The mitochondrial fusion-promoting factor mitofusin is a substrate of the PINK1/parkin pathway

doi:10.1371/journal.pone.0010054

.2010年4月7日；5（4）：e10054。

doi:10.1371/journal.pone.0010054。

线粒体融合促进因子丝裂原是PINK1/parkin通路的底物

安吉拉·C·普尔¹, 露丝·E·托马斯, Selina Yu女士, 伊芙琳·S·文科, 利奥·帕兰克

附属机构

PMID： 20383334
预防性维修识别码：项目经理2850930
DOI（操作界面）： 10.1371/journal.pone.0010054

线粒体融合促进因子丝裂原是PINK1/parkin通路的底物

安吉拉·C·普尔等。公共科学图书馆一号. 2010.

.2010年4月7日；5（4）：e10054。

doi:10.1371/journal.pone.0010054。

作者

安吉拉·C·普尔¹, 露丝·E·托马斯, Selina Yu女士, 伊芙琳·S·文科, 利奥·帕兰克

隶属关系

¹美国华盛顿州西雅图华盛顿大学基因组科学系。

PMID： 20383334
预防性维修识别码：项目经理2850930
DOI（操作界面）： 10.1371/journal.pone.0010054

摘要

PINK1或parkin基因的功能丧失突变导致隐性遗传型帕金森综合征。对果蝇PINK1和parkin同源基因的遗传研究表明，PINK1-一种线粒体靶向的丝氨酸/苏氨酸激酶，作用于parkin上游，parkin是一种细胞溶质泛素蛋白连接酶，促进线粒体断裂，尽管PINK1/Parkin途径促进线粒体断裂的分子机制尚不清楚。我们验证了PINK1和Parkin通过靶向线粒体形态发生机制的核心成分进行泛素化来促进线粒体断裂的假设。我们报告称，线粒体融合促进因子线粒体线粒体线粒体融合蛋白（dMfn）的稳态丰度与果蝇PINK1和Parkin的活性呈负相关。我们进一步报道，dMfn以PINK1和Parkin依赖的方式泛素化，并且dMfn-与Parkin共同免疫沉淀。相比之下，PINK1或Parkin的扰动并不影响线粒体裂变促进因子Drp1或线粒体融合促进因子Opa1的稳态丰度，或Drp1的亚细胞分布。我们的研究结果表明，dMfn是PINK1/Parkin途径的直接底物，PINK1和Parkin突变导致的线粒体形态改变和组织退化表型至少部分是泛素介导的dMfm周转减少的结果。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。Western blot分析显示识别果蝇dMfn、Opa1和Drp1的抗血清的特异性。**
（A） wt苍蝇和表达*UAS-dmfn-RNAi公司^维也纳*或*UAS-dmfn-RNAi公司^郭*靶向*dmfn公司*用抗dMfn抗血清对该基因进行western blot分析。这个*hsp70-GAL4型*驱动程序用于诱导*dmfn-RNAi公司*在3小时热休克方案后24至48小时收集转基因和苍蝇进行分析。箭头表示dMfn带在94 kDa的位置。星号（*）表示在80 kDa和110 kDa处检测到两个非特异性带。（B） wt苍蝇的蛋白质提取物*UAS-Opa1-FLAG公司*转基因与中胚层特异性*24B-镀锌4*驾驶员，以及承载*UAS-opa1RNAi公司*转基因与肌肉特异性*dmef2-GAL4*驾驶员用抗Opa1抗血清进行了western blot分析。（C） wt苍蝇的蛋白质提取物，携带*UAS-Drp1-HA公司*转基因与肌肉特异性*dmef2-GAL4*驾驶员和苍蝇杂合*Df（2L）Excel6008*删除染色体（删除*drp1（数字参考1）*基因）用亲和纯化的抗Drp1抗血清进行western blot分析。

**图2。的扰动*粉红色1*和*停车场*特别影响dMfn丰度。**
雄性体重（m）的蛋白质提取物，*粉红色1^B9公司*半合子男性、wt男性和女性（m和f）以及*公园²⁵*雄性和雌性用亲和纯化抗dMfn抗血清（A）、抗Opa1抗血清（C）、亲和纯化的抗Drp1抗血清、抗复合Vβ抗血清（A，C，D）、抗VDAC抗血清（甲，丙，D）和抗肌动蛋白抗血清（乙，丙，丁）进行western blot分析。（A）中的箭头表示dMfn带在94 kDa处的位置，星号（*）表示非特定带。（B） dMfn丰度的量化*粉红色^B9公司*和*公园²⁵*相对于wt控制的空突变体。因为*粉红色1^B9公司*雄性不育*粉红色1*基因存在于X染色体上，我们只能产生男性*粉红色1^B9公司*突变体，因此使用wt雄性作为这些突变体的控制种群。每个分析样品的dMfn与肌动蛋白丰度之比由三个独立的印迹获得；将wt对照的比率设置为1，并将突变比率标准化为wt比率*经Student t检验，p<0.05。（E）用亲和纯化的抗Drp1抗血清、抗复合物Vβ（CompV）抗血清、抗病毒抗体VDAC抗血清和抗肌动蛋白抗血清对线粒体和细胞溶质组分的蛋白质提取物进行western blot分析。（F） wt苍蝇和过度表达Parkin的苍蝇的蛋白质提取物(*hsp70-GAL4/UAS-停车*)果蝇过度表达PINK1(*hsp70-GAL4/UAS-PINK1*)用亲和纯化的抗dMfn抗血清、抗复合物Vβ抗血清、抗VDAC抗血清和抗肌动蛋白抗血清进行蛋白质印迹分析。对苍蝇进行1小时的热休克，并在热休克24小时后收集苍蝇进行分析。箭头表示dMfn带在94 kDa处的位置，星号（*）表示两个非特异性带。

**图3。dMfn以依赖PINK1和Parkin的方式普遍存在。**
用亲和纯化的抗dMfn抗血清免疫沉淀野生型苍蝇的dMfn，*粉红色1^B9公司*突变体，以及*公园²⁵*突变体。作为特异性的对照，抗dMfn抗血清也用于免疫沉淀来自带有*hsp70-GAL4型*驱动表达式*UAS-dmfn-RNAi公司^维也纳.*在左侧面板中，免疫沉淀中使用的3%的裂解物输入使用抗泛素抗血清进行western blot分析，以表明所有基因型的泛素化水平相似。在中间和右侧面板中，使用抗泛素抗血清（中间面板）或抗dMfn抗血清（右侧面板）对所有四种基因型的dMfn-免疫沉淀物进行western blot分析。箭头指示在wt苍蝇中检测到的未修饰的dMfn物种，*粉红色1^B9公司*突变体，以及*公园²⁵*突变体，在表达*UAS-dmfn-RNAi公司^维也纳*箭头表示泛素dMfn物种的位置。这些分析重复了至少三次，结果相似。

**图4。dMfn与Parkin组装。**
亲和纯化的抗Parkin抗血清用于免疫沉淀wt苍蝇和*公园²⁵*null突变体。作为*公园²⁵*苍蝇不产生任何Parkin蛋白，这种免疫沉淀可以控制其他蛋白与Parkin抗血清的任何非特异性结合。用抗dMfn抗血清对用于免疫沉淀的总裂解液和Parkin免疫沉淀的3%进行western blot分析。只有wt苍蝇中出现了与dMfn带相对应的带，表明Parkin和dMfn之间存在相互作用。星号（*）表示非特定带。

**图5。PINK1/Parkin通路促进线粒体断裂和周转的潜在模型。**
先前的研究表明，PINK1定位于线粒体外膜，其激酶域面向细胞质，在那里需要选择性地向受损线粒体募集Parkin，以促进这些线粒体的自噬清除。我们的模型假设，当Parkin募集到线粒体网受损部分时，它会泛素化（Ub）线粒体融合促进因子Mitofusin，从而标记其降解，或以其他方式使其融合促进活性失活。随后依赖Drp1的线粒体分裂将产生线粒体产物，线粒体产物受损，线粒体线粒体缺乏线粒体毒素，因此无法重新进入线粒体网络。这些小的受损线粒体分裂产物将成为自噬降解的靶点。虽然我们的图描绘了一个模型，其中Parkin在线粒体分裂前结合，但Parkin也可能在分裂后被招募到受损的线粒体中。另一种模型是，线粒体泛素化是受损线粒体周转的信号。这些可能的模型并不相互排斥。

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