SE动物相比，SE后3天线粒体长度减少。SE后四周，反应性星形胶质细胞中线粒体延长，线粒体形态呈球形。巴=3.75μm。（B）齿状回分子层线粒体长度的定量值（平均值±SEM）(n个分别=7）*第页与非SE动物相比，<0.05。

在非SE动物的CA1区，星形胶质细胞的线粒体长度约为1μm（图4A、B类). SE后第三天，线粒体被拉长至1.69μm，星形胶质细胞中出现球状结构(第页<0.05与非SE动物，图4A、B类). SE后四周，反应性星形胶质细胞线粒体长度（1.87μm）和球体形成增加(第页<0.05与非SE动物，图​图2B，2B型,4A、B类). 在碎屑树突状星形胶质细胞中，线粒体长度为2.28μm(第页<0.05与非SE动物，图​图2B，2B型,4A、B类). 这些发现表明线粒体动力学的差异模式可能与SE诱导的区域特异性星形胶质细胞死亡有关。

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CA1区星形胶质细胞线粒体形态的变化。（A）与非SE动物相比，SE后3天线粒体长度增加。SE后4周，线粒体长度增加，线粒体在反应性星形胶质细胞和碎屑树突状星形胶质细胞中呈球形。棒材=3.75μm。（B）CA1区线粒体长度的定量值（平均值±SEM）(n个分别=7）*第页与非SE动物相比，<0.05。

Mdivi-1和WY14643对SE区域特异性星形胶质细胞反应的影响

为了直接解决线粒体动力学是否影响SE引起的区域特异性星形胶质细胞死亡的问题，我们研究了Mdivi-1（线粒体裂变抑制剂）和WY14643（线粒体裂变增强剂）的作用；Lundgren等人。，1990；Zolezzi等人。，2013)齿状回分子层和CA1区内星形胶质细胞线粒体动力学。

与载体（1μm）相比，在齿状回分子层，Mdivi-1增加了非SE动物星形胶质细胞的线粒体长度（2.93μm），但WY14643减少了线粒体长度（0.62μm）；第页与车辆相比<0.05；数字5A、B级). 与载体（0.2μm；第页与车辆相比<0.05；数字5A、B). 此外，在输注Mdivi-1的动物中，星形胶质细胞有不均匀的厚突起，肥大和水肿的细胞体没有空泡化。相反，WY14643与载体（0.2μm；图5A、B). 此外，Mdivi-1有效缓解了SE诱导的齿状回分子层星形胶质细胞死亡(第页<0.05与车辆，图6A、B)尽管Mdivi-1和WY14643均未在非SE动物中诱导星形胶质细胞死亡（图6A、B). 相反，WY14643在该区域加重了SE诱导的星形胶质细胞死亡(第页<0.05与车辆，图6A、B). 这些发现表明，线粒体过度分裂可能导致SE诱导的齿状回分子层星形胶质细胞凋亡死亡。

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Mdivi-1和WY14643对SE后3天齿状回分子层内星形胶质细胞线粒体长度的影响（A）在非SE动物中，与载体相比，Mdivi-1增加了线粒体长度，但WY14643减少了星形胶质细胞中的线粒体长度。继SE之后，Mdivi-1有效地减弱线粒体长度的减少，并诱导星形胶质细胞肥大和水肿变化，而不会出现空泡化。WY14643不影响星形胶质细胞线粒体长度的减少。棒材=3.75μm。（B）齿状回分子层线粒体长度的定量值（平均值±SEM）(n个分别=7）*第页<0.05与非SE动物相比；#第页与车辆相比<0.05。

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Mdivi-1和WY14643对SE引起的区域特异性星形胶质细胞死亡的影响（A）与载体相比，Mdivi-1有效缓解SE诱导的齿状回分子层星形胶质细胞死亡。相反，WY14643加重了该区域SE诱导的星形胶质细胞死亡。Mdivi-1和WY14643均未影响SE后CA1区星形胶质细胞的数量。Bar=6.25μm。（B）齿状回分子层星形胶质细胞数量的定量值（平均值±SEM）(n个分别=7）*第页<0.05与非SE动物相比；#第页与车辆相比<0.05。（C）CA1区星形胶质细胞数量的定量值（平均值±SEM）(n个分别=7）。

在CA1区，Mdivi-1增加了线粒体长度（2.97μm），但WY14643降低了非SE动物星形胶质细胞的线粒体长度（0.59μm；第页与车辆相比<0.05；数字7A、B). 虽然Mdivi-1对SE诱导的线粒体伸长（2.49μm）没有影响，但WY14643有效抑制了SE诱导的星形胶质细胞伸长（1.21μm），而载体（1.71μm；第页与车辆相比<0.05；数字7A、B). 在载体和WY14643治疗的动物中，星形胶质细胞表现出典型的反应性胶质增生（细胞体和过程肥大），但没有空泡化(第页与车辆相比<0.05；数字7A、B). 在Mdivi-1治疗的动物中，星形胶质细胞的胞体呈圆形，突起短而钝，细胞质中有空泡(第页与车辆相比<0.05；数字7A、B). 因此，这些发现表明线粒体异常伸长可能会加速碎屑树突病。Mdivi-1和WY14643均未影响SE后CA1区星形胶质细胞的数量（图6A、C). 然而，Mdivi-1输注抑制了该区域星形胶质细胞Ki-67的诱导（图​（图8；8;第页与车辆相比<0.05）。相反，WY14643输注增加了CA1区Ki-67阳性星形胶质细胞的数量（图​（图8；8;第页与车辆相比<0.05）。这些发现表明线粒体分裂可能是就地CA1区星形胶质细胞增殖。综上所述，我们的研究结果表明，线粒体动力学可能在决定SE后CA1区星形胶质细胞的细胞死亡模式和反应性胶质增生中发挥重要作用。

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Mdivi-1和WY14643对SE后3天CA1星形胶质细胞线粒体长度的影响（A）在非SE动物中，与载体相比，Mdivi-1增加了线粒体长度，但WY14643减少了星形胶质细胞中的线粒体长度。SE后，Mdivi-1不影响线粒体伸长，而WY14643有效抑制线粒体伸长。在Mdivi-1-治疗的动物中，CA1星形胶质细胞的胞体呈圆形，突起短而钝，细胞质中有空泡，而在溶媒和WY14643-治疗的动物，CA1星状胶质细胞表现出典型的反应性胶质增生，没有空泡化。棒材=3.75μm。（B）齿状回分子层线粒体长度的定量值（平均值±SEM）(n个分别=7）*第页<0.05与非SE动物相比；#第页与车辆相比<0.05。

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Mdivi-1和WY14643对SE后3天CA1星形胶质细胞Ki-67诱导的影响（A）与载体相比，Mdivi-1输注抑制了星形胶质细胞Ki-67的诱导，而WY14643输注增加了Ki-67阳性星形胶质细胞的数量。棒材=50μm。（B）总星形胶质细胞中Ki-67阳性星形胶质细胞分数的定量值（平均值±SEM）(n个分别=7）*第页与车辆相比<0.05。

海马区域特异性星形胶质细胞DRP1磷酸化

剩下的问题是什么样的线粒体动力学相关蛋白参与SE诱导的星形胶质细胞死亡。由于OPA1是线粒体融合所必需的（Chen等人。，2003；Rambold等人。，2011)，我们研究了SE后星形胶质细胞OPA1表达的变化。在非SE动物中，OPA1在CA1星形胶质细胞中表达明显，而其表达主要在齿状回分子层内的神经丝中检测到。SE不影响具有这两个区域的星形胶质细胞中OPA1的表达，而碎屑树突星形胶质细胞中OPA1的表达减少（图​（图99).

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SE后海马区星形胶质视神经萎缩1（OPA1）的表达（A）SE后GFAP和OPA1的双重免疫荧光图像。在非SE动物中，OPA1在CA1星形胶质细胞中表达明显，而其表达主要在齿状回分子层内的神经膜中检测到。与非SE动物相比，破细胞树突状星形胶质细胞中OPA1的表达降低，而反应性星形胶质细胞则没有。棒材=6.25μm。（B，C）CA1区OPA1表达的定量值（平均值±SEM）（B）和齿状回的分子层（C）(n个分别=7）*第页与非SE动物相比，<0.05。

与OPA1不同，DRP1在调节线粒体裂变中起着重要作用（Smirnova等人。，2001)涉及各种神经系统疾病（DuBoff等人。，2012；Kim等人。，2014年a). 线粒体动力学由DRP1磷酸化位点反向调节：DRP1-S616磷酸化激活线粒体裂变，但DRP1-S637磷酸化抑制裂变（Kashatus等人。，2011；Wang等人。，2012). 因此，DRP1 S616/S637磷酸化比率是DRP1介导的线粒体动力学能力的指标之一（Kim等人。，2014年a). 为了阐明线粒体动力学与星形胶质细胞对SE的反应之间的关系，我们分析了磷酸-DRP1（pDRP1）荧光强度的比值。在非SE动物中，齿状回分子层内星形胶质细胞中的pDRP1-S616/pDRP1_S637比率为2.63（图10A–C). 相反，CA1区星形胶质细胞中的pDRP1-S616/pDRP1_S637比率为5.56（图11A–C型). 这些结果表明，CA1区的线粒体分裂电位可能高于齿状回。

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SE后齿状回分子层星形胶质DRP1磷酸化SE后GFAP和pDRP1-S616/-S637的双重免疫荧光图像。与非SE动物相比，SE后第三天，pDRP1-S616强度增加，而pDRP1_S637强度降低。SE后四周，pDRP1-S616强度不变，但与SE后3天观察到的强度相比，pDRP2-S637强度增强。Bar=12.5μm。（B）SE后pDRP1-S616/GFAP和pDRP1S-637/GFAP比率的量化（平均值±SEM，n个分别=7）*第页与pDRP1-S616/GFAP相比<0.05；#第页与非SE动物相比，<0.05。（C）SE后pDRP1-S616/pDRP1_S637比值的量化（平均值±SEM，n个分别=7）*第页与非SE动物相比，<0.05。

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SE后CA1区星形胶质细胞DRP1磷酸化（A）SE后GFAP和pDRP1-S616/-S637的双重免疫荧光图像。SE后三天，与非SE动物相比，pDRP1-S616和pDRP1-S637的强度均增强。SE后四周，pDRP1-S616强度不变，但与SE后3天观察到的强度相比，pDRP2-S637强度增强。Bar=12.5μm。（B）SE后pDRP1-S616/GFAP和pDRP1S-637/GFAP比率的量化（平均值±SEM，n个分别为7）*第页与pDRP1-S616/GFAP相比<0.05；#第页与非SE动物相比，<0.05。（C）SE后pDRP1-S616/pDRP1_S637比值的量化（平均值±SEM，n个分别=7）*第页与非SE动物相比，<0.05。

SE后3天，齿状回分子层pDRP1-S616强度增加到非SE水平的1.89倍，而pDRP1-S637强度降低到非SE的0.66倍(第页<0.05与非SE，图10安，B). 因此，星形胶质细胞中pDRP1-S616/pDRP1_S637的比率增加到7.56（图10摄氏度). 与非SE动物相比，CA1区pDRP1-S616的强度没有改变。然而，在SE后4周，pDRP1-S637/GFAP强度分别增加到非SE水平的3.44倍(第页<0.05与非SE，图11A、B). 因此，在SE后3天，星形胶质细胞中的pDRP1-S616/pDRP1_S637比率降至1.58(第页<0.05与非SE，图11摄氏度). 这些结果表明，星形胶质细胞中DRP1介导的线粒体分裂电位在齿状回分子层可能增加，但在SE后3天，CA1区可能降低。

SE后4周，齿状回分子层的pDRP1-S616/pDRP1_S637比值降至1.66(第页<0.05与非SE，图10摄氏度)，因为pDRP1-S616是非SE水平的1.23倍(第页<0.05与非SE，图10安，B)pDRP1-S637强度增强至非SE水平的1.95倍(第页<0.05与非SE，图10安，B). 在CA1区，在SE后4周，pDRP1-S637强度分别增加到非SE水平的5.22倍(第页<0.05与非SE，图11A、B). 因此，在SE后4周，星形胶质细胞中的pDRP1-S616/pDRP1_S637比率分别降至1.03(第页<0.05与非SE，图11摄氏度). 这些发现表明，SE可能导致CA1星形胶质细胞中DRP1介导的线粒体动力学能力的长期降低，而齿状回分子层中的星形胶质细胞则不同。因此，星形胶质细胞中独特的DRP1 S616/S637磷酸化比率可能代表星形胶质细胞的不同性质，并可能在确定SE诱导的星形胶质细胞死亡模式中发挥重要作用。

讨论

星形胶质细胞调节血脑屏障、突触传递和大脑能量代谢的功能（安德森和斯旺森，2000；Ransom等人。，2003). 脑损伤后，反应性星形胶质细胞增生表现为GFAP表达上调、星形胶质细胞肥大、增殖和神经胶质瘢痕形成（Bordy和Sontheimer，1998；Mathern等人。，1998). 因此，星形胶质细胞被认为能够抵抗各种有害压力。然而，Revuelta等人(2005)据报道，红藻氨酸给药后CA1区星形胶质细胞死亡。星形胶质细胞凋亡（Kang等人。，2006)和自噬性星形胶质细胞死亡（碎屑树突病；Kim等人。，2008,2009；Ryu等人。，2011年a)也分别在CA1区域的齿状回分子层和放射层中检测到（Kim等人。，2008,2009；Ryu等人。，2011年a). 因为SE会导致低血压、高热、低血糖、酸中毒和缺氧（Turski等人。，1989；Walker等人。，2002)区域特异性星形胶质细胞死亡可简单解释为SE期间血流动力学改变导致细胞代谢受损的结果。然而，SE引起的区域特异性胶质细胞死亡与血流动力学无关，因为体外使用脑切片的研究与体内模型（Kim等人。，2014年a). 因此，值得注意的是，为了理解星形胶质细胞在各种神经疾病中的作用，需要阐明不同区域星形胶质细胞的差异特性。尤尔和卡博夫斯基(2005)据报道，线粒体过度分裂导致细胞凋亡。此外，线粒体分裂的干扰抑制了细胞凋亡并引起延迟细胞死亡（Youle和Karbowski，2005；Cassidy-Stone等人。，2008). 突变泛素对DRP1的失稳也增强了线粒体融合和星形胶质细胞对氧化应激的抵抗力（Yim等人。，2014). 因此，抑制线粒体分裂被认为对线粒体功能有益。然而，受损的线粒体分裂也会引起线粒体生物能量学的下降（Parone等人。，2008；DuBoff等人。，2012). 虽然线粒体伸长代表了一种补偿能量生产失败的机制，但伸长的线粒体只能暂时维持细胞新陈代谢（Rolland等人。，2013). 此外，DRP1缺失由于氧化应激而损害线粒体功能，氧化应激通过活性氧物种合成的增加导致线粒体损伤的进一步加重（Parone等人。，2008；Kageyama等人。，2012)可以激活自噬细胞死亡（Chen等人。，2007；Lin等人。，2014). 在本研究中，SE通过降低CA1星形胶质细胞中DRP1 S616/S637磷酸化比率，诱导线粒体伸长和碎屑树突状星形胶质细胞变性。与CA1区相反，SE通过增加齿状回DRP1 S616/S637磷酸化比率导致线粒体分裂和星形胶质细胞凋亡死亡。与非SE动物相比，SE后星形胶质细胞中OPA1的表达没有改变，尽管其在破细胞树突状细胞（死亡）中的表达下降。此外，Mdivi-1显著恶化了CA1星形胶质细胞中的线粒体伸长和碎屑树突样事件。Mdivi-1还可以阻止SE诱导的齿状回星形胶质细胞凋亡死亡，而WY14643则加重了这种死亡。这些发现表明，阻断过度的线粒体分裂可能会阻止星形胶质细胞的凋亡，但持续的抑制可能会导致星形胶质细胞功能障碍，最终导致星形细胞自噬死亡。因此，我们的数据表明DRP1介导的线粒体动力学可能是SE诱导星形胶质细胞死亡的一把双刃剑。

碎屑树病是阿尔茨海默氏症在1910年报道的一种不可逆的星形胶质细胞损伤，包括细胞体的广泛肿胀和空泡化以及解体和珠状突起，Cajal称之为“碎屑树病”。此外，在各种神经疾病模型中观察到CA1星形胶质细胞变性（Tomimoto等人。，1997；Deloncle等人。，2001；Sugawara等人。，2002；Revuelta等人。，2005；Kim等人。，2008)以TUNEL阴性肥大和空泡化为特征。这种空泡化星形胶质细胞变性可视为凝固性坏死性改变（Sugawara等人。，2002). 然而，我们发现，破细胞树突状星形胶质细胞中的空泡显示出LAMP-1免疫反应性，并且在大多数破细胞树突星形胶质细胞都检测到LC3-II和Beclin-1的表达（Ryu等人。，2011年a). 因此，我们已经报道了碎屑树突病可能是自噬性星形胶质细胞死亡。虽然确切的机制尚不清楚，但在缺血性损伤或兴奋性毒性损伤后，只在CA1区观察到了碎屑树突病（Dihnéet al。，2001；Sugawara等人。，2002). 因此，一些研究人员推测，由于能量衰竭和酸中毒，再加上线粒体抑制，导致星形胶质细胞功能障碍与碎屑树突病有关（Friede和van Houten，1961；克雷格和切勒，1990；Hulse等人。，2001). 基于这些先前的研究，我们的发现提供了一种可能性，即由于线粒体分裂的长期损伤，导致线粒体功能障碍可能与碎屑树突病密切相关。

众所周知，海马体中神经元对侮辱的易损性并不一致，但在大脑的各个区域中是异质的。简言之，齿状颗粒细胞对大多数损伤造成的神经元损伤具有显著的抵抗力。相反，CA1和CA3神经元以及肺门神经元极易受到各种有害刺激（Greene等人。，2009). 然而，海马神经元这些不同脆弱性的原因或机制尚不清楚。上述，越来越多的证据支持SE导致破坏性星形胶质细胞死亡，其特征是区域特异性模式，自Schmidt-Kastner和Ingvar以来(1994,1996)描述了SE后大脑中的区域特异性星形胶质细胞损伤。与海马神经元的情况类似，导致区域特异性胶质细胞死亡的分子事件尚不清楚。首先，我们假设CA1和齿状回之间的星形胶质细胞生理差异最有可能是因为齿状回和海马之间独特的血流动力学特征体内然而，星形胶质细胞对毛果芸香碱的反应体外模型类似于体内模型（Kim等人。，2014年a). 这些发现表明，星形胶质细胞反应的区域特异性模式可能是血液动力学诱导的现象。因此，我们得出结论，SE引起的区域特异性星形胶质细胞反应可能是星形胶质细胞轮廓差异的结果就其本身而言在本研究中，线粒体的形态在CA1星形胶质细胞和齿状回分子层内的星形胶质细胞之间保持不变。然而，CA1星形胶质细胞中DRP1 S616/S637磷酸化比率高于齿状回分子层。这些发现表明CA1星形胶质细胞的线粒体分裂和DRP1活性高于齿状回内的星形胶质细胞。有趣的是，目前的数据还表明，SE通过增加pDRP1-S637水平延长了CA1星形胶质细胞的线粒体长度，同时由于增强pDRP1-S616而增加了线粒体分裂，同时导致齿状回中的星形胶质细胞死亡。因此，幼稚星形胶质细胞中独特的DRP1 S616/S637磷酸化比率可能代表星形胶质细胞的不同特性，并可能在适当维持线粒体动力学以应对线粒体分裂诱导事件中发挥重要作用。

目前的数据不能直接说明SE影响星形胶质细胞线粒体动力学的机制。Horn等人(2011)据报道，DRP1活性在细胞进入G1期时下降，随后在G1/S期阻滞后逐渐增加。此外，有丝分裂线粒体分裂依赖于DRP1 S616通过细胞周期蛋白B/细胞周期蛋白依赖性激酶1磷酸化（Kashatus等人。，2011). 在本研究中，出乎意料的是，Mdivi-1抑制了星形胶质细胞Ki-67的诱导，而WY14643增加了SE后Ki-67阳性星形胶质细胞的数量。因此，据推测，在SE诱导的反应性星形胶质细胞增生的发展过程中，线粒体动力学和细胞周期相关事件可能相互调节，目前尚不清楚。另外，谷氨酸兴奋性毒性可能与星形胶质细胞线粒体动力学功能障碍有关（Szydlowska等人。，2006；Ju等人。，2015). 事实上谷氨酸兴奋性毒性的阻断促进了星形胶质细胞的生存能力（Lee等人。，2010). 因此，对谷氨酸或谷氨酸浓度的不同敏感性可能导致线粒体动力学失衡的不同模式。需要进一步的研究来阐明SE诱导星形胶质细胞DRP1活性调节的确切机制。

总之，本研究结果表明，幼稚星形胶质细胞在不同海马区域显示出独特的DRP1磷酸化模式，这与星形胶质细胞对SE的不同反应有关。此外，我们的研究结果表明增强的pDRP1-S637促进自噬性星形胶质细胞死亡，pDRP-S616升高可诱导星形胶质细胞凋亡死亡。因此，DRP1磷酸化的调控可能是决定SE诱导星形胶质细胞死亡模式的重要因素之一。

作者贡献

J-EK设计并监督了该项目。J-EK用A-RK、H-WH和S-JM设计并执行了手稿中描述的实验。H-WH、A-RK和J-EK分析了数据。J-EK写了手稿。

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

本研究得到了韩国教育部资助的韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划（2013R1A6A3A04058272）的支持。

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文章来自细胞神经科学前沿由以下人员提供Frontiers Media SA公司