Parkin致病突变损害线粒体泛素化、聚集和HDAC6依赖性有丝分裂

帕金森氏病（PD）是第二常见的进行性神经退行性疾病。神经损伤常伴有细胞质包涵体，称为路易体，其中含有泛素阳性蛋白聚集体(麦克诺特等人，2002年). 路易体的普遍性导致了一个核心观点，即蛋白质聚集体的异常积累是帕金森病发展的关键因素。除了蛋白质聚集体外，线粒体功能障碍已成为与PD相关的另一个显著病理特征。长期以来，线粒体复合物I抑制剂可在人类和啮齿动物模型中诱发帕金森综合征。事实上，在帕金森病患者中观察到复合物I缺乏症（综述见Abou-Sleiman等人，2006年). PD中线粒体缺陷和蛋白质聚集体的共性表明，这些有毒物质的积累可能与机制有关。发现这一潜在联系可以为PD背后的基本缺陷提供重要线索。

家族性常染色体隐性遗传青少年PD（AR-JP；Lücking等人，2000年). AR-JP中parkin突变的流行率表明parkin在抑制帕金森综合征中起主导作用(Abou-Sleiman等人，2006年). Parkin编码含有泛素E3连接酶的RING结构域(Shimura等人，2000年;Zhang等人，2000年). 一些与疾病相关的帕金森突变体缺乏E3连接酶活性，表明帕金森通过促进泛素化抑制帕金森综合征。在基于细胞的模型中，parkin可以产生多泛素突变体DJ-1和α-突触核蛋白相关联合体，这两者都参与PD(Chung等人，2001年;Lim等人，2005年;Olzmann等人，2007年). 有趣的是，帕金介导的联菲蛋白或DJ-1泛素化不会导致蛋白酶体快速降解(Lim等人，2005年). 对于DJ-1，泛素化招募泛素结合蛋白脱乙酰化酶HDAC6，该酶促进DJ-1向微管组织中心的转运，形成包涵体，使其粘附(Olzmann等人，2007年). 证据表明，HDAC6依赖性聚集途径浓缩有毒蛋白聚集体，以便随后通过自噬清除(川口等人，2003年;岩手等人，2005年;Pandey等人，2007年;Lee等人，2010年). 聚集物与路易体有许多共同特征，这表明蛋白聚集物的活性浓度可能是PD患者的一种神经保护机制(麦克诺特等人，2002年). 因此，帕金可能通过促进有毒蛋白质聚集体的清除来保护神经元，尽管目前还没有明确的实验支持这一观点。

parkin突变动物模型的特征表明存在显著的线粒体缺陷（综述见Abou-Sleiman等人，2006年). 帕金如何影响线粒体功能尚不清楚。最近，帕金被发现与功能受损和去极化线粒体相关。值得注意的是，标记帕金的线粒体随后被自噬清除，自噬将受损线粒体隔离并通过自噬体传递给溶酶体以清除(Narendra等人，2008年). 原则上，这种有丝分裂活动可以通过消除功能失调的线粒体来保护神经元，线粒体会产生有毒的活性氧，从而损害神经元。帕金如何促进受损线粒体的清除，以及有丝分裂在抑制帕金森综合征中是否重要尚不清楚。

历史上，自噬主要被描述为饥饿激活的非选择性降解途径。然而，与营养状况无关，自噬已成为选择性处理蛋白质聚集体和受损细胞器的主要质量控制机制（综述见Mizushima等人，2008年). 这种所谓的质量控制（QC）自噬与饥饿诱导的自噬有着根本的不同，因为它独特地涉及泛素化底物和泛素结合HDAC6和p62(Lee等人，2010年). 在QC自噬中，有人提出HDAC6将一种依赖于cortactin的肌动蛋白重塑机制募集到泛素化的蛋白质聚集体中，其中F-肌动蛋白的组装促进自噬体-溶酶体的融合和自噬底物的清除(Lee等人，2010年). 有丝分裂是否以类似的分子机制进行是一个有待回答的基本问题。

在本报告中，我们提供了帕金通过促进功能失调线粒体的泛素化诱导有丝分裂的证据。帕金介导的泛素作用是招募泛素结合脱乙酰酶HDAC6和p62，它们组装了清除受损线粒体的自噬机制。我们还发现，依赖帕金蛋白的线粒体吞噬需要形成类似攻击性的近核线粒体包涵体。重要的是，我们发现一些致病性帕金森突变体在有丝分裂中有缺陷，从而支持了有丝分裂在抑制帕金森综合征中的关键作用。

最近报道过表达parkin可通过线粒体吞噬促进去极化线粒体的清除(Narendra等人，2008年). 我们发现表达高水平内源性parkin的SH-SYY5神经母细胞瘤细胞确实在线粒体解偶联物羰基氰化物的作用下丢失了线粒体米-氯苯肼（CCCP）(图S1). 因此，内源性parkin可以支持有丝分裂。为了研究有丝分裂活性是否与PD的发生有关，我们确定与家族性AR-JP相关的parkin突变是否在支持有丝分裂方面有缺陷。我们选择研究影响parkin中三个保守结构域的代表性parkin突变体R42P、R275W、A240R和T415N：泛素样（UBL）结构域、RING-1和RING-2结构域。我们在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中表达野生型或疾病相关的parkin突变体，其parkin蛋白水平无法检测，并评估其清除CCCP诱导的受损线粒体的能力。正如预期的那样，在没有CCCP的情况下，野生型和帕金突变体主要是细胞溶质的，不与线粒体共定位，对线粒体丰度或形态几乎没有影响(图S2). CCCP治疗后，在大量表达野生型帕金蛋白的细胞中观察到明显的线粒体丢失(图1、A和B). 与之形成鲜明对比的是，CCCP治疗后，线粒体保留在表达疾病相关帕金突变体的细胞中(图1、A和B). 线粒体标记物丢失的免疫印迹分析进一步证实了有丝分裂缺陷(图1 C). 与野生型parkin不同，parkin的表达导致线粒体细胞色素的显著丢失c（c）在CCCP治疗后，没有任何与疾病相关的帕金突变体表现出这种活性。我们得出结论，疾病相关的parkin突变在支持有丝分裂方面有缺陷。

尽管在我们的试验中检测到的每个parkin突变体在清除受损线粒体方面都有缺陷，但它们的表型是不同的。尽管CCCP治疗后野生型parkin显著与线粒体共定位（见下文），但UBL域突变型parkin-R42P没有，表明UBL域参与parkin向受损线粒体的募集(图1 A). 我们发现A240R和T415N突变体缺乏泛素E3连接酶活性(Zhang等人，2000年;Sriram等人，2005年)与去极化线粒体显著相关，并显著诱导核周区大线粒体聚集体的形成(图1 A). 相反，parkin R275W突变体虽然明显定位于线粒体，但并未诱导形成核周线粒体聚集体(图1 A). 这些结果表明，所有检测到的PD-associated parkin突变体在支持有丝分裂方面都有缺陷，但具有不同的表型。

不同parkin突变引起的不同线粒体表型表明，受损线粒体的清除涉及多个离散步骤。我们进一步研究了核周线粒体聚集体的形成，因为它们表现出一些攻击性特征。我们首先确定线粒体聚集体的形成是否是野生型帕金和CCCP诱导的有丝分裂的一部分。为此，我们评估了CCCP治疗后不同时间点的线粒体状态。如所示图2 A虽然24小时后线粒体被大量清除，但在8小时后，在大多数表达parkin的细胞（80%）中观察到明显的核周线粒体聚集(图2). 这一结果表明，核周线粒体聚集体的形成是parkin-CCCP诱导的有丝分裂的中间步骤(图2).

核周线粒体聚集体让人联想到aggresome，这是一个包涵体，蛋白质聚集体由微管动力蛋白马达浓缩(Johnston等人，2002年). 为了确定受损线粒体是否通过强啡肽依赖性转运类似地集中在核周区域，用微管确定试剂诺卡唑处理表达parkin的MEF。如所示图2 A（底部）和2个B，诺卡唑显著抑制线粒体近核聚集体的形成，但不影响parkin在线粒体的定位。此外，抑制动力蛋白运动活性的dynamicin过度表达也抑制线粒体聚集体的生成(图S3 A). 重要的是，诺卡唑治疗显著抑制帕金森CCCP诱导的线粒体清除(图2 B)这表明动力蛋白运动依赖性聚集物的形成是有效清除受损线粒体所必需的。

接下来我们确定了帕金是如何通过自噬促进线粒体清除的。我们注意到，尽管parkin A240R和T415N突变体诱导了核周线粒体聚集体的形成，但这些线粒体没有被清除(图1). 由于A240R和T415N parkin突变体在E3泛素连接酶活性方面具有共同的生化缺陷，我们询问是否需要泛素化步骤才能最终清除受损线粒体。为了测试这一点，我们用多泛素抗体对parkin表达细胞进行免疫染色。泛素抗体与大多数核周线粒体聚集体强烈反应，表明线粒体是泛素化的(图3，A和B). 事实上，CCCP处理后在纯化的线粒体中检测到泛素化蛋白物种(图3 C). 与之形成鲜明对比的是，parkin E3连接酶缺失的A240R-和T415N-表达细胞中的大多数线粒体聚集体缺乏泛素信号(图3，A和B). 对parkin-A240R和T415N表达细胞纯化线粒体的免疫印迹证实泛素化降低(图3 D). 这些结果表明，帕金诱导受损线粒体的泛素化，这种泛素化是有效清除受损线粒体所必需的。

我们最近发现，蛋白质聚集体中的泛素修饰可招募自噬机制的两个关键调节成分，即p62和HDAC6，两者都具有内在的泛素结合活性。p62结合关键的自噬体成分LC3，而HDAC6激活一个肌动蛋白重塑机制，促进自噬-溶酶体融合，从而增强自噬活性(Pankiv等人，2007年;Lee等人，2010年). E3连接酶缺陷型parkin A240R和T415N突变体未能完成有丝分裂(图1)，我们询问线粒体泛素化是否与自噬机制的招募有关。如所示图4p62和HDAC6在野生型parkin表达细胞中显著定位于泛素化的线粒体聚集体。相反，在parkin A240R和T415N突变表达细胞中，p62和HDAC6的线粒体定位明显较少。这一结果表明，依赖于parkin-CCCP的线粒体泛素化招募p62和HDAC6到受损的线粒体。

接下来我们确定HDAC6和p62是否是清除功能失调线粒体所必需的。Parkin未能清除HDAC6基因敲除（KO）MEF中CCCP处理的线粒体(图4 E)或p62击倒U2OS细胞（图S3）。值得注意的是，HDAC6 KO MEF中没有形成大的核周线粒体聚集体，这表明HDAC6也是运输和浓缩受损线粒体所必需的。重新引入野生型HDAC6可以有效恢复parkin-CCCP诱导的有丝分裂(图4 E，底部）。为了证实HDAC6在有丝分裂中的作用，我们通过parkin表达细胞中的特异性siRNA敲除HDAC6，并在CCCP治疗后通过免疫印迹法测定线粒体Tom20水平。如所示图4 G在对照组中Tom20水平显著降低，但在HDAC6敲除细胞中没有降低，这表明HDAC6在帕金介导的有丝分裂中起着重要作用。

我们已经证明，HDAC6通过补充皮质素依赖的肌动蛋白重塑机制促进蛋白质聚集体的清除，从而促进自噬体和溶酶体的融合。为了确定线粒体清除受损是否也需要cortactin，我们通过siRNA敲除cortactin，并评估了parkin依赖性线粒体自噬。如所示图5 A皮质素失活导致核周区parkin阳性线粒体聚集体显著积聚，表明有丝分裂失败。事实上，免疫印迹分析表明，cortactin敲除，类似于HDAC6失活，可以防止CCCP诱导的线粒体标志物的丢失(图5 B). 我们的结论是，与蛋白质聚集加工类似，HDAC6、皮质素和p62是清除受损线粒体所必需的。

在这项研究中，我们发现位于不同功能域的几种疾病相关突变都会削弱parkin清除受损线粒体的能力，表明parkin依赖性有丝分裂与帕金森综合征抑制之间存在紧密联系。重要的是，parkin突变体的分析揭示了不同的线粒体表型，表明parkin在有丝分裂中具有复杂的活性(图1). R42P突变体的表型表明UBL结构域是parkin向线粒体募集所必需的(图1). 泛素E3连接酶缺失的A240R和T415N突变体能够促进线粒体聚集物的形成，称为线粒体聚集物，但不能促进线粒体的清除(图1和3). 相反，R275W突变体可以与去极化线粒体结合，但在促进线粒体聚集形成方面不足。因此，这些致病性parkin突变体在不同阶段阻止了线粒体吞噬，并证明受损线粒体的结合和清除代表了parkin的不同活性。这些发现允许将依赖帕金的线粒体吞噬重建为时间事件，包括通过帕金结合标记受损的线粒体，运输“标记的”线粒体形成线粒体聚集物，最后通过泛素介导的自噬清除浓缩的线粒体。任何这些步骤的失败都会破坏线粒体吞噬，导致线粒体受损产生毒性。

parkin E3连接酶活性的生理功能尚不明确。我们的结果表明受损的线粒体是parkin的底物。有趣的是，parkin介导的线粒体泛素化显然对线粒体聚集物的形成不是必需的(图3 A)；然而，泛素阴性线粒体没有进一步加工，并显著积累(图1和3). 因此，帕金森依赖性泛素化似乎为集中在核周区域受损线粒体的最终清除提供了信号。我们的结果表明，线粒体泛素化作用招募HDAC6和p62，这两种泛素结合蛋白是靶向蛋白质聚集体的高效自噬所必需的(Lee等人，2010年). 事实上，HDAC6和p62缺陷细胞在帕金依赖性有丝分裂中有缺陷(图4和图S3 B）。总之，这些结果有力地支持了泛素修饰是QC自噬特异有效清除受损线粒体的关键基础。

帕金介导的CCCP去极化线粒体聚集体的形成很有趣，因为这种结构类似于攻击性。与攻击性相似，线粒体聚集物（有丝分裂聚集物）的形成依赖于微管动力蛋白马达和HDAC6(图2A,4电子和S3 A）。有趣的是，最近的一项研究发现，PINK1的过度表达诱导了parkin与线粒体的结合，也导致了线粒体聚集物的形成，尽管线粒体聚集的重要性尚未得到解决(Vives-Bauza等人，2010年). 我们发现，有效的线粒体清除需要线粒体聚集物的形成(图2). 我们认为，病理条件下受损的线粒体通过parkin和HDAC6依赖的聚集途径集中到近核区，在那里它们被QC自噬清除。事实上，百草枯，一种与PD相关的线粒体复合物I抑制剂，可以诱导有丝分裂聚集物的形成（图S1 C）。我们的研究表明，蛋白质聚集体和受损的线粒体通过一条共同的途径进行处理，该途径涉及HDAC6和帕金依赖性泛素选择性自噬和聚集机制，从而为理解PD发病机制中两个最常见的病理特征提供了一个统一的模型。

如前所述，使用3T3方案从E14.5野生型和HDAC6 KO同窝胚胎中获得永生野生型和HDAC6 KOMEF(Lee等人，2010年)U2OS和SH-SYY5细胞购自美国类型培养库，分别保存在含有10%FBS的DME（U2OS）和Ham’s F12/DME（SH-SYY5）中₂GFP标记的野生型和突变型parkin表达质粒由Michael Ehlers博士（北卡罗来纳州达勒姆杜克大学）提供。

针对aa 991–1149产生抗小鼠HDAC6抗体。还使用了以下抗体/试剂：抗HDAC6（H-300；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、抗泛素（Enzo Life Sciences，Inc.和EMDc（c）（BD）和诺卡唑（Sigma-Aldrich）。

如前所述进行免疫染色(Hubbert等人，2002年;Lee等人，2004年). 细胞在玻璃盖玻片上培养1d，并转染野生型或突变型Parkin表达质粒。用25µM的线粒体解偶联剂CCCP处理细胞所需的时间（8、16和24小时）。细胞在室温下固定在磷酸盐缓冲液（PBS）中制造的4%多聚甲醛中15分钟。用以下主要抗体对细胞进行染色：小鼠单克隆细胞色素c（c）（BD）、兔多克隆Tom20（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、兔多克隆泛素（Enzo Life Sciences，Inc.），兔多克隆p62（Santa Cruz Bintechnologies，Inc.）和兔多克隆HDAC6（针对HDAC6的aa 991–1149生成）；并带有以下二级抗体：小鼠和/或兔子Alexa 488（Invitrogen）、罗丹明（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）和Cy5。样品安装有防虚荧光G介质（SouthernBiotech）进行成像。图像由配有电荷耦合器件相机（ORCA ER；哈马松光电）的旋转圆盘共焦显微镜（DMI6000C；徕卡）在室温下采集，使用100x/1.4–0.70 NA油（Apochro计划；徕卡公司）或40x/1.25–0.75 NA油（NeoFluar计划；徕卡公司）物镜。使用徕卡LAS AF程序1.8.2版采集和处理图像。

线粒体纯化是用一种改进的方法进行的(Schwer等人，2002年). 简而言之，细胞在冰镇缓冲液H（210 mM甘露醇、70 mM蔗糖、0.1 mM EGTA和2 mM Hepes-KOH，pH 7.5）中均质。细胞匀浆与抗Tom20固定化磁珠孵育2 h。线粒体用Tom20磁场固定化磁球分离。

获得稳定表达GFP-Parkin的MEF。样品在SDS-PAGE上运行，并用以下抗体进行免疫印迹：多克隆兔抗Parkin（Invitrogen）、兔抗泛素（Enzo Life Sciences，Inc.）、兔抗HDAC6（针对HDAC6的aa 991–1149产生）、兔对抗Tom20（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和小鼠抗细胞色素c（c）（BD）。

一个双尾学生的t吨对定量数据进行了统计分析。

图S1。CCCP治疗下内源性帕金触发SH-SYY5神经母细胞瘤细胞的有丝分裂，百草枯治疗诱导细胞有丝分裂聚集。图S2。野生型和突变型parkins主要定位于胞浆中，未经CCCP处理。图S3。线粒体聚集体的形成被过表达的dynamicin抑制，需要p62。

我们感谢M.Ehlers博士的试剂和A.Wagner的评论。

这项工作得到了国家卫生研究院（NS053825）对T.-P.Yao的资助。