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.2011年8月7日；13(9):1108-15.
doi:10.1038/ncb2310。

RALA和RALBP1在有丝分裂时调节线粒体分裂

大卫·F·卡萨图斯 1, Kian Huat Lim先生, 多尼塔·C·布雷迪, 妮可·L·K·潘兴, 阿德里安·D·考克斯, 克里斯托弗M计数器
附属公司

RALA和RALBP1在有丝分裂时调节线粒体分裂

大卫·F·卡萨图斯等。 Nat细胞生物学. .

摘要

线粒体作为动态互联网络存在，通过融合和裂变的平衡来维持。有丝分裂期间，线粒体向子细胞的均匀分布需要裂变。有丝分裂线粒体分裂依赖于大GTPase DRP1重新定位到线粒体外膜，以及有丝分裂激酶cyclin B-CDK1对DRP1上Ser 616的磷酸化（参考文献2）。我们现在报告，这些过程由小Ras-like GTPase RALA及其效应器RALBP1（也称为RLIP76、RLIP1或RIP1；参考文献3、4）介导。具体来说，有丝分裂激酶Aurora A磷酸化RALA的Ser 194，将其重新定位到线粒体，在线粒体中浓缩RALBP1和DRP1。此外，RALBP1与导致Ser 616上DRP1磷酸化的细胞周期蛋白B-CDK1激酶活性相关。破坏RALA或RALBP1会导致有丝分裂时线粒体分裂的丧失、胞质分裂过程中线粒体的不当分离以及ATP水平和细胞数量的下降。因此，两种有丝分裂激酶Aurora A和细胞周期蛋白B-CDK1汇聚在RALA和RALBP1上，以促进线粒体分裂、线粒体向子细胞的适当分布，并最终促进适当的线粒体功能。

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数字

图1
图1
极光A促进RalA线粒体定位和分裂。A类稳定表达GFP标记RalA、RalA的HEK-TtH细胞S194D型或RalAS194A型用MitoTracker红孵育线粒体。用共焦显微镜观察GFP-RalA（绿色）和线粒体（红色）。用Imaris软件测定GFP-RalA与线粒体共定位的融合（黄色，2D共定位）和表面呈现（白色，3D共定位）。通过计算共定位图像中每个物体的强度总和除以GFP图像中每个对象的强度总和的总和，量化与MitoTracker红共定位的GFP蛋白的百分比。（比例尺=5µm）。B、 C、G免疫印迹分析高浓缩线粒体部分（mito）、全细胞提取物（WCE）和从表达B类没有转基因，C类矢量，极光AT288D型或极光AK162R型或G公司干扰或RalA shRNA.复合V-β（线粒体）、钙连蛋白（ER）、钠+/K（K）+分析ATP酶（质膜）和微管蛋白（细胞质）以评估纯度。3个实验的代表。D、 E、F通过表达所示shRNAs和/或转基因的HEK-TtH细胞的MitoTracker红染色观察线粒体形态。图：高度碎片化的细胞百分比（平均值±标准偏差）(■), 中间体(■) 或高度互联(□) 来自3个独立实验的线粒体形态（>100个细胞）。（比例尺=5µm）。H（H）表达craft或RalA shRNA并转染mito-YFP的HEK-TtH细胞中的线粒体网络连接。归一化和光漂白校正的流动分数代表30条单独FRAP曲线的平均±SEM（**p=2.02×10−8).
图2
图2
RalBP1促进线粒体断裂。A、 B、E、G高富集线粒体部分（mito）和全细胞提取物（WCE）中RalA、RalBP1或Drp1水平的免疫印迹分析A类矢量，极光AT288D型或极光AK162R型，B类加扰对照（加扰）、RalA shRNA或RalBP1 shRNAE类极光AT288D型加上加扰控制或与载体（V）或抗shRNA RalBP1（BP1）互补的RalBP1-shRNA，或G公司myc-RalBP1-拉力赛S194A型或myc-RalBP1-RalAS194D型分析复合V-β（线粒体）以评估纯度。3个实验的代表。C、 D、H用MitoTracker红染色观察C类HEK-TtH细胞，D类表达活性极光A的HEK-TtH细胞T288D型和一个加扰序列或RalBP1 shRNAs单独或与shRNA-resistant野生型RalBPl或H（H）表达Myc-RalBP1-RalA的HEK-TtH细胞S194A型或Myc-RalBP1-RalAS194D型图：高度碎片化的细胞百分比（平均值±标准偏差）(■), 中间体(■) 或高度互联(□) 3个独立实验的线粒体形态（>100个细胞）（比例尺=C类5微米D、 H（H）25µm）。F类GFP-RalBP1-RalA分布的重叠（合并，黄色）S194A型或GFP-RalBP1-RalAS194D型，通过HEK-TtH细胞中GFP（绿色）和MitoTracker红色阳性线粒体（红色）的免疫荧光检测。用Imaris软件测定GFP-RalBP1-RalA融合蛋白与线粒体（白色）共定位的表面呈现。通过计算共定位图像中每个物体的强度总和除以GFP图像中每个对象的强度总和的总和，量化与有丝分裂追踪红共定位的GFP蛋白的百分比。（比例尺=SD为5µm，SA为3µm）。
图3
图3
RalA和RalBP1促进线粒体定位Drp1。A类从表达myc-RalA的HeLa细胞中分离的提取物，无论是非同步的（U）还是使用双胸腺嘧啶核苷阻断的有丝分裂同步的（M），要么通过免疫印迹分析myc-Ral A和细胞周期蛋白B的水平，要么进行免疫沉淀（IP）使用抗myc抗体，并通过免疫印迹分析myc-RalA或磷酸化S194 RalA的水平。3个实验的代表。B类使用双胸苷阻断对从HeLa细胞分离的线粒体级分（有丝分裂）和全细胞提取物（WCE）中的RalA、RalBP1和Drp1水平进行免疫印迹分析，所述HeLa细胞在有丝分裂中未同步（U）或同步（M）。3个实验的代表。C–F类使用双胸苷阻断法对HeLa细胞分离的未同步（U）或有丝分裂同步（M）的粗线粒体部分（mito）和全细胞提取物（WCE）中的RalA、RalBP1、Drp1、Cyclin B、Aurora A和Mff1水平进行免疫印迹分析，并表达C类扰码控制、RalA shRNA或RaBP1 shRNA或D类强力霉素诱导的干扰控制或Aurora A shRNAE类加扰控制或Mff1 shRNA或F类Plk1或Fis1 shRNA。3个实验的代表。
图4
图4
RalBP1促进Drp1的磷酸化。A类对表达干扰控制、RalA shRNA或RalBP1 shRNA的HeLa细胞中的S616磷酸化（p-S616-Drp1）、Drp1、RalB、RalBP和肌动蛋白水平进行免疫印迹分析。图表表示通过3个实验的imageJ测量的平均p-S616-Drp1信号强度+/-SD(**第页= 0.008).B类从HeLa细胞中分离的提取物，无论是非同步的（U）还是使用双胸腺嘧啶阻断的有丝分裂同步的（M），要么通过免疫印迹分析RalA、Drp1、cyclin B或S616磷酸化Drp1的水平，要么进行免疫沉淀（IP），不含任何抗体或针对cyclin B或RalBP1的抗体，然后用GST-Drp1和γ培养32P-ATP，并在丙烯酰胺凝胶上溶解。32磷成像仪显示P标记的GST-Drp1，考马斯亮蓝染色显示总GST-Drp1。图表示平均值32P-GST-Drp1信号强度由来自3个实验的图像J测量+/-SD(*第页=循环蛋白B为0.028，RalBP1为0.027）。C类200 ng GST-Drp1和25 ng GST-Cyclin B/Cdk1与GST-RalBP1或GST（0、125、250、500、1000 ng）以及ATP或γ32P-ATP。反应通过SDS-PAGE进行解析，并对Drp1、RalBP1和S585磷酸化的Drp1进行免疫印迹（冷激酶分析）或通过磷成像仪进行可视化（热激酶分析）。考马斯亮蓝染色（CBB）显示GST、GST-Drp1和GST-RalBP1。图表表示通过来自3个实验的图像J测量的平均p-S616-Drp1信号强度+/-SD(*第页=0.020，0.028**第页= 0.009).D类免疫印迹分析从HeLa细胞中分离的粗线粒体部分（mito）和全细胞提取物（WCE）中的RalA、RalBP1、Drp1和Cyclin B水平，采用双胸苷块进行同步有丝分裂（M），用DSP处理，并用抗RalA抗体进行免疫沉淀。
图5
图5
敲除RalA或RalBP1可防止有丝分裂诱导的线粒体分裂。A类从双胸苷阻断释放后，通过稳定表达RFP-Mito和scramble对照、RalA shRNA或RalBP1 shRNA的HeLa细胞的活细胞成像显示的线粒体形态。箭头（1，2）表示在末期保留的线粒体区域，以及（3，4）线粒体在子细胞中的分布不均（比例尺=10µm）。B类通过MitoTracker Red染色对HeLa细胞进行线粒体形态学观察，这些细胞在有丝分裂的指示阶段表达一种干扰控制、RalA shRNA或RalBP1 shRNA，并在有丝细胞分裂中使用双胸腺嘧啶核苷阻断进行同步。DAPI染色用于指定有丝分裂相（刻度条=25µm，用于超临界间期和中期，RalA间期和前期，10µm用于超临界末期和末期，RalBP1间期，7.5µm适用于所有其他图像）。C类表达RalA shRNA的线粒体形态HeLa细胞与GFP标记的野生型（WT）或S194A突变配置的shRNA抗性RalA互补，并在中期（DAPI）捕获（标尺=10µm）。D类中期显示线粒体伸长的细胞百分比定量（平均值±SD，n=3个独立实验，每个条件分析≥30个细胞）。(*第页≤ 0.05, **第页≤ 0.01)E类通过在Victor光度计上测量560nm处的ATP-依赖性荧光素酶活性，测定稳定表达craft、RalA或RalPB1 shRNA的HeLa细胞的ATP生成。（实验重复至少3次，每次从12次重复中计算误差**第页= 1.6 × 10−7对于RalA，5.3×10−7RalBP1）。F类稳定表达scramble的HeLa细胞的增殖(◆), 拉拉(■) 或RalBP1(▲) 通过MTT分析测定。在选择转基因后，使用少于5倍或大于20倍群体倍增的细胞在三天内进行测量。（实验重复至少3次，每次从16次重复中计算误差；第2天：**第页= 4.5 × 10−5对于RalA，6.3×10−5对于RalBP1，第3天：**第页= 4.5 × 10−8对于RalA，2.7×10−6RalBP1）
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中的注释

  • 耦合线粒体和细胞分裂。
    Yamano K，Youle RJ。 Yamano K等人。 自然细胞生物学。2011年9月2日；13（9）：1026-7。doi:10.1038/ncb2334。 自然细胞生物学。2011 PMID：21892144 免费PMC文章。

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