通过线粒体去极化稳定的PINK1使Parkin恢复受损线粒体并激活潜伏Parkin进行有丝分裂

帕金森氏病（PD）是一种以多巴胺能神经元丢失为特征的非常常见的运动障碍。大多数PD病例是散发的；然而，与这种罕见的家族性疾病相关的基因的发现为疾病发病机制的分子机制提供了重要的见解(Moore等人，2005年；Hardy等人，2006年)。2000年，我们和其他人发现E3泛素连接酶的功能障碍(Imai等人，2000年；Shimura等人，2000年；Zhang等人，2000年)被称为Parkin导致常染色体隐性遗传青少年Parkinson综合征(Kitada等人，1998年)。自那时以来，发表了大量论文，但帕金功能障碍导致常染色体隐性遗传青少年帕金森综合征的机制在很大程度上仍不清楚，致病性的说法仍有争议(Lim，2007年；松田和田中，2010年)。此外，粉红色1(PTEN诱导的假定激酶1)2004年被确定为导致另一种早发性PD的基因(瓦伦特等人，2004年)。PINK1在线粒体维持中起作用，表明线粒体完整性是疾病发病机制中的另一个关键因素(Dodson和Guo，2007年；沙皮拉，2008年)。有趣的是，遗传研究使用黑腹果蝇揭示了PINK1和Parkin在同一途径中发挥作用，PINK1在Parkin上游发挥作用(Clark等人，2006年；Park等人，2006年；Yang等人，2006年)。关于PINK1如何调节Parkin，我们知之甚少，尤其是在哺乳动物中，我们对其关系的了解有限。在本研究中，我们描述了Parkin催化的泛素化和PINK1调节的线粒体质量控制之间功能相互作用的机制。

我们最初试图利用HeLa细胞研究Parkin的亚细胞定位和E3活性，据报道HeLa缺乏功能帕金基因(Denison等人，2003年)。为了支持这项研究，我们发现在HeLa细胞中几乎无法检测到内源性Parkin，即使是最具特征的特异性抗Parkin抗体PRK8(Pawlyk等人，2003年)，已使用(图S1 A)。因此，HA-Parkin被外源性引入HeLa细胞。在稳态条件下，HA-Parkin在细胞液中广泛定位，与线粒体没有重叠，而当用线粒体解偶联剂CCCP（羰基氰化物间氯苯腙；图1 A)，据报道Narendra等人（2008）接下来，我们试图用生化方法确认Parkin从细胞质到线粒体的重新分布。在分馏实验中，在富含线粒体的部分中检测到的Parkin很微弱，可能是因为Parkin与线粒体的结合较弱，因此在分馏的过程中不稳定。交联剂DSP（二硫代双[琥珀酰亚胺丙酸]）的加入显著增强了信号，进一步证实了外源性(图1 B，左）和内源性(图1 B（右）从细胞质到富含线粒体部分的Parkin。（请注意，SH-SY5Y细胞中的内源性Parkin可检测为双重蛋白，这与之前的研究一致[Pawlyk等人，2003年].) 为了更令人信服地证明Parkin被选择性地招募到去极化线粒体中，我们使用了MitoTracker红CMXRos，它在线粒体中积累，具有完整的膜电位。CCCP治疗不彻底会产生健康和受损线粒体共存的细胞。在这些条件下，Parkin和MitoTracker的信号相互排斥，并且Parkin选择性地定位在线粒体上，MitoTracher红染色较低(图1D)表明Parkin选择性地靶向膜电位已丧失的线粒体。

随后，我们使用抗泛素抗体进行免疫荧光染色。在正常情况下，泛素信号在整个细胞中传播。相反，当细胞被CCCP处理时，泛素信号集中在线粒体中(图2，A和B)。线粒体泛素化仅在Parkin表达细胞中观察到(图2 A和图S1 B），当引入缺乏E3活性的Parkin突变体（T415N和G430D）时消失(图2 A)。线粒体靶向GFP（Mt-GFP）、抗Parkin和抗泛素抗体的三重染色进一步证实了CCCP治疗后Parkin、泛素和线粒体的共定位(图2 C)。单抗体染色或单用Mt-GFP染色表明，上述合并数据并非来源于通道串扰（图S1、C和D）。这些结果表明，帕金泛素化线粒体是对线粒体膜电位降低的反应。

为了证实Parkin向去极化线粒体的易位在病因上是重要的，我们选择了9个致病突变，并检查了它们的亚细胞定位(图1 C)。体外实验先前表明，RING2结构域中的两个突变（T415N和G430D）消除了Parkin的E3活性，而E3活性不受其他突变的影响(汉普等人，2006年；Matsuda等人，2006年)。将这些突变体连续导入HeLa细胞，然后进行CCCP处理，并检测其亚细胞定位。分别在RING1或IBR（在RING之间）结构域中具有D280N或G328E突变的Parkin以类似于野生型Parkin的方式被募集到线粒体中(图1、E和F)。相反，其他致病性突变在一定程度上改变了Parkin的线粒体定位；尤其是K161N、K211N和T240R突变，它们位于或靠近连接子区域的RING0结构域(Hristova等人，2009年)，严重影响Parkin的线粒体定位(图1、E和F)。上述结果表明Parkin的线粒体定位在病理学上具有重要意义，并且RING0结构域对于Parkin向受损线粒体的易位非常重要。

如所示图2 C图S1 B，线粒体泛素化依赖于Parkin向线粒体的移位。因此，我们试图确定Parkin的亚细胞定位是否调节其E3活性。为了解决这个问题，我们使用与Parkin融合的人工底物监测Parkin的E3活性。体外实验表明，Parkin可以将一个N-末端融合的富含赖氨酸的蛋白质泛素化为假底物(Matsuda等人，2006年)。在体内正常条件下，即使在细胞质中，假底物也会发生类似的泛素化，这将证明E3活性是构成性的；否则，Parkin的E3活性依赖于线粒体检索。GFP标签富含赖氨酸，因此是体内假底物的良好候选物，而HA标签不含赖氨酸残基，因此不能用作假底物。CCCP处理过的HeLa细胞中表达的GFP-和HA-Parkin均被招募到受损的线粒体中(图1A和2个D)，但有趣的是，只观察到了GFP Parkin的高分子量群体(图2 F)。免疫沉淀实验证明GFP-Parkin确实是泛素化的(图2 E)。这并不是基于Parkin自身的泛素化，因为CCCP治疗后线粒体相关的HA-Parkin没有泛素化(图2 F且未描述）。此外，在缺乏E3活性的T415N和G430D突变体中没有GFP-Parkin的泛素化，这表明GFP-Parpin的泛素化不是来自其他E3(图2 G)。线粒体定位受损的K161N和K211N突变体也抑制GFP-Parkin的泛素化(图2 G)。综上所述，上述结果表明，Parkin泛素化酶仅在GFP重新进入线粒体时融合GFP，表明Parkin的潜在E3活性依赖于线粒体膜电位的降低。

人类的隐性突变粉红色1基因也是常染色体隐性遗传早发性PD的病因(瓦伦特等人，2004年)。接下来我们研究了PINK1的亚细胞定位是否受到线粒体膜电位的影响。如前所述(瓦伦特等人，2004年；Beilina等人，2005年；Takatori等人，2008年)，N-末端Myc或N-末端Flag标记的PINK1明显定位于线粒体，而C-末端Flag或C-末端V5标记的PINK1主要定位于细胞质(图3 A且未描述）。在稳态条件下，外源性非标记PINK1也定位于细胞质(图3 B)提示PINK1的线粒体定位是N末端表位的伪影。更重要的是，与Parkin相似，CCCP处理后，未标记的PINK1和C末端Flag（或C末端V5）标记的PINH1定位于线粒体(图3，A和B; 且未描述）。这些结果表明PINK1的亚细胞定位也受到线粒体膜电位的调节。

接下来，我们试图确定内源性PINK1的亚细胞定位。如前所述，免疫细胞化学实验表明(Zhou等人，2008)在稳态条件下，HeLa细胞几乎无法检测到内源性PINK1信号。然而，线粒体膜电位降低导致线粒体相关PINK1信号(图3、C和D)。我们发现CCCP处理也促进了免疫印迹中内源性PINK1的逐渐积累(图3E)线粒体富集组分中存在内源性PINK1(图3 F)。更重要的是，当CCCP被冲掉时，在环己酰亚胺存在和不存在的情况下，积累的内源性PINK1迅速消失（在30分钟内）(图3 G且未描述）。此外，即使在没有CCCP的情况下，PINK1的N末端34 aa也能充分向线粒体募集GFP(图3 H)。这些结果支持了PINK1不断被转运到线粒体但以膜电位依赖性方式快速降解的假设。我们推测PINK1通过线粒体膜电位的降低而稳定，因此在去极化的线粒体中积累。

PINK1通常以长蛋白（～60kD）或短蛋白（～50kD）的形式存在。由于典型的线粒体靶向信号（基质靶向信号）在进入线粒体后被裂解，长形式被指定为前体，短形式被指定是成熟的PINK1(Beilina等人，2005年；Silvestri等人，2005年)。当未标记的PINK1过度表达时，可以清楚地检测到短（加工）形式的PINK1(图3E，第六车道）；然而，CCCP治疗后很少检测到这种内源性PINK1(图3E，第一条到第五条车道）。我们对CCCP处理后内源性PINK1的亚细胞定位研究表明，线粒体部分恢复了长形(图3 F)此外，通过监测膜电位恢复后PINK1的降解过程，我们发现在CCCP被冲刷后PINK1的短形式很快出现，然后消失(图3 G)这表明PINK1的加工形式是膜电位依赖性降解的中间产物。总之，这些结果表明，PINK1的裂解并不像最初认为的那样反映了伴随线粒体导入的典型成熟过程。

因为之前的研究表明PINK1在Parkin上游起作用(Clark等人，2006年；Park等人，2006年；Yang等人，2006年；Exner等人，2007年)接下来，我们研究了PINK1在Parkin线粒体募集中的潜在作用。为了获得明确的结论，我们使用来自对照组的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）建立了我们的实验系统(粉红色1^+/+)或粉红色1淘汰赛(粉红色1^−/−)鼠标(Gautier等人，2008年)。MEF中未检测到内源性Parkin（图S1 A）；因此，通过逆转录病毒转染将HA或GFP-Parkin导入这些细胞(Kitamura等人，2003年)。受控MEF(粉红色1^+/+)，在CCCP治疗后，Parkin被选择性招募到线粒体(图4 A)随后导致线粒体消失(图4、D和E)。线粒体清除受到以下因素的严重阻碍附件7（自噬必需基因）敲除(图S2；小松等人，2005年)表明Parkin通过选择性自噬降解线粒体(Narendra等人，2008年)。与之形成鲜明对比的是，Parkin在粉红色1淘汰赛(粉红色1^−/−)CCCP处理后的MEF(图4，A和B)。Parkin的后续激活和线粒体降解也被完全阻碍(图4，C–E)。为了排除Parkin逆转录病毒整合在上述表型中的可能作用，我们检查了PINK1的再次引入是否挽救了该表型。未标记或C端旗帜-标记PINK1补充了Parkin在粉红色1^−/−MEF公司(图5、B和C; 确认上述缺陷是由PINK1丢失引起的。

为了检测PINK1的致病性突变是否影响其线粒体定位，我们表达了含有错义突变E240K和G309D或C1602后面的CAA核苷酸插入（以下称为1602-insert）的PINK1突变粉红色1^−/−MEF公司。与野生型PINK1类似，CCCP处理后这些PINK1突变体与线粒体共定位(图S3)。接下来，将GFP-Parkin引入这些细胞，以检测PINK1的致病性突变是否影响Parkin的线粒体定位和激活。E240K和G309D突变体恢复了Parkin以及野生型PINK1，而1602插入突变体向线粒体补充Parkin的现象被废除(图5，B–D)这表明PINK1突变的病理学是Parkin定位错误并随之失活。

最后，我们研究了各种PINK1域的作用(图5 A)PINK1由非典型的N末端线粒体定位信号和跨膜结构域、中间的激酶结构域和保守的C末端结构域组成(Zhou等人，2008)。N末端91 aa的缺失取消了PINK1的线粒体定位(Zhou等人，2008)。我们还证实，ΔN91和ΔN155突变体即使在CCCP处理后也不会靶向线粒体（图S3）。我们还产生了一个含有三个K219A、D362A和D384A突变的突变体，这些突变消除了激酶活性(Beilina等人，2005年)和一个与PINK1功能障碍相关的C末端结构域缺失突变(Sim等人，2006年；Yang等人，2006年)。PINK1的激酶死亡和ΔC72突变体与类似于野生型的受损线粒体共定位（图S3）。当引入时粉红色1^−/−携带GFP-Parkin的细胞，突变体无法补充Parkin定位错误和失活(图5，B–D)尽管突变的PINK1蛋白被表达(图5D和图S3）。这些结果表明PINK1的激酶活性和线粒体靶向性对Parkin的线粒体募集至关重要。

总之，我们已经证明：（a）PINK1是一种Parkin募集因子，以膜电位依赖的方式从细胞质向受损线粒体募集Parkin，以促进线粒体降解，但其定位与膜电位的降低有关，（c）在稳态条件下，Parkin的E3活性在细胞质中受到抑制，但由PINK1依赖的线粒体定位释放，以及（d）上述现象在病因学上可能具有重要意义，因为PINK1或Parkin的疾病相关突变在很大程度上阻碍了这些现象的发生。我们相信，这些结果不仅为以下疾病引起的家族型PD发病机制提供了坚实的分子基础帕金和粉红色1突变也是PD的主要散发形式。

来自PINK1基因敲除小鼠胚胎第12.5天胚胎的MEF（由J.Shen，Harvard Medical School，Boston，MA提供）通过P1000移液管尖端反复传代进行机械分散，并镀上含有DME、10%FCS、β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）、1×非必需氨基酸和1 mM的MEF培养基我-谷氨酰胺。通过用重组逆转录病毒感染MEF，建立了MEF的各种稳定转化子。HA-Parkin、GFP-Parkin、PINK1（由Y.Nakamura、T.Iwatsubo和S.Takatori，University of Tokyo，Bunkyo-ku，Tokyo，Japan提供）或各种PINK1-突变体被克隆到pMXs-puro载体中。逆转录病毒包装细胞，PLAT-E（由东京大学北村T.Kitamura提供；Kitamura等人，2003年)，用上述载体转染，并在37°C下培养24 h。更换培养基后，将细胞在37°C下进一步培养24 h，收集病毒上清液并用于感染。感染前24小时，将MEFs接种在35mm培养皿上，并用上述含有8µg/ml聚布伦（Sigma-Aldrich）的未稀释病毒上清液代替培养基。2d后，用含10µg/ml嘌呤霉素的培养基筛选转化子。

为了使线粒体去极化，用10µM CCCP处理HeLa和SH-SY5Y细胞，用30µM的CCCP处理MEF。对于分馏实验，HeLa和SH-SY5Y细胞用CCCP处理1-5小时，然后用1 mM DSP（Thermo Fisher Scientific）在PBS中在冰上处理1小时，用10 mM甘氨酸在PBS内灭活三次，并悬浮在chappell-perry缓冲液中（0.15 M KCl，20 mM Hepes-NaOH，pH 8.1，5 mM MgCl₂以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂[Roche]）。通过25号针头（使用1毫升注射器）通过五个通道破坏细胞，在1000℃离心清除碎片克持续7分钟，上清液接受10000次克将富含线粒体的部分与富含细胞质的部分分离10分钟。采用常规方法进行免疫印迹和免疫沉淀。为了检测GFP-Parkin的泛素化，收集HeLa细胞（10µM CCCP 1 h）或MEF（30µM CC 3 h）的细胞裂解液，并在10 mM的存在下进行检测N个-乙基马来酰亚胺保护泛素化帕金免受氘化酶的伤害。为了监测内源性PINK1的降解，用10µM CCCP和50µg/ml环己酰亚胺处理HeLa细胞，如图3 G并进行免疫印迹。

为了使线粒体去极化，HeLa细胞（由马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院A.Tanaka和R.Youle提供）用10µM CCCP处理1 h（外源性Parkin和PINK1）或5 h（内源性PINK1），MEF用30µM CC处理3-4 h(图4A和5个B; 和图S3 B）或24小时(图4 D和图S2 A）。对于免疫荧光实验，用4%多聚甲醛固定细胞，用50µg/ml洋地黄素透化，并用下一节中描述的一级抗体和以下二级抗体染色：小鼠和/或兔Alexa Fluor 488、568和647（Invitrogen）。在三重染色实验中，PINK1的N末端34 aa与GFP融合，对线粒体进行染色。如前所述，为了监测线粒体膜电位，MEF用50 nM MitoTracker红CMXRos（Invitrogen）处理15分钟，清洗三次，并在固定前再培养10分钟(Narendra等人，2008年)。使用激光扫描显微镜（LSM510 META；Carl Zeiss，Inc.）和Plan-Apochromat 63×NA 1.4油差干涉对比物镜对细胞成像。在Photoshop（Adobe）中调整图像对比度和亮度。

本研究中使用的抗体如下：抗actin（AC-40；Sigma-Aldrich）、抗细胞色素c（c）（6H2.B4；BD）、抗Flag（M2；Sigma-Aldrich）、抗GFP（3E6[Wako Chemicals USA，Inc.）；或A6455[Invitrogen]）、抗HA（12CA5；Roche）、抗热休克蛋白70（MBL）、抗乳酸脱氢酶（Abcam）、抗Parkin（#2132[细胞信号技术]用于免疫细胞化学；或PRK8[Sigma-Aldrich]用于免疫印迹）、抗PINK1（Novus）、，抗Tom20（FL-145和F-10；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、抗泛素（P4D1[Santa Crux Biotechnology，Inc.]；或FK2[MBL]）和抗V5（Invitrogen）。

图S1显示了免疫印迹和免疫细胞化学的各种对照实验。图S2显示Parkin通过自噬促进去极化线粒体的降解。图S3显示了CCCP处理后PINK1致病性突变体和缺失突变体的亚细胞定位。

我们感谢T.Kitamura博士提供PLAT-E细胞，感谢A.Tanaka博士和R.Youle博士提供NIH HeLa细胞，谢谢J.Shen博士提供粉红色1敲除MEFs，以及Y.Nakamura博士、T.Iwatsubo博士和S.Takatori博士的质粒。

这项工作得到了青年科学家补助金（B）（给N.Matsuda、K.Shiba和S.Saiki）以及日本教育、文化、体育、科学和技术部的特别促进研究（给K.Tanaka）以及健康和劳动科学研究补助金（给N.Hattori和K.Taanaka）的支持。

评论中添加了注释。在审查我们的手稿时，盖斯勒等人（2010）,Narendra等人（2010年）、和Vives-Bauza等人（2010年）与本文所述一致的独立发布的结果。