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.2010年3月24日；30（12）：4232-40。
doi:10.1523/JNEUROSCI.6248-09.2010。

丝裂霉素2是轴突线粒体运输所必需的，并与Miro/Milton复合体相互作用

阿尔伯特·米斯科 1, Sirui Jiang公司, 伊加·韦戈泽夫斯卡, 杰弗里·米尔布兰特, 罗伯特·H·巴洛
附属公司

丝裂霉素2是轴突线粒体运输所必需的，并与Miro/Milton复合体相互作用

阿尔伯特·米斯科等。 神经科学. .

摘要

线粒体外膜蛋白（Mfn1和Mfn2）参与调节线粒体动力学。Mfn2突变导致2A型夏科特-马里奥病（CMT），这是一种以长外周轴突退化为特征的遗传性疾病，但这种组织选择性的性质尚不清楚。在这里，我们提供证据表明Mfn2直接参与并需要轴突线粒体运输，与线粒体融合中的作用不同。对Mfn2基因敲除小鼠培养的神经元或表达Mfn 2疾病突变体的神经元的实时成像显示，轴突线粒体暂停的时间更长，顺行和逆行运动较慢，表明对微管运输系统的依附发生了改变。此外，Mfn2断裂选择性地改变线粒体运动，使其他细胞器的运输保持完整。重要的是，Mfn1和Mfn2都与哺乳动物Miro（Miro1/Miro2）和Milton（OIP106/GRIF1）蛋白质相互作用，后者是连接线粒体和驱动蛋白马达的分子复合物的成员。敲除培养神经元中的Miro2会产生与Mfn2丢失相同的转运缺陷，这表明这两种蛋白必须存在于外膜上以介导轴突线粒体转运。相反，通过击倒线粒体内膜蛋白Opa1而破坏线粒体融合对线粒体运动没有影响，这表明融合的丧失本身不会改变线粒体运输。这些实验确定了丝裂原融合蛋白在直接调节线粒体转运中的作用，并对CMT2A和显性视神经萎缩轴突变性的细胞类型特异性和分子机制提供了重要见解。

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数字

图1。
图1。
CMT2A-相关MFN2突变体改变轴突线粒体的运输。培养的表达wtMFN2或R94Q的DRG神经元中的线粒体用线粒体RFP标记，并通过延时显微镜成像。A类R94Q表达细胞线粒体运动的Kymograph分析显示运动线粒体数量减少。B类，与对照组的线粒体相比，R94Q表达神经元的线粒体在顺行和逆行之间暂停的时间更长。(*第页< 0.005,t吨测试；n个=创建图像堆栈的轴突数量）。每种疾病都包含至少500个观察到的线粒体。C，速度分布表示表达wtMFN2或R94Q的神经元线粒体以指定速度运动的时间量。顺行速度高于x个-轴，并且逆行速度低于x个-轴。R94Q表达神经元线粒体的顺行和逆行速度分布均向低速方向移动。根据秩和检验分析，差异具有统计学意义(第页< 0.001).D类、wtMFN2-、R94Q-和H361Y-表达细胞轴突线粒体的大小-频率分布表明CMT2A疾病突变体降低线粒体长度。
图2。
图2。
CMT2A相关的MFN2突变体特异性破坏线粒体运输。A类,B类表达H361Y或R94Q MFN2疾病突变体的DRG神经元与mito-RFP共同感染(A类)和RhoB-GFP(B类)线粒体和内体标记。突变表达神经元显示线粒体活动性降低(A类（kymograph）在显示正常内体运输的同一轴突中(B类，日程表）。C,D类与表达wtMFN2的神经元相比，R94Q-和H361Y-中可移动线粒体的百分比显著降低(*第页<0.001），而这些轴突中活动内体的百分比正常。E类,F类，wtMFN2中相位对比度和EGFP-SKL（标记过氧化物酶体）的叠加图像(E类)-和H361Y(F类)-表达DRG轴突。G公司与内体相似，移动过氧化物酶体的百分比未被MFN2突变体的表达所改变。
图3。
图3。
线粒体的正常轴突运输需要Mfn2。为了评估Mfn 2缺失对线粒体运动的影响，我们分析了Mfn 2中敲除动物培养的DRG神经元的线粒体运输。A类–C，野生型DRG培养物(A类)或Mfn2−/−(B类)感染有丝分裂-RFP的小鼠在感染后4天以10倍放大率成像，并结合单个轴突的相应波形图。为了清晰起见，相应的轴突以浮雕图像的形式出现在每个波形记录仪的上方。B类，Mfn2中观察到线粒体数量减少−/−由于线粒体整体向外迁移延迟导致的轴突，通过重新引入野生型人类MFN2进行纠正(C，Mfn2救援）。D类线粒体的大小-频率直方图显示Mfn2中观察到的线粒体长度减少−/−重新引入MFN2（MFN2救援）后恢复的轴突。E类–G公司，个体MFN2线粒体运动的Kymograph分析−/−轴突表现出严重的运输异常，类似于MFN2疾病突变体表达的缺陷。Mfn2的运动线粒体−/−轴突在运动之间停留的时间更长(E类,F类) (*第页< 0.001,t吨测试；n个是产生波形图的轴突数量），在顺行和逆行方向以较慢的速度移动(G公司)，并且通过Mfn2或Mfn1的表达而被完全挽救。
图4。
图4。
Mfn2和Mfn1与Miro和Milton蛋白质相互作用，后者是基于微管的线粒体运输的关键成分。用指示的表位标记结构瞬时转染HEK 293T细胞，然后进行免疫沉淀（IP）和免疫印迹。A类,B类，Mfn2和Mfn1都能通过共免疫沉淀与Miro1和Miro2相互作用。Mfn2:Miro2相互作用始终比Mfn2：Miro1相互作用更强，这表明可能有选择性地形成这种复合物。C–F类，Mfn2和Mfn1与Milton同源物OIP106和GRIF1相互作用，这两种蛋白质被认为是线粒体和驱动蛋白马达之间的连接体。G公司,H（H），Mfn2和Mfn1均未与Kif5C共免疫沉淀，表明它们并不直接将线粒体与驱动蛋白连接。我此外，Mfn2无法与线粒体外膜蛋白syntaphilin相互作用，syntapphilin将线粒体固定在微管上。
图5。
图5。
Miro2耗竭导致线粒体转运异常，类似于DRG神经元Mfn2缺失所观察到的线粒体转运异常。A类,B类Kymograph分析显示，siRNA介导的Miro2基因敲除显著改变了线粒体转运模式。C，轴突线粒体的大小-频率直方图表明，Miro2的缺失改变了线粒体的转运，而没有改变线粒体的形态。D类，类似于Mfn2−/−培养中，线粒体在Miro2击倒培养中，在顺行运动之间停顿的时间比例更大(*第页< 0.001,t吨测试；n个是创建图像堆栈的轴突数）。逆行运动之间的停顿趋向于更长的停顿时间，但没有达到统计显著性。E类在Miro2敲除培养物中，线粒体速度分布也偏向较慢的运动，类似于Mfn2缺失的影响。
图6。
图6。
通过敲除Opa1而破坏线粒体融合不会改变线粒体轴突运输。为了评估破坏线粒体融合本身是否足以改变线粒体转运，我们使用siRNA敲低DRG神经元中的Opa1。A类,B类代表性轴突的浮雕图像和显示Opa1基因敲除（>90%）的相应波形图并未改变线粒体运动模式。C线粒体大小-频率直方图显示，Opa1缺失显著降低线粒体长度，与Mfn2中的线粒体长度相似−/−培养，反映线粒体融合减少。D类,E类，顺行或逆行运动之间的暂停时间(D类)和运动速度(E类)没有被Opa1击倒(n个与Mfn2的丢失不同，这表明线粒体融合的丢失不会改变线粒体的运输。
图7。
图7。
具有融合能力的CMT2A相关MFN2突变体不能补偿MFN2的线粒体转运异常−/−神经元。为了比较融合胜任型（L76P，W740S）和融合不胜任型（R94Q）MFN2突变体介导线粒体转运的能力，我们将这些突变体重新导入MFN2−/−并评估其挽救线粒体转运异常的能力。与wtMFN2相比，融合胜任型（L76P，W740S）和融合不胜任型（R94Q）突变体都不能完全恢复线粒体暂停时间(A类,B类) (n个是产生波形图的轴突数量）或线粒体速度(C).
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