摘要
线粒体功能障碍和蛋白质的紊乱降解与帕金森病（PD）的发病机制有关。中的突变帕金和粉红色1基因是家族性PD的病因之一。PINK1是一种与线粒体相关的假定激酶，PINK1表达缺失会导致线粒体功能障碍，并随时间增加。Parkin被认为是PINK1的下游，也通过大自噬（有丝分裂）介导受损线粒体的清除。我们研究了RNAi降低PINK1表达后多巴胺能SH-SY5Y细胞的线粒体功能障碍是否部分是由于有丝分裂受到抑制。在PINK1沉默12天后，通过宏观自噬途径的流量减少与ATP合成的抑制相一致。这些细胞中parkin的过度表达恢复了自噬流量和ATP合成。过度表达和RNAi研究也表明，在CCCP诱导的线粒体损伤后，PINK1和parkin是线粒体吞噬所必需的。在3 CCCP处理h。帕金或PINK1沉默后，这些翻译后修饰减少。线粒体蛋白的泛素化似乎可以识别线粒体的降解并促进有丝分裂。因此，PINK1和parkin是去除多巴胺能细胞中受损线粒体所必需的，抑制这一途径可能导致缺陷线粒体的积聚，这可能有助于PD的发病。
简介
导致神经退行性疾病帕金森病（PD）发病机制的机制尚不清楚。线粒体功能障碍和蛋白质的错误处理/扰动降解都与多巴胺能神经元的丢失有关(1,2).
据报道，PD脑黑质线粒体电子传递链（ETC）复合物I活性缺乏(三)而复合I抑制剂，如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶和鱼藤酮，可在人类和动物模型中诱发帕金森病特征(4,5). 老年人和帕金森综合征患者黑质多巴胺能神经元线粒体DNA高水平缺失(6).
黑质幸存多巴胺能神经元中存在称为路易小体的蛋白内含物是PD的一个特征。路易小体内发现的主要蛋白是α-同核蛋白，该蛋白被泛素/蛋白酶体系统（UPS）干扰降解和/或溶酶体通过伴侣介导的自噬或大自噬被认为有助于这些内含物的形成(2). 随着年龄增长，UPS和自噬功能下降（发生PD的最大风险），自噬的抑制与包括PD在内的几种神经退行性疾病有关(2,7,8).
与家族型PD相关的基因进一步支持线粒体和蛋白质质量控制在疾病发病机制中的作用(9)特别是粉红色1,帕金和ATP13A2型分别编码线粒体靶向丝氨酸/苏氨酸激酶、E3泛素蛋白连接酶和溶酶体ATP酶的基因(10–12).
据报道，哺乳动物模型中PINK1功能的丧失会导致ETC抑制、氧化应激增加、线粒体钙稳态改变、细胞凋亡敏感性增加、多巴胺释放和突触可塑性受损(13–22). PINK1缺陷果蝇属也会导致线粒体完整性的丧失和多巴胺能神经元的丧失(23,24). PINK1和Parkin的使用果蝇属模型表明，parkin在PINK1下游起作用，以保护线粒体的完整性，并且它们在遗传上与负责线粒体分裂和融合的成分相互作用(23–26). 这些研究表明PINK1/parkin功能的丧失导致线粒体融合增加。在哺乳动物细胞模型中，PINK1/parkin在线粒体分裂和融合中的作用尚不清楚，有报道表明PINK1丢失后分裂增加(27–29)或者说裂变的增加只发生在氧化磷酸化受损之后(14,30). 相反，蛋白酶体应激后PINK1缺陷神经元的线粒体聚集增加(22).
PINK1和parkin在共同信号通路中的存在以及随后的报告表明它们直接相互作用(31,32)导致了这样一种假设，即parkin不仅参与UPS降解的细胞溶质蛋白底物的泛素化，而且还参与线粒体内稳态。帕金从细胞质转移到去极化线粒体，并通过自噬-溶酶体途径（也称为有丝分裂）促进其降解，这一发现支持了这一观点(33). 随后，已经确定PINK1是哺乳动物中parkin募集到去极化线粒体所必需的(34–35)和果蝇属单元格(36). 据报道，parkin向线粒体募集导致线粒体蛋白VDAC1泛素化(35)和丝裂原(36)哺乳动物和果蝇属细胞。
以前，我们曾报道过人类多巴胺能神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系中PINK1的沉默会导致线粒体功能障碍和氧化应激，并随着时间的推移而增加(13). PINK1缺陷的分化神经元也表现出随着时间的推移氧化应激增加，线粒体质量显著增加30 沉默后天数(16). 在两个PINK1基因敲除小鼠模型中，也报告了线粒体呼吸的逐渐抑制、异常线粒体形态的积累和氧化应激的增加(20,22). 我们的假设是，PINK1缺乏导致线粒体自噬对受损线粒体的清除减少，导致线粒体积聚，导致活性氧的产生增加，这将进一步加剧线粒体损伤。
我们在此报告，PINK1长期沉默后ATP合成的抑制与通过自噬-溶酶体途径的流量减少相关。parkin的过度表达可恢复流量和ATP合成。在急性线粒体损伤[羰基氰化物]模型中，进一步研究了PINK1和parkin在线粒体吞噬中的作用-米-氯苯肼（CCCP）耗散线粒体膜电位]。许多线粒体蛋白泛素化的增加与有丝分裂的诱导有关，包括外膜的融合因子，丝裂原融合蛋白1（MFN-1）和2（MFN-2）。PINK1或驻车制动消音后，这些翻译后修饰减少。我们的结果表明，MFN-1和MFN-2的泛素化先于受损线粒体的去除，因此是有丝分裂的早期事件。本文讨论了泛素化在促进有丝分裂中的作用，包括对线粒体分裂的假定影响，线粒体分裂是进行有丝分裂所必需的(37).
结果
此前研究表明，SH-SY5Y细胞中PINK1的沉默可抑制ATP合成(13). 由于parkin被报道位于PINK1下游，因此研究了parkin过度表达对ATP合成的影响。SH-SY5Y细胞中PINK1沉默使用与我们之前的研究结果一致的所有三种底物显著降低线粒体氧化磷酸化（图。1A；对 < 0.05) (13). 然而，随着parkin表达的增加，PINK1-silenced细胞（Park OE细胞）的氧化磷酸化并未降低。使用PINK1 siRNA序列的不同组合也获得了类似的结果(补充材料，图S1). 这些结果表明，parkin能够抵消PINK1缺陷的影响，这与parkin作用于PINK1下游一致。
图1。
12岁后ATP合成和自噬流量 PINK1沉默的日子。将PINK1 siRNA#2或对照siRNA转染SH-SY5Y细胞或Park OE细胞12天。(A类)细胞通过胰蛋白酶化获得，用洋地黄素渗透并用谷氨酸孵育+苹果酸（配合物I、III、IV），琥珀酸+鱼藤酮（配合物II、III、IV）或抗坏血酸+37°C下的TMPD（络合物IV）用于测量ATP合成。ATP通过荧光素酶测定测定，并归一化为细胞数。数据表示为对照siRNA ATP合成百分比（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 5). *对 < 0.05与对照siRNA(B类)细胞裂解物由未经处理的细胞（基底细胞）或用溶酶体抑制剂E64d和胃蛋白酶抑制素A（两者均为10 μg/ml）3 h.用LC3抗体探测蛋白质印迹，并使用抗β-肌动蛋白的抗体评估相等的蛋白质负载。测量条带密度，并将LC3-II/LC3-I比率归一化为β-肌动蛋白。数据表示为基础条件下或存在溶酶体抑制剂时对照siRNA处理细胞系的百分比(n个 = 5). *对 < 0.05与ParkSH+基本条件下的siRNA。
因为帕金被证明参与了受损线粒体的清除(33,34)研究了PINK1诱导的大细胞自噬。通过测量LC3蛋白的翻译后修饰来评估PINK1 siRNA处理12天的SH-SY5Y细胞的基本大自噬。自噬激活后，LC3经过裂解形成LC3-I，然后与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-II，然后与包裹货物的自噬体结合进行降解。在这个过程之后，通过测定LC3-II/LC3-I与β-肌动蛋白的比值，进行western blot和基础自噬测定(38). PINK1沉默后，LC3-II/LC3-I比率以及基础自噬降低了35%(对 < 0.05;n个 = 5） 与用干扰控制siRNA处理的SH-SY5Y细胞相比（图。1B） 。尽管过度表达parkin的细胞（Park OE）具有与对照细胞相似的LC3-II/LC3-I比率，但这些细胞中PINK1的敲除导致LC3-II/LC3-I比率水平更大的下降（60%）(对 < 0.05;n个 = 6） 与用对照siRNA处理过表达parkin（Park OE）的SH-SY5Y细胞相比（图。1B） 。这表明，在正常和parkin过度表达细胞中，LC3-II的稳态水平随着PINK1表达的降低而降低。
虽然LC3-II的western blot分析显示了自噬小泡的水平，但为了了解对自噬速率的影响，重要的是确定LC3-II通过自噬途径的流量是否发生了改变。为了测量通过自噬-溶酶体途径的流量，在溶酶体抑制剂胃蛋白酶抑制素A和E64d存在的情况下测量LC3-II水平(38). 在这些条件下，PINK1缺失的Park OE细胞中的LC3-II水平现在与对照相似，并且显著增加(对 < 0.05;n个 = 5） 与基础条件下PINK1扩张的Park OE细胞相比（图。1B） 。相反，与用对照siRNA处理的细胞相比，用溶酶体抑制剂处理PINK1-silenced SH-SY5Y细胞仍然导致LC3-II水平降低（图。1B） 。这些结果表明，PINK1沉默导致自噬流量减少，这一现象被parkin的过度表达所逆转。由于在过度表达parkin PINK1-sience细胞中ATP合成没有受到抑制，这意味着PINK1-Sience细胞自噬减少可能是有丝分裂受到抑制的结果，导致受损线粒体的堆积。
为了进一步研究PINK1和parkin在线粒体吞噬中的作用，我们使用了一个急性线粒体损伤模型。SH-SY5Y细胞经10 μ米CCCP消散线粒体膜电位并诱导有丝分裂，如前所述(33,34). 通过测定柠檬酸合成酶（CS）的活性来测量线粒体含量随时间的减少，后者是一种柠檬酸循环酶，用于测量细胞和组织中的线粒体质量(16,39–41). CS活性通常不受明显线粒体功能障碍（如ETC抑制）的影响(40)或者线粒体DNA的缺失(41)，前提是没有伴随的细胞死亡。因此，活性的任何变化通常都表明线粒体含量(16,39). CCCP治疗导致含有空载体的正常SH-SY5Y细胞和parkin过度表达细胞的线粒体质量显著降低(对 < 0.01;n个 ≥ 3） （图。2A） ●●●●。确认公园OE细胞在24小时后CS活性下降79% CCCP处理h是由于线粒体丢失，用western blot测定两种线粒体蛋白的蛋白水平（图。2B） 。TFAM（由细胞核编码）和MTCOII（由线粒体编码）的表达均降低。
图2。
CCCP诱导的有丝分裂需要parkin和PINK1的表达。(A类)含有空载体（SH）或Park OE细胞的SH-SY5Y细胞用载体[0.05%（v/v）乙醇]或10 μ米评估CCCP、裂解物和CS活性。数据表示为车辆处理细胞的%CS活性（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 5). *对 < 0.05与车辆和**对 < 0.01与车辆。(B类)细胞用载体或CCCP处理24小时 h、 western blot检测裂解蛋白和线粒体蛋白表达（TFAM，MTCOII）。通过检测GAPDH评估等负荷。四个单独实验的印迹代表。(C类)正常SH-SY5Y细胞（对照组）、parkin KD细胞或Park OE细胞用载体或CCCP处理16次 h、 裂解和测定CS活性。数据以nmol/min/mg蛋白质表示（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 5). *对 < 0.05与车辆和**对 < 0.01相对于车辆。(D类)用PINK1 siRNA或对照siRNA处理SH-SY5Y细胞或Park OE细胞72 h.对于最后16个 h、 细胞用载体或CCCP处理。然后测量CS活性。数据表示为nmol/min/mg蛋白质（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 5). *对 < 0.05与对照siRNA+CCCP和**对 < 0.01与对照siRNA+CCCP。
利用靶向帕金的shRNA（parkin KD；补充材料，图S2)，正常的parkin水平（对照）和过度表达parkin的细胞（Park-OE）。16岁之后 暴露于CCCP后h，随着parkin水平的增加，线粒体含量的下降有明显的进展（图。2C） ●●●●。与在帕金缺乏细胞中观察到的情况类似，72 h使用两个独立的siRNA组合部分减少了CCCP诱导的正常SH-SY5Y细胞线粒体丢失（图。三D、，对 < 0.05). 在PINK1缺失的Park OE细胞中，这一观察结果更为显著(对 < 0.01; 图。2D） 证实PINK1在parkin介导的去极化线粒体移除中起关键作用。
图3。
CCCP治疗后线粒体蛋白的泛素化。(A类)含有空载体的SH-SY5Y细胞或Park OE细胞用载体[0.05%（v/v）乙醇]或10 µ米3的CCCP h、 分离线粒体并进行western印迹。用泛素抗体检测蛋白质印迹。通过探测39个 复合物I的kDa亚单位（箭头）。四个单独实验的印迹代表。(B类)公园OE细胞接受CCCP治疗3次 h、 线粒体分离并检测VDAC1或(C类)western blot法检测抑制蛋白（PHB1）。(D类)公园OE细胞接受CCCP治疗3次 h和细胞裂解物通过western blot检测Drp1。(E类)从Park OE细胞中分离的线粒体经载体或CCCP处理3 h探测MFN-1或(F类)通过western blot检测MFN-2。翻译后修饰的蛋白质用箭头表示。非特定波段用星号表示。印迹是至少四个独立实验的代表。
Parkin是一种E3-泛素连接酶，已被建议用于受损的线粒体。为了研究这是否与特定蛋白的泛素化有关，从含有空载体的SH-SY5Y和Park OE细胞中分离出线粒体，在3 CCCP处理h。选择这个时间点是为了让parkin补充到线粒体(33,34)但在没有明显线粒体丢失的情况下（图。2A） ●●●●。CCCP处理增加了Park OE细胞线粒体蛋白的泛素化（图。三A） 在正常细胞中不明显。检测到一条分子量约为50的显著条带 千帕。这个乐队的身份未知。用western blot对包括VDAC1和probitin（图。三B和C）。CCCP处理3天后，没有检测到任何一种蛋白质的分子量较高的条带表明泛素化 h.对SH-SY5Y和Park OE细胞裂解物中LC3-II水平的分析表明，自噬-溶酶体途径在此时间点被诱导(补充材料，图S3).
线粒体分裂和融合的动力学与线粒体的更新相互关联，并受多种蛋白质的控制，包括Drp-1、MFN-1和MFN-2(37,42–44). 作为有丝分裂过程中潜在的泛素化底物，用抗Drp-1、MFN-1和MFN-2抗体检测CCCP处理的Park OE细胞的线粒体制剂。Mitofusin（也称为Marf）果蝇属据报道，MFN-1/2的同源物在CCCP治疗果蝇属S2R+电池(36). 尽管没有证据表明存在代表修饰Drp-1的条带（图。三D） ，MFN-1和MFN-2都有额外的更高分子量的谱带（图。三E和F，箭头）。这些带移与MFN-1的单泛素化一致（～8.5 kDa）和MFN-2的双泛素化（～16 kDa）。长时间暴露表明MFN-1有更多的高分子量带（图。三E） 这表明MFN-1在有丝分裂诱导时确实经历了多种泛素化修饰。
CCCP处理后，含有空载体的SH-SY5Y细胞中也发生了MFN-1和MFN-2的假定泛素化（图。4A） ●●●●。时间进程表明，MFN-1和MFN-2的假定泛素化与含有空载体的SH-SY5Y细胞的细胞裂解液不同（图。4A） 与Park OE电池（图。4B） 。值得注意的是，当细胞裂解物用于western blot时，MFN-1的多个翻译后修饰物种很难与非特异性带区分。因此，仅显示假定的单泛素化MFN-1和双泛素化的MFN-2蛋白质。对于MFN-1和MFN-2，推测的泛素化在1 在Park OE细胞中CCCP处理h，然后随着时间的推移而减少（图。4B类；补充材料，图S4A和图S4B). 带密度分析和泛素化MFN-1或MFN-2（MFN-1/2 ubq）与总MFN-1和MFN-2水平（未修改）之比的计算+泛素化MFN-1/2）证实了这一观察结果(补充材料，图S5). 在另一个过度表达parkin的SH-SY5Y克隆中观察到类似的趋势(补充材料，图S4F). 在含有空载体的SH-SY5Y细胞中，MFN-1和MFN-2的假定泛素化需要更长时间达到峰值（2 h） 3次后没有明显下降 h（图。4A；补充材料，图S4A、B和S5). 短期暴露表明，未经修饰的MFN-1和MFN-2的蛋白质水平随着时间的推移而降低，特别是在Park OE细胞中(补充材料，图S4A和B). 线粒体蛋白琥珀酸脱氢酶亚基A（SDHA）的western blotting测定表明，这些样品中的线粒体含量没有明显下降。此前，在3个月后从Park OE细胞分离的线粒体中检测到翻译后修饰的MFN-1和MFN-2 CCCP处理h（图。三E和F）。含空载体的SH-SY5Y细胞与Park OE细胞分离的线粒体比较 CCCP处理h后证实，在此时间点，Park OE细胞中MFN-1和MFN-2的假定泛素化低于含有空载体的SH-SY5Y细胞(补充材料，图S4D和E).
图4。
CCCP治疗后MFN-1和MFN-2的泛素化。(A类)包含空矢量或(B类)公园OE细胞用10 µ米0–3的CCCP h、 制备细胞裂解物，并使用MFN-1和MFN-2抗体通过western blot评估MFN-1及MFN-2翻译后修饰。用抗线粒体蛋白SDHA的抗体对印迹物进行再验证，以评估每个裂解物中的线粒体含量。(C类)从含有载体或10的空载体的SH-SY5Y细胞中分离出线粒体 µ米2的CCCP h.通过蛋白质印迹从线粒体部分和泛素化物种中免疫沉淀内源性MFN-1。然后用MFN-1抗体对印迹进行再验证。(D类)MFN-2从线粒体组分中免疫沉淀，并如上所述检测到泛素化。印迹是至少三个独立实验的代表。无所不在的物种用箭头表示。
为了证实CCCP治疗后观察到的翻译后修饰是泛素化，MFN-1和MFN-2从线粒体和泛素化蛋白中免疫沉淀，并通过western blot检测。根据之前的发现（图。三E和F），免疫沉淀MFN-1的样品显示了几种更大的分子量（图。4C） 而免疫沉淀MFN-2表明两种分子量增加（图。4D） ●●●●。从CCCP处理的细胞分离出的线粒体中仅检测到泛素化MFN-1和MFN-2物种。用MFN-1和MFN-2抗体证实了免疫沉淀的特异性（图。4C和D）。这些抗体也检测到分子量增加的MFN-1和MFN-2物种，其模式类似于泛素抗体探测的印迹。这些结果表明MFN-1受到多种泛素化修饰。还检测到两种泛素化物种的内源性MFN-2（图。4D） ●●●●。用MFN-2抗体对印迹进行重复免疫，最初发现了双双蛋白物种。较长时间的接触表明，也检测到了三倍体物种(补充材料，图S6).
为了证实MFN-1和MFN-2的泛素化是parkin依赖性的，用10 μ米2的CCCP 检测MFN-1的细胞裂解物的h和western印迹（图。5A） 和MFN-2（图。5B） 。帕金缺乏细胞中翻译后修饰的MFN-1和MFN-2的强度降低。MFN-1和MFN-2在2后的泛素化 如CS活性所示，在含有空载体的SH-SY5Y细胞中的h先于线粒体的显著损失（图。2A） 和同等水平的SDHA（图。5A和B）。
图5。
MFN-1和MFN-2的泛素化需要Parkin和PINK1。(A类)对照或Parkin KD细胞用载体或CCCP处理2 h、 制备的细胞裂解物和MFN-1或(B类)使用MFN-1和MFN-2抗体通过western blot评估MFN-2的泛素化。(C类)SH-SY5Y细胞未经转染（UT），转染PINK1 siRNA#1或PINK1siRNA#2或转染对照siRNA 72 h.然后用10 µ米2的CCCP h、 制备细胞裂解物并用western blot分离。用MFN-1抗体或(D类)MFN-2。用SDHA抗体对斑点进行线粒体含量的再验证。印迹是至少三个独立实验的代表。无所不在的物种用箭头表示。
自从PINK1被建议招募帕金去极化线粒体以来(34)并能在PINK1沉默后抑制SH-SY5Y细胞的有丝分裂（图。2D） 我们研究了PINK1的沉默是否降低了MFN-1和MFN-2的parkin依赖性泛素化。未转染含有空载体的SH-SY5Y细胞（UT），转染PINK1 siRNA#1或PINK1siRNA#2或对照siRNA 72 h.然后用10 μ米2的CCCP h.MFN-1泛滥成灾（图。5C） 或MFN-2（图。5D） 在未转染细胞和转染对照siRNA的细胞中诱导。然而，当用PINK1 siRNA组合处理时，MFN-1和MFN-2的泛素化显著降低。这些结果表明，MFN-1和MFN-2的泛素化需要PINK1。
讨论
线粒体功能障碍和蛋白质代谢受损与PD发病机制有关。在本文中，我们报道了PINK1和parkin参与多巴胺能细胞受损线粒体的降解。PINK1沉默对该途径的干扰导致线粒体功能障碍和基础自噬流量降低。parkin的过度表达恢复了自噬流量和线粒体ATP合成，这表明在一些PINK1细胞和动物模型中观察到的线粒体功能障碍至少部分与线粒体吞噬功能受损有关。大量线粒体蛋白在有丝分裂诱导后很快发生泛素化。MFN-1和MFN-2是这两种蛋白质，它们的泛素化依赖于PINK1和parkin的存在。
在多种细胞模型中，PINK1和parkin参与CCCP诱导的有丝分裂(33–36,45). 与我们的发现一致，线粒体蛋白在诱导有丝分裂时泛素化已经被观察到(45,46)包括哺乳动物细胞中的VDAC(35)和丝裂原果蝇属(36). 哺乳动物细胞有两种丝裂原融合蛋白，MFN-1和MFN-2，在本报告中，我们观察到这两种蛋白在CCCP治疗后都是泛素化的。据作者所知，这是人类丝裂原融合蛋白共价修饰的首次报道。MFN-1和MFN-2翻译后修饰的速度相似；然而，泛素化的模式似乎有所不同。这两种蛋白的泛素化依赖于parkin和PINK1。这些发现与齐维亚尼一致等. (36)世卫组织报告称果蝇属同源的丝裂原融合蛋白导致一个、三个或四个泛素加合物的增加。在PINK1沉默后，parkin的过度表达也恢复了丝裂原融合蛋白泛素化的降低(36). 免疫沉淀研究表明帕金与丝裂原结合果蝇细胞(36)即使在基本条件下(47). 在后一项研究中，发现丝裂原被三个泛素部分修饰，并且依赖PINK1和parkin(47). 尽管哺乳动物和果蝇属MFN-1和MFN-2的泛素化是parkin依赖性的细胞，在体外需要用重组/纯化蛋白进行泛素化研究，以明确证实MFN-1和MFN-2是帕金的直接底物。事实上，尚不清楚本文和其他文献报道的CCCP治疗后泛素化的大量线粒体蛋白的程度(46)是parkin或其他细胞溶质或线粒体泛素连接酶（如MARCH5和MULAN）激活的直接结果(48).
连接的类型和添加到特定货物中的泛素部分的数量决定了底物是否注定要被蛋白酶体或自噬降解(49,50). 通常，泛素通过Lys48连接的多泛素化将蛋白质靶向蛋白酶体，而单泛素化或寡聚Lys63连接的泛素链将蛋白质靶指向溶酶体。越来越多的证据表明，蛋白质的泛素化也可能影响蛋白质的功能，类似于其他翻译后修饰，如磷酸化(44,48). 因此，泛素化的类型和线粒体蛋白的功能很可能决定了它们在介导有丝分裂中的作用。还需要进一步的工作来确定MFN-1和MFN-2的翻译后修饰是由于多泛素化还是多个单泛素化事件。MFN-1和MFN-2的泛素化可能作为标签来识别受损的线粒体(51,52)并募集泛素结合自噬受体p62和HDAC6(34,46)以及随后的自噬体成分，如LC3-II(49).
为了发生有丝分裂，线粒体网状网络首先需要经历裂变(37). 一个吸引人的假设是，MFN-1和MFN-2的泛素化可以通过促进蛋白酶体降解这些蛋白质或通过物理干预线粒体间MFN二聚体的形成来阻止线粒体融合(51,52). 酵母同源物Fzo1的降解依赖于UPS(53). 此外，PINK1或parkin丢失果蝇属导致丝裂原的丰度增加(36,47). 未修饰的MFN-1和MFN-2蛋白水平在3 CCCP治疗h后，线粒体数量显著减少。这可能表明有丝分裂素被蛋白酶体降解，或者部分有丝分裂蛋白经历了多次泛素化事件。应该注意，MFN-2被两个或三个泛素分子修饰，而蛋白酶体降解蛋白质通常需要四个以上(54). 在以后的时间点，MFN-1和MFN-2蛋白水平的下降很难解释，因为尚不清楚这是否是由于蛋白酶体降解和/或线粒体吞噬导致整个线粒体丢失所致。
鉴于MFN-1/2在上述有丝分裂中的假定作用，需要根据CCCP或百草枯诱导的有丝分裂来评估线粒体形态和动力学分析(33,36)在PINK1/parkin缺失或存在的情况下。12天PINK1沉默细胞模型需要进行类似的研究。此前，PINK1瞬时转染12天后，线粒体网络没有明显变化（即线粒体网络大规模断裂）(13)，与其他型号不同(27,29). 更多的定量分析，如线粒体分支和形状因子的变化，可能表明裂变/融合是否在我们的细胞模型中受到影响。
除了促进线粒体融合外，MFN-2还可引起其他几种细胞过程，其中两种可能与有丝分裂有关。首先，MFN-2连接线粒体和内质网(55)为了发生有丝分裂，有必要切断这种联系。最近，MFN-2也被发现是线粒体运输所必需的，并与Miro/Milton复合物相互作用(56). 注定要降解的线粒体需要运输到溶酶体/聚集体。
未发现Drp-1泛素化，这与以前的报告一致(36,47). 事实上，Drp1的泛素化被认为对裂变有负面调节作用(44,48)如果加以修饰，就会阻碍有丝分裂。值得注意的是，Drp1的sumoylation促进了裂变(48). 虽然PINK1/parkin介导的有丝分裂侧重于泛素化，但在PINK1/parkin途径中还需要研究其他有丝分裂蛋白翻译后调控手段（sumoylation，phosphalization）。
除了在有丝分裂中的作用外，还应考虑PINK1和parkin在整体巨自噬中的作用。据报道，PINK1可增强基础和饥饿诱导的自噬，并与自噬前蛋白Beclin-1相互作用(57). 因此，PINK1沉默后，我们在SH-SY5Y细胞中观察到的自噬流量减少可能不是完全由于有丝分裂受到抑制。我们还发现，饥饿时过度表达parkin的SH-SY5Y细胞的自噬诱导作用（LC3-II水平）大于含有空载体的SH-SY5Y细胞。最近的一项研究报告称，RNAi对PINK1的稳定敲除激活了自噬/有丝分裂(28). 然而，根据此处和其他人报告的结果(33–36)parkin在该细胞模型中的过度表达确实增加了有丝分裂。也许，哺乳动物细胞中PINK1的慢性敲除激活了补偿性通路，能够在缺乏PINK1蛋白的情况下促进有丝分裂，这表明其他蛋白质可以招募parkin来去极化线粒体。PINK1.的稳定敲除也导致线粒体网络的显著断裂(28)PINK1瞬时转染12天后，我们没有观察到这种情况(13). 因为分裂是有丝分裂所必需的(37)，也许这也是稳定敲低模型中线粒体自噬的驱动力(28).
在有丝分裂后的细胞（如神经元）中，有丝分裂可能特别重要，因为功能失调的线粒体的破坏作用不能像增殖细胞那样在细胞分裂时被稀释。相反，受损的线粒体会积聚，导致能量缺乏和氧化应激加剧。这些事件将进一步损害线粒体和其他大分子，造成越来越严重的损害。线粒体性能和有效的蛋白质降解都随着年龄的增长而降低。衰老是帕金森病的最大风险因素。值得注意的是，与对照组或阿尔茨海默病患者的大脑相比，伴侣介导的自噬标记物（α-突触核蛋白降解的主要途径）在帕金森病患者的黑质和杏仁核中减少(58). 老年人和帕金森综合征患者的黑质多巴胺能神经元也出现高水平线粒体DNA缺失(6). PINK1缺乏的动物和细胞模型显示线粒体损伤和氧化应激随时间增加(13,20,22). 我们已经证明，通过parkin恢复PINK1诱导细胞的自噬可以逆转ATP合成抑制，MFN-1和MFN-2的泛素化在PINK1/parkin介导的有丝分裂中发挥作用。
材料和方法
细胞培养
人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y在1:1（v/v）DMEM（无葡萄糖）：F12（Ham）培养基（0.9）中培养 g/l葡萄糖最终浓度）补充10%胎牛血清，1 米米丙酮酸和青霉素-链霉素。还使用了含有空载体或parkin cDNA（Park OE；带有血凝素标记的pcDNA 3.1载体；Invitrogen）的SH-SY5Y细胞(13). 为了产生具有组成性帕金沉默（parkin KD细胞）的SH-SY5Y，用编码parkin shRNA（5′-CACCUGAUCAACAAUUCttcaagagaATTTGCGATCAGTGGC）的shRNA载体（psi STRIKE；Promega）转染细胞-3′）和通过抗抗生素G418筛选出的稳定克隆。将空载体、Park OE和Parkin KD细胞培养在上述补充20 μg/ml G418。
PINK1 siRNA瞬时转染SH-SY5Y细胞
SH-SY5Y细胞或SH-SY5 Y过度表达parkin（1.8 × 105细胞/ml）用两对不同的PINK1 siRNA转染[10 nM；PINK1#1（护法）或PINK1#2（奇根）]或10 n个米使用HiPerfect转染试剂（Qiagen）扰乱控制siRNA（Ambion）。如前所述，72天后PINK1 mRNA水平下降约80% 用任一对PINK1 siRNA沉默h(13). 每3天用siRNA转染细胞，最多12天。
CS活动
用10进行治疗后 μ米CCCP中，细胞用PBS清洗一次，并在添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS中0.25%（v/v）Triton X-100的平板上裂解。通过离心去除碎屑，然后在分光光度计中氧化5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸），测量CS活性（412的吸光度 nm）在30°C下，在乙酰辅酶A和草酰乙酸存在下随时间变化(59). 使用BCA蛋白质测定法（Pierce）测量相同等分样品中的蛋白质浓度，酶活性以nmol/min/mg蛋白质表示。
蛋白质印迹
用胰蛋白酶采集SH-SY5Y细胞，并在添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS中的1%（v/v）Triton X-100中的冰上裂解。Triton®声波风廓线仪可溶部分（10 μg）通过SDS–PAGE进行解析，并转移至Hybond P（GE Healthcare）。用39种 复合物I的kDa亚基（克隆20C11；线粒体）、β-肌动蛋白（ab8227；Abcam）、GAPDH（克隆6C5；Abcam）、LC3（cat.#2775；细胞信号技术）、SDHA（克隆2E3；线粒体，Drp1（也称为DLP1；克隆8/DLP1；BD Biosciences）和TFAM（克隆K-18，Santa Cruz Biotechnology）。兔抗MFN-1（DUP抗体）和MFN-2（CT抗体）的多克隆抗体先前已有描述(60,61). 用相应的辣根过氧化物酶连接二级抗体（Dako）和增强化学发光（Pierce）检测条带。谱带密度由AlphaDigiDoc软件测定。
线粒体的分离
CCCP处理后，SH-SY5Y细胞（>30 × 106细胞），在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS中洗涤，并在分离培养基（250 米米蔗糖，1 米米乙二胺四乙酸（EDTA），10 米米Tris，pH 7.4，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。通过离心法去除细胞核（1500克)线粒体在11岁时粒化 800克并重新悬浮在隔离介质中。
MFN-1和MFN-2的免疫沉淀
从含有载体（乙醇）或10 μ米2的CCCP h.线粒体在添加蛋白酶抑制剂、MFN-1或MFN-2抗体的PBS中以0.5%（v/v）Triton X-100溶解，并在4°C下旋转2 h.然后添加蛋白质A琼脂糖（GE Healthcare），并将混合物在4°C下再旋转1.5 h.用1%（w/v）BSA在PBS中洗涤抗体结合珠三次，用PBS洗涤两次，然后再悬浮在含有0.1的2×Laemmli缓冲液中 米DTT公司。然后用SDS-PAGE分离上清液，并转移到HybondP进行蛋白质印迹。
ATP合成测定
用PINK1 siRNA或干扰siRNA处理SH-SY5Y细胞或过度表达parkin的SH-SY5细胞12天，用胰蛋白酶收集细胞，用洋地黄素和ATP合成进行渗透，在电子供体谷氨酸和苹果酸（复合物I、III、IV）、琥珀酸和鱼藤酮（复合物II、III、Ⅳ）或抗坏血酸和N个,N个,N个',N个'-四甲基-对-如前所述的苯二胺（TMPD；络合物IV）(13). 使用ATP生物发光检测试剂盒HSII（Roche）对检测中合成的ATP进行定量。数据表示为pmoles ATP合成/min/105细胞。从数据中减去无底物合成的ATP。
统计分析
数据表示为平均值 ± 单独实验的SEM(n个). 统计显著性由双尾确定t吨-测试或单向方差分析，然后在适当的情况下进行Tukey HSD测试。
补充材料
HMG在线提供补充材料。
利益冲突声明。未声明。
基金
这项工作由大脑研究信托基金会、威康/MRC帕金森病联合会向伦敦大学学院/神经病学研究所、谢菲尔德大学和邓迪大学MRC蛋白磷酸化部门以及卡坦信托基金会资助。
工具书类
1
(
2010
)帕金森病的分子和临床前驱症状：对治疗的意义
。Nat.Rev.Neurol公司。
,6
,309
–317
。 2
(
2010
)蛋白质降解、聚集和错误折叠
。压敏电阻。迪索德。
,25
,49岁
–第54页
。 三
(
1989
)帕金森病患者线粒体复合物I缺乏
。柳叶刀
,1
,1269
。 4
(
2008
)线粒体在帕金森病发病机制中的作用
。柳叶刀神经病学。
,7
,97
–109
。 5
(
2000
)慢性全身接触农药再现了帕金森病的特征
。自然神经科学。
,三
,1301
–1306
。 6
等(
2006
).衰老和帕金森病患者黑质神经元线粒体DNA高水平缺失
。自然基因。
,38
,515
–517
。 7
(
2005
)自噬及其在神经系统疾病、损伤和修复中的可能作用
。自噬
,1
,11
–22
。 8
(
2008
)自噬溶酶体途径在帕金森病相关神经变性中的作用
。大脑
,131
,1969
–1978
。 9
(
2006
)帕金森病线粒体功能障碍的深入研究
。神经科学自然评论。
,7
,207
–219
。 10
等(
2004
)PINK1突变引起的遗传性早发性帕金森病
。科学
,304
,1158
–1160
。 11
等(
2000
)家族性帕金森病基因产物parkin是一种泛素蛋白连接酶
。自然遗传学。
,25
,302
–305
。 12
等(
2006
)遗传性痴呆性帕金森综合征是由编码溶酶体5型P型ATP酶的ATP13A2突变引起的
。自然遗传学。
,38
,1184
–1191
。 13
(
2009
)PINK1表达沉默对多巴胺能细胞线粒体DNA和氧化磷酸化的影响
。公共科学图书馆
,4
,e4756（电子4756）
。 14
(
2009
)PINK1无义和错义突变对线粒体功能和形态的差异影响
。实验神经学。
,219
,266
–273
。 15
等(
2006
)PARK6线粒体功能障碍、过氧化损伤和谷胱甘肽代谢变化
。神经生物学。数字化信息系统。
,25
,401
–411
。 16
等(
2008
)PINK1是人类多巴胺能神经元长期存活和线粒体功能所必需的
。公共科学图书馆
,三
,e2455型
。 17
等(
2009
)PINK1相关帕金森病是由神经元对钙诱导的细胞死亡的易感性引起的
。分子细胞。
,33
,627
–638
。 18
(
2009
)突变体Pink1通过干扰钙流诱导帕金森病神经元细胞模型线粒体功能障碍
。神经化学杂志。
,108
,1561
–1574
。 19
(
2007
)隐性帕金森病相关PINK1突变体在抑制线粒体细胞色素释放方面存在缺陷c（c）
。神经生物学。数字化信息系统。
,28
,216
–226
。 20
(
2008
)PINK1缺失导致线粒体功能缺陷和对氧化应激的敏感性增加
。程序。美国国家科学院。科学。美国
,105
,11364
–11369
。 21
(
2007
)PINK1缺陷小鼠纹状体多巴胺释放和突触可塑性受损
。程序。美国国家科学院。科学。美国
,104
,11441
–11446
。 22
等(
2009
)在缺乏PINK1的老年小鼠中，帕金森氏症表现型伴随着渐进性线粒体功能障碍而无神经退行性变
。公共科学图书馆
,4
,e5777型
。 23
等(
2006
)线粒体功能障碍果蝇属PINK1突变体与派金相辅相成
。自然
,441
,1157
–1161
。 24
(
2006
)果蝇属pink1是线粒体功能所必需的，与parkin在基因上相互作用
。自然
,441
,1162
–1166
。 25
(
2008
)PINK1/Parkin通路调节线粒体形态
。程序。美国国家科学院。科学。美国
,105
,1638
–1643
。 26
(
2008
)Pink1通过与裂变/融合机制的相互作用调节线粒体动力学
。程序。美国国家科学院。科学。美国
,105
,7070
–7075
。 27
等(
2007
)人类PINK1功能丧失导致线粒体病理改变，可通过帕金治疗
。《神经科学杂志》。
,27
,12413
–12418
。 28
(
2009
)PINK1功能丧失通过影响氧化应激和线粒体分裂促进有丝分裂
。生物学杂志。化学。
,284
,13843
–13855
。 29
等(
2009
)parkin或PINK1功能的丧失增加了依赖于Drp1的线粒体断裂
。生物学杂志。化学。
,284
,22938
–22951
。 30
等(
2009
)动力蛋白相关蛋白1的钙调神经磷酸酶依赖性去磷酸化影响PINK1缺陷细胞的线粒体改变
。公共科学图书馆
,4
,电子5701
。 31
(
2010
)帕金森病相关激酶PINK1对parkin的磷酸化激活parkin E3连接酶功能和NF-kappaB信号
。嗯，分子遗传学。
,19
,352
–363
。 32
(
2009
)Parkin通过直接互动稳定PINK1
。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。
,383
,331
–335
。 33
(
2008
)帕金被选择性地招募到受损的线粒体并促进其自噬
。《细胞生物学杂志》。
,183
,795
–803
。 34
等(
2010
)线粒体吞噬过程中PINK1依赖性Parkin的募集
。程序。国家科学院。科学。美国
,107
,378
–383
。 35
(
2010
)PINK1/Parkin介导的有丝分裂依赖于VDAC1和p62/SQSTM1
。自然细胞生物学。
,12
,119
–131
。 36
(
2010
)果蝇属Parkin需要PINK1进行线粒体易位和泛素化Mitofusin
。程序。美国国家科学院。科学。美国
,107
,5018
–5023
。 37
等(
2008
)分裂和选择性融合通过自噬控制线粒体分离和消除
。EMBO J。
,
27
,433
–446
。 38
等(
2008
)高等真核生物自噬监测分析的使用和解释指南
。自噬
,4
,151
–175
。 39
(
2004
)脓毒症大鼠心脏的代谢功能障碍和线粒体耗竭
。分子细胞杂志。心脏病。
,36
,141
–150
。 40
(
2007
)线粒体复合体IV的抑制导致二级丢失复合体II–III活性：对线粒体脑肌病发病机制和治疗的影响
。线粒体
,7
,284
–287
。 41
(
1995
)呼吸缺陷型人成纤维细胞线粒体DNA复制缺陷
。生物化学。J。
,305
,817
–822
。 42
(
2009
)粒体自噬
。生物芯片。生物物理学。学报
,1793
,1508
–1515
。 43
(
2010
)线粒体融合蛋白：形态和代谢的双重调节因子
。塞明。细胞发育生物学。
,。 44
等(
2006
)一种新的线粒体泛素连接酶在线粒体动力学中起关键作用
。欧洲工商管理硕士J
.,25
,3618
–3626
45
等(
2010
)通过线粒体去极化稳定的PINK1使Parkin恢复受损线粒体并激活潜伏Parkin进行有丝分裂
。《细胞生物学杂志》。
,189
,211
–221
。 46
(
2010
)parkin致病突变损害线粒体泛素化、聚集和HDAC6依赖性有丝分裂
。《细胞生物学杂志》。
,189
,671
–679
。 47
(
2010
)线粒体融合促进因子丝裂原是PINK1/parkin通路的底物
。公共科学图书馆
,5
,电子10054
。 48
(
2008
)泛素依赖和独立的线粒体蛋白质质量控制：在衰老和神经退行性疾病中的意义
。摩尔微生物。
,70
,1334
–1341
。 49
(
2009
)泛素在选择性自噬中的作用
。分子电池
,34
,259
–269
。 50
(
2010
)Parkin介导的泛素信号在攻击性形成和自噬中的作用
。生物化学。社会事务处理。
,38
,144
–149
。 51
(
2009
)PINK1/Parkin通路：线粒体质量控制系统？
生物能源杂志。生物膜。
,41
,499
–503
。 52
(
2010
)Parkin介导的丝裂原泛素化如何促进有丝分裂
?自噬
,6
,660
–662
。 53
(
2008
)线粒体融合关键调节因子丝裂原融合蛋白的泛素-蛋白酶体依赖性降解
。分子生物学。单元格
,19
,2457
–2464
。 54
(
2009
)蛋白质降解和加工的蛋白酶体系统
。生物化学（Mosc.）
,74
,1411
–1442
。 55
克里希南（Satpute Krishnan）
第页。
(
2010
)饥饿期间线粒体为自噬体生物生成提供膜
。单元格
,141
,656
–667
。 56
(
2010
)丝裂霉素2是轴突线粒体运输所必需的，并与Miro/Milton复合体相互作用
。《神经科学杂志》。
,30
,4232
–4240
。 57
等(
2010
)帕金森相关蛋白PINK1与Beclin1相互作用并促进自噬
。细胞死亡不同。
,17
,962
–974
。 58
(
2010
)帕金森病患者脑内伴侣介导的自噬标记物异常
。架构（architecture）。神经醇。
,。 59
(
1976
)突触体线粒体的制备及其性质
。生物化学。J。
,154
,423
–432
。 60
(
2006
)DFO诱导的细胞衰老中细长巨型线粒体的形成：通过调节Fis1参与增强融合过程
。《细胞生理学杂志》。
,209
,468
–480
。 61
(
2002
)跨膜GTPase Fzo的哺乳动物同源物丝裂原融合蛋白的膜拓扑结构和线粒体靶向性
。细胞科学杂志。
,115
,1663
–1674
。
©作者2010。牛津大学出版社出版
这是一篇根据知识共享署名非商业许可条款发布的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0)它允许在任何媒体上无限制地进行非商业性使用、分发和复制，前提是正确引用了原始作品。
![CCCP诱导的有丝分裂需要parkin和PINK1的表达。（A） 含有空载体（SH）或Park OE细胞的SH-SY5Y细胞用载体[0.05%（v/v）乙醇]或10 μm CCCP、裂解和CS活性评估。数据表示为车辆处理细胞的%CS活性（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 5). *对 < 0.05与车辆和**P < 0.01与车辆。（B） 细胞用载体或CCCP处理24小时 h、 裂解和通过蛋白质印迹评估线粒体蛋白表达（TFAM、MTOII）。通过检测GAPDH评估等负荷。四个单独实验的印迹代表。（C） 正常SH-SY5Y细胞（对照组）、parkin KD细胞或Park OE细胞用载体或CCCP处理16次 h、 裂解和测定CS活性。数据以nmol/min/mg蛋白质表示（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 5). *对 < 0.05与车辆和**P < 0.01与车辆。（D） 用PINK1 siRNA或对照siRNA处理SH-SY5Y细胞或Park OE细胞72 h.对于最后16个 h、 细胞用载体或CCCP处理。然后测量CS活性。数据表示为nmol/min/mg蛋白质（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 5). *对 < 0.05与对照siRNA+CCCP和**P < 0.01与对照siRNA+CCCP。](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/hmg/19/24/10.1093_hmg_ddq419/1/m_ddq41902.jpeg?Expires=1717630767&Signature=ZY7AsJpp8hGUq~Zik0XX27oLSN~xpo9ucr2RBZyJAD2uw5n74fNlL5LRgBPc8K8O3dGcKPo67VIJ3VCEGyd3gEKu5hBbduKnw8NLBj28bQejiZIUI6NisWc5ROkdBT-ROjFzdahQVmUL~LRrbjH6Pg7POWT33s6AptQCR1ClwLVbVVUBA1oBlxj9Ugw9Fa1fF~Z4R7pcbY4IQsdZzCSUx-cQ3XVMUiAn8wi6J5VdSMSF4WX9fmv35ygo~pxaB8Hjfs3zOOK8McvZiHD7Oki7HIGEqFgm14ROsyTHfjqwNwU0NoY~Jizkl-lQRfdjBnwOM1GQh8CRIvpIP6xtad-TYw__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
![CCCP治疗后线粒体蛋白的泛素化。（A） 含有空载体的SH-SY5Y细胞或Park OE细胞用载体[0.05%（v/v）乙醇]或10 3的µm CCCP h、 分离线粒体并进行western印迹。用泛素抗体检测蛋白质印迹。通过探测39个 复合物I的kDa亚单位（箭头）。四个单独实验的印迹代表。（B） 公园OE细胞接受CCCP治疗3次 h、 分离线粒体并用western blot检测VDAC1或（C）抑制素（PHB1）。（D） 公园OE细胞接受CCCP治疗3次 h，并通过蛋白质印迹检测细胞裂解物中的Drp1。（E） 从Park OE细胞中分离的线粒体经载体或CCCP处理3 用western blot检测h中的MFN-1或（F）MFN-2。翻译后修饰的蛋白质用箭头表示。非特定波段用星号表示。印迹代表了至少四个独立的实验。](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/hmg/19/24/10.1093_hmg_ddq419/1/m_ddq41903.jpeg?Expires=1717630767&Signature=FbcUI0dP0Ad1O8ka8owJ-9K-sW~1WmwRa~oV-HkmZTKbPgH3fqOYrY5W-p2uysQbACy-IJ0ebpBEWpS~THJKu4ck94l3q0rqS5QmbbreZqd9pfC1Tce-TahL1LkSCwbWZQWlbeFhwknGCVVwqVjrpM5p~R5cfOIPMtam5Ca2zITigojXreWXq-QNgjuymLFsJRIMg1KwTsExrVN0DG6TE2Ch1vUq8Ilt2fXqxf80xT28eNRw8kmDKeX2jfHwsLMCxQEgvFpJscJBZnzttByXSpDfTo0lwBq0zl4SBX5gA6CfQKIMyawQdXh0HFiep58oSu8E7-koFfI4PWN4CluWFA__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
