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.2009年3月；108(6):1561-74.
doi:10.1111/j.1471-4159.2009.05932.x。 Epub 2009年1月24日。

突变体Pink1通过干扰钙流诱导帕金森病神经元细胞模型线粒体功能障碍

罗伯塔·马龙吉 1, 布莱恩·斯宾塞, 莱斯利·克鲁斯, 安东尼·阿达姆, 克里斯蒂娜·帕特里克, 玛格丽塔·特雷霍, 布鲁诺·达尔拉皮科拉, 恩扎·玛丽亚·瓦伦特, 埃利泽·马西利亚
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突变体Pink1通过干扰钙流诱导帕金森病神经元细胞模型线粒体功能障碍

罗伯塔·马龙吉等。 神经化学杂志. 2009年3月.

摘要

帕金森氏病（PD）的特征是α-同核蛋白（alpha-syn）的积聚以及皮层和皮层下区域神经元群的退化。线粒体功能障碍被认为是该疾病发病机制中一个潜在的统一因素。与家族性PD相关的基因突变，包括编码α-syn和Pten-induced putive kinase 1（PINK1）的SNCA，已被证明会破坏线粒体活性。我们研究了突变体Pink1通过α-同步蛋白积累破坏神经元细胞线粒体功能的机制。为此，用病毒传递的Pink1感染PD的神经细胞模型，并分析细胞存活率、线粒体活性和钙流量。通过共焦显微镜和电子显微镜分析线粒体形态。这些研究表明，突变体（W437X）而非野生型Pink1加剧了突变体（A53T）alpha-syn促进的线粒体功能变化。这种效应与细胞内钙水平增加有关。突变体Pink1和alpha-syn的共表达导致线粒体结构和突起生长的改变，经环孢霉素A治疗后部分改善，经线粒体钙内流阻滞剂钌红治疗后完全恢复，但与其他细胞钙流量阻滞剂治疗后未恢复。我们的数据表明，线粒体钙内流在PD线粒体和神经元功能障碍机制中发挥作用。此外，这些研究支持Pink1在应激条件下调节线粒体活性的重要功能。

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图1
图1
感染LVα-syn和Pink1的B103神经元细胞表达水平的特征。（A） 在感染空载体的样本中未检测到荧光信号。（B） 在感染LV-GFP的细胞中检测到丰富的信号。（C和D）用免疫荧光显微镜检测感染LV-α-syn-wt或LV-α-syn-A53T的细胞中α-syn的表达。（E和F）用抗HA抗体对感染LV-Pink1 wt或LV-Pink1W437X的细胞进行Pink1免疫荧光检测。（G） 对感染LV-GFP、LV-α-syn或LV-Pink1的神经元细胞匀浆进行Western blot分析。面板（F）中的比例尺（20μm）适用于所有照片。
图2
图2
用Mitotracker分析感染LV表达α-syn和Pink1的神经元细胞的线粒体形态。（A-C）感染LV-空对照、α-syn wt和Pink1 wt（D-F）的神经元细胞中线粒体（箭头）的基线外观。（G） 线粒体平均直径的图像分析。通过激光共聚焦显微镜记录每个条件下平均200个细胞，并用NIH Image J程序进行分析。表达α-syn A53T或Pink1 W437X的细胞线粒体大小增加了25-50%。在同时感染LV-α-syn A53T和LV-Pink1 W437X的细胞中，这些变化加剧*第页与LV对照组感染细胞相比，单因素方差分析和事后Dunnett检验均<0.05#第页与单独感染LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞相比，单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey-Kramer试验的结果均<0.05。面板（F）中的比例尺（5μm）适用于所有照片。
图3
图3
表达α-syn和Pink1的LV感染神经元细胞的超微结构分析。（A和B）感染LV对照的细胞显示线粒体（M）、粗面内质网和溶酶体（L）的基线结构保持不变。（D-F）在感染LV-α-syn A53T（C和D）或Pink1 W437X（E和F）的神经元细胞中，线粒体（M）被拉长，通常被细丝包围（箭头）。此外，细胞质中有丰富的电致密层状结构，类似于自噬体（AP）。（G和H）同时感染LV-α-syn A53T和Pink1 W437X的神经细胞显示，线粒体增大，嵴多余（箭头所示），溶酶体异常（L），含有电致密物质和自噬体（AP）。面板（G）中的比例尺（0.5μm）适用于面板A、C、E、G；面板（H）中的比例尺（1μm）适用于面板B、D、F、H。
图4
图4
感染LV表达突变型α-syn和Pink1的神经元细胞系线粒体病理学特征。（A） LV对照组感染细胞中保存的线粒体（M）形态。（B，C）在同时感染LV-α-syn A53T和Pink1 W437X的细胞中，在自噬小体（AP）附近发现线粒体增大和拉长。（D） 与LV-α-syn A53T和Pink1 W437X共同感染的细胞线粒体基质中异常电致密颗粒（箭头）的积聚。（E，F）与LV-α-syn A53T和Pink1 W437X共同感染的细胞中异常线粒体被细丝（箭头）和自噬体包围。插图显示了更高倍的线粒体周围纤丝图像。面板（F）中的比例尺（0.25μm）适用于所有显微照片。
图5
图5
在感染LV的神经元细胞中，α-syn和Pink1与线粒体共定标。细胞生长在盖玻片上，用Mitotracker Red标记，用α-syn-或HA抗体进行免疫染色，以检测Pink1，并用激光共聚焦显微镜成像。（A-C）表达Pink1 wt或（D-F）α-syn-wt的细胞显示出更弥漫的免疫反应（箭头）。（G-I）在感染LV-Pink1 W437X或（J-L）LV-α-syn A53T的细胞中，Pink1或α-syns的免疫反应性更接近Mitotracker染色的线粒体（箭头所示）。（M-O）方框所示图像的特写。（P-R）在与LV-α-syn A53T和LV-Pink1 W437X（*）共同感染的细胞中，突变体α-syn-和Mitotracker的共扩增变得更加明显。面板（R）中的比例尺（5μm）适用于面板A-L和P-R；面板（O）中的比例尺（2μm）适用于面板m-O。
图6
图6
在感染LV表达α-syn和Pink1的B103细胞中，线粒体功能改变以及环孢霉素A和钌红的保护作用。所有值均表示为控制百分比。用5μM环孢霉素A或10mM钌红处理神经细胞。（A-C）线粒体Δ的半定量分析Ψ米用载体对照（A）、环孢素A（B）或钌红（C）处理的细胞中的Mitotracker红荧光。（D-F）用溶媒对照（D）、环孢素A（E）和钌红（F）处理的细胞中ATP生成的测定（通过发光检测试剂盒）。表达突变α-syn和Pink1的细胞表现出线粒体功能和ATP生成的减少，这种影响在表达这两种突变蛋白的细胞中更大。环孢霉素A治疗部分减少了表达突变α-syn和Pink1的细胞的缺陷，而钌红完全恢复了组合突变蛋白的作用*第页与LV对照组相比，单因素方差分析和事后Dunnett检验均<0.05#第页通过单因素方差分析和事后Tukey Kramer检验，与单独感染LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞相比，<0.05。
图7
图7
表达α-syn和Pink1的LV感染的B103细胞中的神经元改变和环孢霉素A和钌红的保护作用。所有值均表示为控制百分比。用5μM环孢霉素A或10μM钌红处理神经细胞。用载体对照（A）、环孢菌素A（B）或钌红（C）处理细胞的MTT分析。（D-F）通过相差显微镜和图像分析测定经溶媒对照（D）、环孢素A（E）或钌红（F）处理的细胞的轴突长度。表达突变α-syn和Pink1的细胞表现出线粒体活性和轴突长度的减少，在表达这两种突变蛋白的细胞中这种影响更大。环孢霉素A治疗部分减少了表达突变α-syn和Pink1的细胞的缺陷，而钌红完全恢复了组合突变蛋白的作用*第页通过单因素方差分析和事后Dunnett检验，与LV对照组相比<0.05#第页与单独感染LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞相比，单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey-Kramer试验的结果均<0.05。
图8
图8
钙阻滞剂对感染LV表达α-syn和Pink1的神经元细胞系膜电位和ATP生成的影响。所有值均表示为控制百分比。用细胞钙抑制剂氯化钴（5μM）或氟苯那酸（40μM）处理神经细胞，并用Mitotracker Red或ATP分析。线粒体Δ的（A-C）半定量分析Ψ米用溶媒对照（A）、氯化钴（B）或氟苯那酸（C）处理的细胞中的Mitotracker红色荧光。（D-F）用溶媒对照（D）、氯化钴（E）或氟苯那酸（F）处理的细胞中ATP生成的测定（通过发光分析试剂盒）。与钌红的保护作用相反，其他钙阻滞剂均未恢复表达突变α-syn和Pink1对ΔΨ米或ATP生产*第页与LV对照组相比，单因素方差分析和事后Dunnett检验均<0.05#第页与单独感染LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞相比，单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey-Kramer试验的结果均<0.05。
图9
图9
钙阻滞剂对表达α-syn和Pink1的神经元细胞内钙水平的影响。所有值均表示为控制百分比。用细胞钙抑制剂钌红（10μM）、氯化钴（5μM）或氟苯那酸（40μM）孵育神经细胞，然后用钙染料处理，并在分光光度计上通过荧光显微镜进行分析。（A） 溶媒对照组细胞中的钙水平。（B） 钌红处理细胞中的钙水平。（C）氯化钴处理细胞中钙水平。（D） 用氟非那米酸处理的细胞中的钙水平。对于ΔΨ米钌红处理能够逆转共表达突变蛋白对钙内流的影响*第页与LV对照组相比，单因素方差分析（ANOVA）和事后Dunnett检验均<0.05。
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    1. Adamczyk A、Strosznajder JB。Alpha-synuclein通过电压依赖性Ca2+通道增强Ca2+内流。神经报告。2006;17:1883–1886.-公共医学
    1. Betarbet R、Sherer TB、MacKenzie G、Garcia-Osuna M、Panov AV、Greenamyre JT。长期全身接触杀虫剂会重现帕金森氏病的特征。自然神经科学。2000;3:1301–1306.-公共医学
    1. Bonifati V、Rohe CF、Breedweld GJ等。与PINK1突变相关的早期帕金森综合征：频率、基因型和表型。神经病学。2005;65:87–95.-公共医学
    1. Braak H，Braak E.帕金森病的病理解剖学。神经学杂志。2000;247（补充2）：II3–10。-公共医学

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