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.2011年4月15日；22(8):1207-16.
doi:10.1091/mbc。E10-07-0567。 Epub 2011年2月16日。

APC/CCdh1介导的Drp1稳定性控制对线粒体形态的调节

莎拉·霍恩 1, 迈克尔·托梅尼乌斯, 埃里卡·塞格尔-约翰逊, 克里斯托弗·德·弗里尔, 朱迪·Q·吴, 乔纳森·科洛夫, Chih-Sheng Yang先生, 万里堂, 杰安, 奥尔加·R·伊尔卡耶娃, 杰弗里·拉思梅尔, 克里斯托弗·纽加德, 萨利·科恩布卢斯
附属公司

APC/CCdh1介导的Drp1稳定性调控对线粒体形态的调控

莎拉·霍恩等。 分子生物学细胞. .

摘要

细胞线粒体的稳态维持需要裂变和融合之间的动态平衡，形态学的受控变化对诸如细胞凋亡和细胞分裂等过程很重要。相间线粒体被描述为细胞进入有丝分裂时碎片的一个相互连接的网络，这种有丝分裂的线粒体碎片被线粒体分裂机制的关键组成部分动力相关GTPase Drp1（动力相关蛋白1）调控。在有丝分裂过程中，Drp1功能的丧失和随后线粒体分裂的失败导致了不完全的胞质分裂和线粒体在子细胞中的不均匀分布。在有丝分裂退出和间期，线粒体网络发生改变。在这里，我们证明，当细胞退出有丝分裂时，线粒体动力学的变化部分是通过Drp1的泛素化来驱动的，该泛素化由APC/C（Cdh1）（后趋复合体/环体及其辅活化子Cdh1，E3）泛素连接酶复合体催化。重要的是，在间期抑制Cdh1介导的Drp1泛素化和蛋白酶体降解可阻止细胞分裂后线粒体网络的正常G1期再生。

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数字

图1：
图1：
Drp1的稳定性在细胞周期中发生变化。（A） 在诺卡唑释放后的指定时间收集前中期抑制HeLa细胞。肌动蛋白被显示为一种负荷控制，磷酸化-胆固醇H3是一种有丝分裂标记物。（B） （A）中所示数据的量化，n=3。在三个独立的实验中，Drp1蛋白水平被量化并标准化为肌动蛋白水平。结果以诺卡唑停药释放后3、5和7小时Drp1的百分比绘制，100%代表时间0时的Drp1水平。误差条反映了平均值的SE。（C） 将HeLa S3细胞从胸腺嘧啶诱导的G1/S阻滞释放到含有诺可唑的培养基中，并在指定时间收集。（D） 将HeLa细胞从胸腺嘧啶诱导的G1/S期阻滞中释放出来，如图（C）所示，并对裂解产物进行检测，以获得指示的线粒体形态蛋白。（E） 的自动射线照片35S-标记的Drp1与诺卡唑停药释放后2小时制备的HeLa细胞提取物孵育后，或与诺卡氮停药前中期制备的Hea细胞提取物培养后2小时。（F） （E）中所示数据的量化，n=5。百分比差异35根据Student’St吨测试（*p=0.013079；**p=0.013553）。
图2：
图2：
Drp1降解受Cdh1刺激。（A） 用诺卡唑阻止HeLa细胞，然后在新鲜培养基中培养1 h。在室温下培养低张细胞裂解物，并在指定时间取等分样品进行免疫印迹。在底部面板中，在室温下培养之前，将MBP-Emi2添加到细胞裂解液中。（B） Drp1和细胞周期蛋白B1中D盒的排列。（C） 在不存在蛋白酶体抑制剂MG132的情况下，在HEK 293T细胞中表达带有或不带有HA-Cdh1或HA-Cdc20的FLAG-tagged Drp1。（D） 将Ni-beads或与His-tagged Drp1结合的Ni-bead与HEK 293T细胞裂解物孵育，并对小球进行Cdh1免疫印迹。输入通道代表下拉中使用的裂解液的10%。
图3：
图3：
Cdh1介导的线粒体形态变化。（A） 细胞色素c（c）转染HA-Cdh1（HA染色，绿色显示）或未转染（无HA染色）的异步HeLa细胞线粒体形态染色。所示图像代表了多项独立实验。（B） 用丝裂原-PA-GFP和pCDNA3或pCDNA3-HA-Cdh1转染HeLa细胞。用紫外线激光（405 nM）照射每个细胞的少量线粒体。数据表示随着时间的推移，UV激活的感兴趣区域的相对荧光，误差条表示平均值的SE。
图4：
图4：
APC/C要求加拿大存托凭证1-Drp1的介导降解。（A） 体外泛素化-翻译35S-Drp1通过免疫纯化APC/C补充重组Cdc20（A）或Cdh1（B）。细胞周期蛋白B1的N末端片段显示为阳性对照。（C） 诺卡唑释放后，HeLa裂解产物在指定时间表达Drp1 WT或Drp1 D-Box突变。～30 kDa的非特异性带（NS）显示为加载参考。当标准化加载时，相对于WT构造，Drp1 D-Box突变体增加了11%。（D） FLAG和细胞色素c（c）用FLAG-tagged pcDNA3-Drp1 WT或FLAG-taged pcDNA2-Drp1 D-Box突变体转染HeLa细胞的线粒体形态染色（与未转染细胞相比，顶部面板中未显示FLAG染色）。显示了细胞色素z堆栈的最大投影c（c）免疫荧光。（E） 使用完全相同的参数（增益和偏移值相同）采集和分析图像，以便在相同实验的图像集之间进行比较。FLAG荧光和线粒体物体的数量（基于细胞色素c（c）荧光）对几个单独的WT和D-Box突变表达细胞进行量化，图中的每个数据点代表一个单独的细胞。在我们的分析过程中，出现了两组FLAG阳性细胞：一组相对FLAG荧光小于30000 U，另一组荧光大于40000个相对单位。对于FLAG荧光较低的群体，任何一种结构的表达都与线粒体断裂的程度无关，而对于第二个群体则与线粒体断裂程度相关。第一群体中缺乏相关性可能反映出：APC/C降低加拿大存托凭证1该细胞亚群中的活性、线粒体融合减少以对抗依赖Drp1的分裂，或G1早期缺乏紧密同步性（例如，细胞群体可能在有丝分裂退出过程中更早，从而显示出独立于外源性Drp1分子的有丝分裂分裂）。（F） 表达FLAG标记的pcDNA3-Drp1 WT或FLAG标记pcDNA3-Drp1 D-box突变结构的细胞的线性回归分析（来自第二个群体，荧光大于40000个相对单位）。这个年-轴显示每单位面积的荧光和线粒体物体数量x个-轴显示相对FLAG荧光。对于这个细胞群体，FLAG-Drp1和FLAG-D-Box突变型Drp1的表达与线粒体对象数量的增加相关（r=0.74；r2= 0.544; p=0.02），尽管两种结构（WT与D-Box突变）引起的线粒体断裂程度没有显著差异。
图5：
图5：
Cdh1调节Drp1丰度。（A） 免疫检测从增殖WT或Cdh1-null MEF制备的裂解物中的Cdh1和Drp1。β-微管蛋白显示为负荷控制。（B） 对WT或Cdh1-null MEF产生的Drp1免疫沉淀物进行泛素免疫印迹。显示了Drp1泛素结合物的相对丰度和Drp1蛋白水平。（C） 在诺卡唑停药释放后的指定时间，从WT或Cdh1-null MEFS制备裂解物，并对Drp1进行免疫印迹。
图6：
图6：
Cdh1调节间期线粒体形态和代谢中依赖Drp1的变化。（A） 细胞色素c（c）转染以下siRNA寡核苷酸的G1/S阻滞细胞线粒体形态染色：Scrambled、Cdh1、Drp1以及Drp1和Cdh1。所示图像代表了多项独立实验。（B） 盲量化（A）（n=4）。（C） siRNA转染的早期G1期HeLa细胞中的细胞周期蛋白E免疫印迹。（D） 基于MS/MS的分析，对转染所示siRNAs的G1/S阻滞HeLa细胞中的酰基肉碱物种进行分析。三份样品的平均值显示为相对于加扰RNAi控制的百分比变化。
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