老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2016年7月；8(7): 1294–1311.
小鼠衰老与p16（Ink4a）和β-半乳糖苷酶阳性巨噬细胞蓄积有关，这些巨噬细胞蓄积可由衰老细胞在年轻小鼠中诱导
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布兰登·M·霍尔
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
维塔利·巴兰
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
安纳托利·格雷伯曼
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
Evguenia Strom公司
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
彼得·克拉斯诺夫
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
劳伦·维托索
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
埃琳娜·里德基纳
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
Slavoljub Vujcic公司
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
卡琳娜·巴兰
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
伊利亚·吉特林
2美国纽约州布法罗市罗斯韦尔公园癌症研究所细胞应激生物学系
卡特琳娜·列奥诺娃
2美国纽约州布法罗市罗斯韦尔公园癌症研究所细胞应激生物学系
亚历山大·波林斯基
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
奥尔加·B·切尔诺瓦
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
安德烈·古德科夫
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
2美国纽约州布法罗市罗斯韦尔公园癌症研究所细胞应激生物学系
1Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203
2美国纽约州布法罗市罗斯韦尔公园癌症研究所细胞应激生物学系
接收日期：2016年5月23日；2016年6月28日接受。
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- 补充资料
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摘要
衰老细胞被认为是与年龄相关的慢性无菌全身炎症的来源，也是抗衰老治疗的靶点。为了了解SCs数量的控制机制，我们分析了植入SCID小鼠体内的人衰老成纤维细胞快速清除的现象，当SCs嵌入海藻酸钠珠中以防止其受到免疫细胞攻击时，可以克服这一现象。为了确定可能的SC杀手，我们分析了灌洗液中细胞群的含量以及围绕SC珠形成的胶囊。SCs分泌因子吸引的主要细胞类型之一是巨噬细胞亚群，其特征是p16（墨水4a）pH6.0（β-gal）下的基因表达和β-半乳糖苷酶活性pH值6)，因此类似于SC。一贯地，p16（Ink4a）启动子小鼠-驱动荧光素酶，在植入海藻酸钠珠内的SC后两周内，其腹腔出现明亮的发光。p16（Ink4a）/β-加仑pH值6-表达细胞具有巨噬细胞F4/80的表面生物标志物，对用于选择性杀伤吞噬细胞的氯膦酸脂质体敏感。与此同时，氯膦酸盐未能杀死真诚地生成的SC在体外基因毒性应激。p16（Ink4a）/β-gal比例升高的老年小鼠pH值6-其组织中的阳性细胞在系统性氯膦酸盐治疗后均减少，这表明以前被认为是SC的细胞中有很大一部分实际上是巨噬细胞的一个亚类。这些观察结果表明p16（Ink4a）/β-半乳糖具有重要作用pH值6-衰老中的阳性巨噬细胞，以前仅归因于SCs。它们需要重新解释p16（Ink4a）/β-半乳糖根除后恢复活力的机制pH值6-阳性细胞和抗衰老治疗潜在细胞靶点的重新考虑。
关键词：时间老化、炎症、炎症、衰老相关β-半乳糖苷酶、p16INK4a、衰老相关分泌表型、氯膦酸盐
简介
了解哺乳动物衰老的根本原因是合理开发预防和治疗这种疾病以及延长健康寿命的特权。今天，关于老龄化的多种理论[1–6]似乎对无菌慢性全身炎症的关键作用达成了共识，称为“炎症成像”[7，8]作为一种随着年龄增长而发展的统一症状，有助于癌症、代谢疾病和其他与年龄相关的病理的发展[9–16]。然而，炎症的确切来源仍然难以捉摸。在过去几年中，一个特定的假设似乎在该领域盛行，它将老龄化与SC的积累联系在一起。根据这个模型，SC毒害组织其分泌的促炎症产物，即所谓衰老相关分泌表型（SASP）的表现[17–20]。SC假说的广泛接受是基于几项研究，所有这些研究都涉及基因改造的小鼠，这些小鼠表达的特定蛋白受p16（墨水4a）启动子，被认为在SC中被激活，使其能够被药理学药物选择性杀伤[21–23]。p16（Ink4a）阳性细胞在小鼠组织中的积聚随年龄增长而发生，在遗传上容易加速衰老的小鼠中，其药物清除与表型变化有关，这与生物年龄减少和寿命延长一致[21]或野生型小鼠[23]分别是。p16（Ink4a）阳性细胞的根除伴随着组织内表达β-半乳糖的细胞比例的降低，特别是脂肪细胞pH值6–几个组织学上适用的SC标记之一[24]。因此，p16（Ink4a）/β-gal的积累pH值6-阳性细胞随着年龄的增长以及组织中炎症因子的同时增加被令人信服地解释为SC的促衰老活性。
细胞衰老可以定义为细胞的表观遗传学重编程，通常能够增殖，以应对遗传毒性（即辐射、化疗药物等）或致癌（显性致癌基因的激活）应激[25，26]以永久性细胞周期阻滞、未解决的构成性DNA损伤反应和NF-κB的构成性激活为特征，这些因素驱动一系列生物活性、主要是促炎因子（SASP）的表达和产生。初步观察和表征了细胞衰老现象在体外主要存在于遭受基因毒性应激或转导致癌RAS的人类和啮齿动物间充质细胞中[27]。衰老的生物学意义被认为是通过细胞的永久增殖停滞来预防癌症，否则，由于细胞有致癌的风险，这些细胞可能是危险的[28–30]。无数次试图寻找衰老的特定和常见生物标志物的尝试导致了许多特性，但没有一个是SC的普遍特征。这些包括已经提到的p16（Ink4a）[31，32]，β-加仑pH值6活动[24，33]以及SASP，还包括DNA损伤反应的结构性存在迹象、p21和p53的结构性升高等[34–36]。由于许多这些性状的表现随着年龄的增长而增加，因此可以合理地得出结论，它们表明SC积累。然而，目前尚不清楚哪些特定的细胞体内是这些SC标记的载体。
SC假说并没有为老年哺乳动物中SC的积累和年轻个体中SC的缺失提供明确的原因。通常讨论的内容包括以下场景：（i）SC积累反映了生命中随机DNA损伤的积累；（ii）SC的形成是由年龄相关的生理和代谢变化引起的，导致ROS介导的基因毒性应激升高；（iii）SC是由具有功能性p53的体细胞中致癌途径的零星和随机放松调控引起的，（iv）年轻生物体中负责SC根除的免疫系统功能的老化相关损伤[1，5，6，37，38]。然而，上述假设中哪一个是正确的（如果有的话）仍有待确定。
在当前的研究中，我们解决了两个关于SC的问题体内：（i）在体外-将SC植入年轻小鼠体内后生成的SC，以及（ii）SC生物标记物的携带者体内? 我们发现SC体内可以有效地吸引免疫细胞的组合，使其快速根除。这些免疫细胞的主要部分由巨噬细胞亚群代表，这些巨噬细胞显示高水平的p16（Ink4a）和β-半乳糖pH值6表达，从而模仿SC的最典型特性。此外，p16（Ink4a）/β-gal的重要部分pH值6-随着年龄增长，小鼠组织中积累的阳性细胞也以巨噬细胞为代表。根据这些观察结果，对SC衰老假说的重新考虑进行了讨论。
结果
持续性干细胞移植模型
随着年龄的增长，衰老细胞的积累被认为是年龄相关疾病的慢性炎症的主要来源[10，20，39]。事实上，表达SC标记物[对p16（Ink4a）呈阳性]的细胞数量在小鼠生活期间逐渐增加[40]（图。). 然而，SCs随年龄增长而在组织中积聚的原因尚不清楚。最明显的解释之一是，在年轻生物体中，先天免疫系统能更有效地清除SC[三，41，42]。我们试图研究将人类衰老细胞与非衰老细胞移植到年轻的严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内的命运和生物效应。该模型的初步开发包括生成表达分泌型高斯（Gaussia）荧光素酶（GLuc），可监测细胞存活体内通过测量采集的血浆中的GLuc活性[43，44]。接下来，产生携带这些表达GLuc的NDF（NDF-GLuc）的微载体珠培养物，并通过血清饥饿（0.2%FBS）使细胞静止，或通过20Gyγ射线使细胞衰老。我们接种了2-3×106通过向SCID小鼠腹腔注射～300μl填充珠体积的细胞，以及通过分泌GLuc监测28天内定期采血的植入细胞存活率（图). 植入静止和衰老NDF的小鼠在注射后第7天的血浆中GLuc信号也表现出类似的降低，其中30%的GLuc活性与初始细胞植入后24小时观察到的活性相比保持不变。然而，在第7天之后，SCs小鼠的GLuc活性下降的速度比静止细胞更快，这表明这些SCs被更有效地清除。到第28天，在第1天观察到的SCs中GLuc信号残留不到1%（比静止细胞低5.2倍）。与非SCs相比，SCs清除更快，表明SC细胞更脆弱体内或针对SCs的特定机制活动的结果，可能涉及先天免疫反应（因为SCID小鼠的适应性免疫受到损害）。
SC植入体内(A-B公司)具有荧光素酶（p16）半合子p16（Ink4a）敲除的年长小鼠队列（n=5只）中的生物发光信号积累LUC公司老鼠；第16页墨水4a/Luc). (一个)描述了单个小鼠的全身发光（总通量；p/s）。(B类)年代老化小鼠的连续生物发光成像。色标表示信号强度（所有时间点的阈值相同）。(C-D公司)SCI小鼠SC植入模型。将含有分泌型GLuc报告子结构（NDF-GLuc）的NDF细胞作为微载体微珠培养物腹腔内植入SCID小鼠，在注射之前，这些微珠培养液在低血清（0.2%FBS）中培养以诱导静止（Qui-NDF）或在20Gy照射以诱导衰老（Sen-NDF）。或者，用保护性海藻酸凝胶（Sen-NDF+Alg）包裹辐照NDF。通过测量28天定期收集的小鼠血浆中的GLuc活性来监测NDF-GLuc存活动力学。随着时间的推移，血液中残留的GLuc活性的量以细胞接种后24小时血浆中活性的百分比表示。所示值为各组（n=4-6只小鼠/组）的平均值±SEM。第7天之后，各组之间的差异具有统计学意义（p≤0.001）。(D类)空藻酸盐珠（无细胞）和含有嵌入式辐射诱导衰老NDF的藻酸盐珠的显微照片（亮场图像）。将衰老的NDF细胞包埋到小鼠体内后，在植入小鼠体内之前，通过用钙调素AM（绿色）标记活细胞和用碘化丙啶（PI；红色）标记死细胞来评估包埋细胞的活性，然后进行荧光显微镜观察。还评估了海藻酸钠珠中衰老NDF的β-半乳糖pH值6染色。显示代表性图像（放大100倍）。存活率>90%（PI-阳性细胞<10%）表明细胞植入成功。
为了区分这些可能性并确定潜在的SC杀手，我们使用了一个模型，其中SC可以在免疫细胞无法到达的受体小鼠中持续存在。它包括将SC嵌入由藻酸盐制成的珠子中，藻酸盐是一种纳米多孔凝胶，可提供免疫系统的物理屏障，同时允许珠子内的细胞交换营养和废物，并释放细胞分泌物，如细胞因子[45–47].
通过钙调素-AM和碘化丙啶分别对活细胞和死细胞进行染色，评估嵌入细胞的活性（图). 海藻酸钠珠的制备程序经过优化，使其在包埋后立即具有>90%的SC活性。此外，在在体外在将珠子接种到腹腔之前进行培养。此外，进一步对海藻酸包埋的SC进行了表征，并确定其对衰老相关β-半乳糖苷酶（β-gal）呈阳性pH值6)活动（图).
将衰老的GLuc表达的NDF包裹在藻酸盐凝胶珠中并注射到SCID小鼠体内。GLuc活性被监测为SC活性的指标。
到第7天，与未受保护的衰老和静止NDF-GLuc细胞相比，观察到GLuc活性的类似丧失，反映出移植细胞数量的非选择性减少可能是由于体内自适应（图). 然而，与裸细胞不同的是，在第7天之后，海藻酸钠的存在稳定了血浆中观察到的GLuc活性，提供了长达3周的稳定信号。
小鼠血浆中分泌的GLuc活性表明，小蛋白（GLuc；25kDa）从藻酸盐小球中可靠释放，并在外周血中进行系统检测。此外，这些初步实验表明，海藻酸包被的衰老NDF在腹膜腔中存活时间较长，根据稳定的GLuc分泌推断，它们在腹膜腔内保持功能活性。通过植入藻酸盐微球保护SC免于快速死亡，强烈支持细胞机制参与SC根除体内为了鉴定SC杀手，我们分析了携带植入SC的藻酸盐珠的小鼠腹腔吸引的细胞含量。
SCs吸引细胞进入腹膜腔的性质
为了研究SC分泌物吸引的免疫系统成分，通过腹腔注射将空的藻酸盐小球或含有150万衰老NDF的小球接种到小鼠体内，并在14天后收获，同时进行腹腔灌洗，以分析细胞含量。由于在SCID、NIH Swiss和C57BL/6小鼠中获得了类似的结果，这里和下面我们只显示了在C57BL/6中产生的数据。
虽然空空如也的海藻酸钠珠在腹腔注射后14天内保持不变，但发现含有SC的珠被多层细胞形成的致密胶囊包围（图). 使用SCs检测方案对整个珠子进行酶染色，结果表明β-半乳糖含量较高pH值6胶囊中的活性（图). 事实上，β-半乳糖染色阳性的大部分囊泡形成细胞pH值6（图). 解离胶囊的进一步表征表明，它们主要由巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞组成(补充图S3B). 冷冻切片珠的免疫荧光染色显示，大部分细胞为F4/80阳性，这是成熟小鼠巨噬细胞广泛接受的标记（图). F4/80-和β-gal比例较大pH值6-阳性细胞，我们的数据表明巨噬细胞可能有β-galpH值6含有SC的珠子释放的因子存在时的活性。
β-gal的积累pH值6-和p16（Ink4a）阳性免疫细胞对SC植入的反应(一个)整颗藻酸盐珠的图像体外从腹腔取出p16后（空的或含有SC）LUC公司老鼠。通过相位对比光显微镜（顶面板）或DNA染色试剂盒（CyQUANT™Direct）染色样品的荧光显微镜（中面板）观察海藻酸钠珠周围的致密包裹细胞层，以观察活细胞内的细胞核。β-加仑pH值6染色显示包裹SC包埋海藻酸钠珠的细胞的活性（放大100倍）。(B类)冷冻保存的SC包埋藻酸盐珠的组织切片（15-μm）用Geimsa染色，通过100倍和400倍放大的光学显微镜（分别为左上图和右上图）进行组织学可视化，用于F4/80免疫荧光（绿色）进行巨噬细胞可视化，显示该外膜定位蛋白的特异性染色（左下面板；放大400倍），以及β-半乳糖pH值6通过X-Gal基底与核固红复染（400倍放大）进行活性。显示含有SCs的海藻酸凝胶（Alg）。(C类)生物发光体内p16的成像LUC公司腹腔接种空藻酸盐珠（empty）或藻酸盐包埋SCs（Sen）的小鼠。珠粒注射前两天（基线）和注射后第5天和第12天获得的代表性序列图像显示，患有SC的小鼠的发光信号增加。彩色刻度表示最小和最大阈值的相对发光信号强度，以辐射度显示。红色箭头表示藻酸盐珠植入造成的注射部位伤口。(D类)SC注射后第12天的生物发光量表示为来自腹部的总通量（p/s），表示为与基线测量值相比信号增加的倍。(E类)通过流式细胞术对表面标记物免疫染色的活细胞进行分析，分析接种后2-3周收集的携带SC的小鼠腹腔灌洗液的细胞成分。描述了主要细胞类型的百分比：巨噬细胞（Mac）、B淋巴细胞（B细胞；B）、嗜酸性粒细胞（Eos）和剩余细胞群（Rest）。该分析描述了一个典型的实验(电子-G)其中这4个细胞群通过FACS分离并检测荧光素酶活性(F类)和β-半乳糖活性(G公司)，标准化为单元格编号。用于FACS的选通方案如所示补充图S1所示值为各组（n=3-6只小鼠/组）折叠诱导的平均值±SEM。
p16（Ink4a）报告小鼠在几种衰老和衰老模型中的应用表明，其组织中的细胞对β-半乳糖呈阳性反应pH值6与p16比例升高有关墨水4a-表达细胞。然而，这些细胞的身份体内定义不明确。我们试图测试β-半乳糖pH值6-SCs反应阳性的免疫细胞与p16升高有关墨水4a表达式。为此，将海藻酸钠包埋的SC植入年轻的p16LUC公司C57BL/6背景的报告小鼠（半合子敲除；p16墨水4a/Luc)，并通过增加的生物发光信号监测p16（Ink4a）诱导（图). 令人惊讶的是，SCs的存在导致12天后腹部发光信号增加13.1倍体内同时，在携带空藻酸盐珠的小鼠中未观察到显著增加，这表明SCs引起的反应不仅仅是由于异物对藻酸盐珠产生反应。总的来说，与携带SCs的组相比，携带空珠子的组的发光诱导率增加了10.1倍（p≤0.01）。总之，这些发现表明，海藻酸钠珠释放SC分泌物强烈诱导p16（Ink4a）表达。
为了确定哪些细胞群体对p16（Ink4a）和β-gal有贡献pH值6在这个模型中，来自p16腹膜腔的SC阳性免疫细胞的信号反应LUC公司接种SC后2周收集小鼠。活性染色腹膜浸润的FACS分析显示细胞来源于造血（≥90%CD45+)由三种主要细胞类型组成（占灌洗液的～75%）。这些细胞被分为四个群体，随后测定荧光素酶和β-半乳糖pH值6活性：1）B淋巴细胞（CD19+; ∼26%），2）嗜酸性粒细胞（CD19−CD11b型+CD170型+; ∼17%），3）巨噬细胞（CD19−CD11b型+80层/四层+; ∼46%），和4）剩余细胞群池（11%），包括中性粒细胞（CD11b+赖氨酸-6G+)，CD11b−细胞（例如T淋巴细胞）和CD11b+80层/四层−细胞（例如单核细胞、NK细胞）（图;补充图S1). 对这些分类群体的细胞裂解物的分析表明，这两种标记物在巨噬细胞中大量富集，但在其他细胞类型中没有富集（图). 事实上，巨噬细胞是唯一提供可检测到的荧光素酶活性的细胞群体，每个细胞的荧光素酶活性是其他群体的6倍以上（图). 同样，巨噬细胞的β-半乳糖含量增加了10.5倍pH值6每个细胞的活性（图). 鉴于其丰富性，这些数据表明巨噬细胞几乎只参与发光信号和β-半乳糖pH值6腹腔灌洗液中发现的SC-合法浸润的活性。
p16和β-gal升高pH值6SC-合法巨噬细胞的表达
接下来，我们试图确定p16（Ink4a）/β-gal的贡献pH值6-巨噬细胞对p16生物发光增强的反应LUC公司携带含有SC的藻酸盐珠的小鼠。为此，用氯膦酸盐脂质体制剂对小鼠进行腹腔注射，该制剂通常用于选择性消耗吞噬细胞（例如巨噬细胞）[48，49]。对于携带海藻酸钠包埋SCs的小鼠，使用载体对照（PBS中的空脂质体）进行治疗，与治疗前的测量值相比，信号继续增加2.3倍（图). 相反，氯膦酸盐处理导致生物发光降低2.2倍。因此，氯膦酸钠治疗的综合效果是p16的生物发光信号减少了5.1倍LUC公司小鼠与车辆治疗组相比（p≤0.0001）。在携带不诱导p16（Ink4a）的空珠子的小鼠中（图)，在氯膦酸盐治疗后观察到无显著下降。这些数据表明，具有吞噬活性的细胞，即巨噬细胞，负责对衰老NDF的大部分p16（Ink4a）诱导。这一发现与我们之前的观察一致，即灌洗液中的巨噬细胞是荧光素酶活性的单一来源。
巨噬细胞的药理清除体内耗尽荧光素酶和β-半乳糖pH值6p16的活性LUC公司携带SC的小鼠(一个)代表性系列图像描绘体内p16的生物发光LUC公司小鼠在接种空珠状物（empty）或海藻酸钠包埋的SC后12天（治疗前）和两次腹腔注射含有PBS对照物（Veh）或氯膦酸盐（Clod）的脂质体后一周（治疗后；接种后18-20天）获得。彩色标尺表示最小和最大阈值的相对发光信号强度，以辐射度表示。(B类)治疗后各组腹部的发光量（总通量；p/s）表示为与治疗前测量的信号相比的倍数差。(C类)从幼年小鼠、携带空珠的脂质体载剂处理小鼠（Em/Veh）或携带SC的脂质体载体或氯膦酸盐处理小鼠（分别为Sen/Veh和Sen/Clod）的腹腔灌洗中回收的细胞总产量。(D类)通过免疫染色细胞上的流式细胞术评估，在携带SC的处理小鼠的腹膜灌洗中存在的巨噬细胞的量表示为活CD45阳性细胞群体中存在的F4/80阳性细胞的百分比。对治疗后整个灌洗液的细胞裂解液进行荧光素酶活性分析(E类)和β-半乳糖pH值6活动(F类)，标准化为单元格编号。所示值为平均值+/-SEM（n=3-7只小鼠/组）。ns=无统计学意义，p>0.05；n.d.=不可检测，所示值表示所分析的每个细胞数的检测极限（定义为背景读数的2倍）。
确认损失体内用氯膦酸钠治疗后，小鼠体内的生物发光是巨噬细胞清除的结果，在给药载体或氯膦酸酯脂质体后，收集含有海藻酸盐包埋SC的小鼠的腹腔灌洗液进行分析。首先，测定了氯膦酸盐处理对腹腔灌洗细胞产量的影响。而在幼稚小鼠和携带空藻酸盐珠（～5×106细胞），对于接种藻酸盐包埋SC的车辆处理小鼠，大量细胞渗入腹腔（2.6×107细胞；与空珠组相比，细胞产量增加了5倍以上；p≤0.0001）（图). 氯膦酸钠治疗携带藻酸盐包埋SCs的小鼠导致腹腔灌洗的产量下降，细胞计数与对照组相似（3.2×106单元格）。
接下来，在含有海藻酸钠包埋SCs的小鼠中，证实了氯膦酸钠处理小鼠的巨噬细胞清除率，其中流式细胞术分析显示F4/80的比例+经氯膦酸盐处理后，灌洗液中的细胞减少到1%以下（图). 这与我们的观察一致，即氯膦酸钠治疗有效地耗尽了这些小鼠脾脏中的F4/80阳性细胞(补充图S2A和S2B). 评估氯膦酸钠治疗对荧光素酶和β-半乳糖存在的影响pH值6对携带SCs的小鼠的活性、腹腔灌洗液渗出的细胞裂解物进行测定。在接受氯膦酸钠治疗的所有小鼠的灌洗液中，均未检测到荧光素酶活性，在溶媒治疗组和氯膦酸酯治疗组之间，荧光素酶活性降低了47倍以上（p≤0.01）（图). 氯膦酸盐治疗小鼠灌洗液中萤光素酶活性的丧失伴随着β-gal的减少pH值6活性，与车用小鼠相比减少了37倍（p≤0.01）（图). 因此，与灌洗液中分类细胞群的分析一致，体内氯膦酸钠治疗含有海藻酸盐包埋SCs的小鼠导致p16（Ink4a）/β-gal耗竭pH值6-腹腔巨噬细胞阳性。
氯膦酸盐处理有效地耗尽了测量到的大部分发光信号体内（与车辆处理相比，减少了～80%）。然而，剩余发光信号仍然存在，大约是初始基线测量值的6倍（即SC注入之前）。因此，我们试图确定荧光素酶信号的其他来源体内。对载SCs的车用和氯膦酸钠处理小鼠的褐藻胶珠的组织学分析表明，氯膦酸钠在从包裹褐藻胶球的细胞中清除F4/80阳性细胞方面效率低下，这表明脂质体可能无法进入胶囊的内细胞层。(补充图S3A). 用流式细胞仪分析从藻酸盐颗粒中分离出来的细胞，以确定细胞组成，证实氯膦酸盐对封装细胞的组成没有显著影响(补充图S3B). 与我们之前的观察一致，巨噬细胞是荧光素酶和β-半乳糖的最大贡献者pH值6腹腔灌洗的活性、氯膦酸钠不能成功地从藻酸盐颗粒中耗尽巨噬细胞与荧光素酶和β-半乳糖水平未改变有关pH值6从裂解物测得的活性(补充图3D和3E). 综合起来，这些数据强烈表明生物发光信号仍然存在体内氯膦酸钠治疗后，由于海藻酸钠珠周围持续存在巨噬细胞。
氯膦酸盐脂质体耗尽p16（Ink4a）-和β-半乳糖pH值6-按时间顺序衰老的小鼠中的阳性细胞
我们的数据表明，巨噬细胞通过增加数量和/或激活状态，能够产生生物发光信号，通过生物发光成像很容易检测到。接下来，我们评估了巨噬细胞是否对按时间顺序老化的p16中发光信号的增加起作用LUC公司老鼠体内90周前p16的生物发光信号LUC公司小鼠比13周龄小鼠高9.0倍（图). 为了确定巨噬细胞是否有助于增强信号，通过氯膦酸盐脂质体在吞噬细胞耗竭前后测量生物发光（图). 基于信号强度的基线测量，将小鼠随机分为治疗组。由于不知道摄入载体脂质体如何影响旧p16吞噬细胞的生物发光LUC公司以PBS单用小鼠和载脂脂质体（PBS中）作为对照。平均而言，氯膦酸钠治疗导致老年小鼠两个对照组之间p16（Ink4a）表达的差异为1.5倍（p≤0.05）。PBS和载体脂质体组治疗后荧光素酶活性下降>20%的老年小鼠的百分比分别为0%和17%，而氯膦酸钠治疗组为67%。这些发现表明，在按时间顺序衰老的小鼠中，吞噬细胞对p16（Ink4a）启动子驱动的报告信号有贡献。
氯膦酸钠治疗耗尽p16（Ink4a）阳性和β-半乳糖pH值6-时间老化p16的阳性细胞LUC公司老鼠(一个)年轻人（13周）与老年人（90周）腹部的生物发光基线读数p16LUC公司小鼠（n=5和17只/组）。几何平均值显示在图表上。(B-C）根据腹部生物发光将老年小鼠随机分为3组（每组5-6只）：PBS治疗组、PBS中的载脂脂质体（Veh）或氯膦酸脂质体（Clod）。在两次氯膦酸盐治疗后（静脉注射，前三天和静脉注射，发光测量前一天）测量腹部的生物发光。(B类)p16的代表性序列图像LUC公司小鼠在治疗方案前后呈现发光（以发光度表示）。彩色标尺表示最小和最大阈值的相对发光信号强度，以辐射度表示。(C类)来自治疗p16腹部的发光信号量（总通量；p/s）LUC公司小鼠表示为与治疗前测量值相比的倍差。几何平均值显示在图表上。(D类)从载体和氯膦酸盐脂质体处理的90周龄p16中收集白色脂肪组织（iWAT和vWAT）的腹股沟和内脏（性腺周）堆积物LUC公司小鼠和β-gal染色pH值6活动。展示了具有代表性的照片。(E类)β-gal的代表性光学显微镜图像（放大200倍）pH值6-染色的内脏脂肪组织用核固红复染。脂肪细胞之间的细胞（以核染色的存在为标志）为β-半乳糖pH值6-负值（白色箭头）或-正值（黑色箭头）。这些细胞在氯膦酸钠处理小鼠的大区域中完全缺失（如图所示）。(F类)β-gal的代表性图像pH值6-小鼠脂肪间充质干细胞p16的染色培养LUC公司小鼠早期传代（p1培养）或20Gyγ射线照射后10天（衰老）。β-半乳糖SCs染色阳性pH值6并且在形态上与早期传代有所不同。(G公司)使用50μg/mL氯膦酸盐脂质体（Clod）或类似的载体脂质体（Veh）或PBS（未处理）稀释液（1:100）隔夜（20小时）后衰老的mAdMSCs的相差光学显微镜图像，表明没有观察到细胞死亡或对这些细胞的影响。
脂肪组织被认为是年老小鼠SCs和慢性炎症的主要来源[15，23]。老年小鼠有白色脂肪组织，β-半乳糖染色阳性pH值6与幼鼠相比的活动[23]。确定巨噬细胞是否有助于β-半乳糖池pH值6-90周龄p16小鼠脂肪组织中的阳性细胞LUC公司用含有PBS（载体）或氯膦酸盐的脂质体处理小鼠，收集腹股沟和内脏（性腺周围）白色脂肪组织的仓库进行分析。β-半乳糖染色的整片脂肪pH值6活性表明，与经载体处理的小鼠相比，经氯膦酸钠处理的小鼠的吞噬细胞清除导致染色显著减少（图). 对相同背景和相反性别的老龄野生型小鼠（雄性C57BL/6；64周龄）进行治疗后，也获得了类似的结果。
研究表明，氯膦酸盐脂质体可消耗小鼠白脂肪组织不同部位的巨噬细胞[48，49]。为了确认这一点体内氯膦酸钠治疗成功清除β-galpH值6-阳性细胞，β-galpH值6-染色脂肪在核复染后通过光学显微镜进行分析（图). 在以PBS作为对照的90周龄小鼠中，我们观察到β-半乳糖的存在pH值6-阳性细胞就地分布于内脏脂肪组织中成熟脂肪细胞之间。相反，在接受PBS治疗的年轻小鼠（13周龄）的脂肪组织中，脂肪组织中的相同位置存在细胞（通过核染色评估），但这些细胞β-半乳糖阴性pH值6染色。这些结果证实了β-galpH值6-脂肪组织中的阳性细胞随着年龄的增长而积累。载体脂质体治疗老年小鼠对β-半乳糖的存在几乎没有影响pH值6-脂肪细胞间散布阳性细胞；然而，与PBS处理的老龄小鼠相比，这些细胞的染色更为强烈。与其他三组不同，氯膦酸盐治疗导致两种β-gal的缺失pH值6-成熟脂肪细胞之间的阳性细胞和核染色表明，这些细胞被氯膦酸钠有效清除。此外，表达高水平β-半乳糖苷酶的细胞（通过抗GLB1抗体评估免疫荧光染色）被发现为F4/80阳性(补充图4). 在氯膦酸钠治疗后，这两种标记物的出现也减少了。总之，我们的数据表明，老年小鼠内脏脂肪组织中的巨噬细胞主要为β-半乳糖苷酶阳性。
最近的文献认为β-半乳糖的增龄性增加pH值6-脂肪组织中的阳性细胞与衰老前脂肪细胞的出现[23]。然而，我们证明吞噬细胞对绝大多数β-gal有贡献pH值6按时间顺序衰老的小鼠的染色。为了评估衰老的脂肪间充质干细胞是否具有足够的吞噬活性以被氯膦酸盐清除，我们首先从p16的脂肪间质血管部分建立了原代培养物LUC公司老鼠。首次传代这些培养物后，观察到最小的巨噬细胞污染（<5%）。原代细胞衰老诱导在体外（20 Gyγ射线照射后培养10天）引起SCs的共同特征，包括增殖丧失、形态扩大和β-gal阳性pH值6染色（图). 此外，这些培养物显示出早期传代培养物中p16（Ink4a）启动子驱动的荧光素酶活性增加了9.7倍（p<0.0001）（352±17.1 p/s/cell x10）三)衰老培养物（3404±89.8 p/s/cell x10三). 然而，在体外用氯膦酸脂质体处理SC培养物对这些SC培养物的外观或生存能力没有影响，对荧光素酶活性也没有影响（图)与未经处理和载体脂质体处理的SC培养物相比。正如预期的那样，同样剂量的氯膦酸钠能有效清除幼年小鼠的粘连-选择性腹腔巨噬细胞（数据未显示）。氯膦酸依赖性清除β-半乳糖的机制pH值6-阳性细胞需要足够水平的吞噬活性，这是以前与衰老基质无关的表型。这些数据强烈表明β-galpH值6-原位脂肪组织中观察到的阳性细胞是巨噬细胞和/或其他专业吞噬细胞。
讨论
p16（Ink4a）/β-半乳糖的药理消除pH值6-小鼠体内的阳性细胞（两者在遗传上都容易加速衰老[21]和野生型[23])提高了生理性能，与恢复活力（生物年龄减少）相一致。由于两者都代表了SC的众所周知的特征，这些观察结果被令人信服地解释为支持SC假说的论据[39，50，51]以及旨在生成和使用解衰老化合物作为潜在抗衰老药物的研究[52–56]。这里我们证明巨噬细胞可以获得相同的特征组合体内用海藻酸钠珠中嵌入的SC产生的未知因子刺激后。此外，p16（Ink4a）/β-gal的显著比例pH值6-小鼠组织中积聚的阳性细胞体内在时间老化过程中，巨噬细胞也具有其特性，因为它们可以被氯膦酸盐脂质体选择性杀死[49，57，58]，表明其吞噬能力不是SC的特征。
尽管这些数据与声称的SC在衰老中的作用并不矛盾，但他们呼吁对这一假设进行重大修改。它们指向一种新型细胞，p16（Ink4a）/β-galpH值6-阳性巨噬细胞也会随着年龄的增长而积累，在Baker等人的实验中，这些巨噬细胞很可能从老年小鼠的机体中被药物清除[21，23]和Demaria等人[22]。因此，这种巨噬细胞亚群与SC有同样的权利被视为衰老的可能促因。显然，这两种细胞类型对年龄相关性炎症的相对影响尚待确定。
当前研究的主要发现被纳入图中所示的假设模型中.快速消除在体外-将产生的SC腹膜内植入小鼠被解释为识别和消除这种细胞的特定免疫机制的活性。一贯地，先天免疫的多种细胞成分，包括巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞，集中在植入含有SC的藻酸盐珠的小鼠的腹腔内，可能代表SC通过SC分泌产物吸引其“受害者”的SC“杀手”。这表明，活性分泌（SASP）和从含SC的藻酸盐小球释放的其他因子是“find-me”和“eat-me”信号的一部分，这些信号将免疫细胞吸引到SC，类似于对死亡细胞的清除[三，59–62].
假设模型示意图体内p16（Ink4a）/β-gal的积累pH值6-自然老化生物体中的阳性细胞在年轻哺乳动物中（顶面板），p16（Ink4a）/β-gal分泌SASPpH值6-阳性SCs有助于吸引有效靶向和破坏SCs所需的先天免疫成分。SC分泌物激活招募的巨噬细胞，诱导p16（Ink4a）/β-galpH值6-阳性表型。成功根除SCs后，炎症因子消退，组织内稳态恢复。这种分辨率导致p16（Ink4a）/β-gal的损失pH值6-当具有这种表型的巨噬细胞被清除或释放其激活状态时，组织中的阳性细胞。然而，在老年动物中（底部面板），先天免疫损伤导致无法有效识别或破坏SC。这导致由SCs和SC-相关巨噬细胞（SAM）分泌产物诱导的慢性炎症的形成。SAM的积累可能是未解决的先天免疫反应的一种表现，导致慢性无菌全身炎症，这是衰老生物体的典型特征。
早期的报告描述了中性粒细胞和NK细胞在SC消除中的作用[41，42，63，64]似乎与我们对SCs所吸引的免疫细胞含量的观察相矛盾。这种明显的争议可以用实验条件的差异来解释：上述报告主要集中在SC识别和杀伤的早期阶段，而我们在SC植入后的10多天内描述了SC分泌吸引的细胞的含量。我们的实验装置能够从免疫隔离的SC中延长生物活性分子的释放。这使得我们能够观察到p16（Ink4a）/β-galpH值6-通过巨噬细胞的持续吸引和/或表型转换，在腹腔内表达巨噬细胞聚集。
值得注意的是，早期将β-半乳糖苷酶活性升高描述为小鼠腹腔巨噬细胞成熟的标志体内和在体外[65，66].
巨噬细胞被证明在凋亡细胞存在的情况下上调β-半乳糖苷酶活性，其中内源性β-半乳糖苷酶活性的强度，即使在pH 7.3下测定，也被发现是体内p53应答细菌LacZ报告子辐射后的模型[67]。与衰老不同，巨噬细胞向β-半乳糖苷酶表达表型的转变与p53无关，就像p53中的巨噬细胞一样−/−小鼠凋亡区β-半乳糖苷酶活性[68]。然而，β-半乳糖苷酶活性不是任何类型巨噬细胞激活的标志，因为硫代乙醇酸或细菌激活的巨噬细胞显示β-gal表达降低[65].
巨噬细胞中p16（Ink4a）的诱导也不是唯一归因于SCs的暴露。p16（Ink4a）蛋白与巨噬细胞极化和促炎信号的激活有关：在体外非基因IFN-γ极化的M1巨噬细胞表达的p16（Ink4a）水平高于IL-4极化的人类M2巨噬细胞。期间在体外骨髓源性巨噬细胞分化时，p16（Ink4a）蛋白表达增加，与F4/80标记物的诱导平行。然而，这种增加并不影响分化细胞的细胞周期分布。在异位p16（Ink4a）表达时，初级巨噬细胞也具有类似的极化特性[69，70]。村上等人[71]最近的研究表明，p16（Ink4a）调节小鼠和人类巨噬细胞中IRAK1的降解以及随后IL-6的分泌，但不调节成纤维细胞。此外，另一种衰老相关肿瘤抑制因子p19ARF被报道为一种新的p53诱导的巨噬细胞炎症反应调节因子，可调节TLR信号[72，73]。因此，衰老相关巨噬细胞（SAM）表型的诱导可能并不特别需要SCs，而是代表对某些自然生理刺激的特定类型的巨噬细胞激活或分化。目前尚不清楚p16（Ink4a）/γ-gal是否积聚pH值6-老年小鼠组织中的阳性巨噬细胞依赖于SCs。无论p16（Ink4a）/γ-gal的性质如何pH值6-阳性巨噬细胞，与年轻小鼠相比，它们在老年小鼠组织中的数量要高得多，这可能反映了老年动物中激活因子的组成性存在，或者反映了它们“排泄”（恢复到先前表型）或消除的年龄相关缺陷。后一种可能性如图所示在任何一种情况下，SAM的积累都可能是未解决的先天免疫反应的表现，导致老年生物体典型的慢性无菌系统性炎症。
药物根除p16（Ink4a）/γ-gal的积极生理后果pH值6-小鼠的阳性细胞[21，23]令人信服地将这些细胞定义为可能的炎症源以及治疗和预防衰老的靶点。我们的发现并没有动摇这一令人兴奋的结论，而是建议重新考虑此类细胞的性质，从而改变抗衰老药物发现的重点：从SC-靶向衰老化合物到能够靶向其他p16（Ink4a）/γ-gal的药物pH值6-我们的工作中描述了阳性细胞，如巨噬细胞亚群SAMs。事实上，最近报道的衰老化合物具有抗衰老活性的迹象[52，55，56，74]在p16（Ink4a）阳性细胞根除后的小鼠中，与Baker等人所描述的情况不同，且不太明显[21，23]并且可能反映出对SC作为炎症的唯一来源的夸大看法。
材料和方法
细胞培养
初级人类新生儿皮肤成纤维细胞（NDFs；AllCells，LLC）从三个不同的供体中平均汇集。NDF保存在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中，酚红添加10%（v/v）FBS（Gibco；Grand Island，NY）、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺以及1X MEM非必需氨基酸。细胞在37°C和5%CO的组织培养箱中培养2通过TrypLE（Thermo Fisher Scientific）酶解后，通过连续传代将NDF保持在<80%的合流率。GLuc表达的NDF细胞（NDF-GLuc）在慢病毒转导PGK1启动子驱动的报告子构建物后被筛选，该报告子构建体由Genscript合成并克隆到pRSIT载体（皮斯卡塔韦，纽约）。这种结构组成性地表达分泌高斯原理荧光素酶（“8990”突变体[75])，v5标记组蛋白H3和来自同一转录物的嘌呤霉素，由T2A序列分离。NDF常规检测支原体，并使用MycoAlert支原体检测试剂盒（Lonza）确认为阴性。
从年轻p16的腹股沟脂肪组织的基质血管部分建立脂肪来源的间充质基质细胞（mAdMSC）的原代培养物LUC公司小鼠，如上所述[76]。将分离的贴壁培养物保存在补充有15%FBS和1X抗菌/抗真菌溶液（Thermo Fisher Scientific）的DMEM/F12培养基中，放置在37°C、5%CO的三气体组织培养箱中2和3%O2每周更换两次培养基，当细胞达到约80-90%的融合时进行细胞传代。为了诱导衰老，第1代细胞在20Gy的悬浮状态下受到辐射，并且重新培养的细胞保持在21%O2和5%CO2.
动物
具有萤火虫荧光素酶（p16）半合子p16（Ink4a）敲除的雄性和雌性C57BL/6J小鼠墨水4a/Luc)来自我们的繁殖群体，最初来自Normal E.Sharpless博士[40]。雄性C57BL/6J野生型小鼠来自Jackson Laboratories（ME巴尔港），雌性NIH瑞士小鼠[Cr:NIH（S）]来自Charles River（MA威明顿），雄性C.B-Igh-1blcrTac-Prkdcscid/Ros小鼠（SCID）来自Roswell Park Cancer Institute（纽约州布法罗）的动物设施。
向动物提供商业啮齿动物饮食（哈兰市Teklad LM-485鼠/鼠绝育饮食，5%7012）和可随意饮用的无菌饮用水。在整个研究期间，所有动物都被限制在环境可控的有限出入设施内，并保持在18-26°C、30-70%空气湿度、12h光/暗周期。这些动物被安置在无致病条件下的微型隔离笼中，如有必要，在实验开始前至少5天在隔离笼中进行驯化。罗斯韦尔公园癌症研究所动物护理和使用委员会（IACUC）批准了本实验中的动物使用。
微载体珠培养
将Dry CytoPore™2珠（GE Healthcare；Marlborough，MA）在70%乙醇中水合消毒15分钟，在PBS中洗涤，并在4°C下与含有10%FBS的完整培养基培养过夜。通过与新提取的NDF细胞悬浮液孵育，以500万个细胞与1 mL填充的水合珠体积的比率将细胞附着到这些改良的基于纤维素的大孔微载体珠上。使用完整的DMEM培养基在250-mL组织培养级排气盖Erlenmeyer烧瓶中进行微载体珠培养，每1mL水合填充珠体积20-40 mL，放置在组织培养箱内的旋转振动器上。接种CytoPore™2微球三天后，将细胞切换到含有0.2%FBS的完整培养基（静止状态），或通过放射性Cs源（Shepherd MK I-68γ射线发生器）暴露于20 Gyγ射线照射（衰老状态），并在培养基中再维持3-4天，最多2周，每3-4天更换一次媒体。
为了将辐照过的NDF微载体培养物包埋到海藻酸钠珠中，将400μl胞核珠与600μl 3%海藻酸钠溶液混合。充分混合后，将悬浮液装入1-mL注射器中，并安装在输液泵（5-mm）上。海藻酸盐封装程序基于位于100 mM SrCl上方24 cm处的气动单喷嘴装置2凝胶溶液，通过磁力搅拌棒（700 rpm）持续搅拌。将海藻酸钠中的悬浮NDF微载体培养物以0.8 mL/min的滴注速度和6-9 L/min的空气流速喷入凝胶溶液中。将海藻酸钙涂层珠在凝胶溶液中培养5分钟，然后在PBS中彻底清洗并转移到温暖的完全培养基中。注射前，在组织培养箱中的摇床上培养珠子至少24小时。
海藻酸钠微球中SCs的封装
超纯低粘度（20-200 mPas）海藻酸钠（PRONOVA UP LVG）粉末购自NovaMatrix（挪威Sandvika）。将海藻酸盐粉末溶解在1%（w/v）甘露醇溶液中以制备3%（w/v）的海藻酸钠溶液。将最终溶液过滤灭菌（0.2μm）并储存在4°C下。100 mM氯化锶（SrCl）溶液2)（Sigma）溶于无菌水中用于海藻酸钠凝胶化。NDF细胞在20Gy照射悬浮细胞之前进行同步处理（在高汇合度下转换为0.2%FBS过夜）。然后在完全培养基（10%FBS）中以亚流密度重新镀膜细胞至少3天。将辐照后的NDF细胞提起，在PBS中清洗，并在100μl盐水中重新悬浮。然后将该细胞悬液与3%海藻酸钠溶液（0.9mL）混合，在彻底混合后，立即装入1mL注射器中进行挤压。海藻酸盐封装程序基于位于100 mM SrCl上方14cm处的气动单喷嘴装置2凝胶溶液，通过磁力搅拌棒（125 rpm）持续搅拌。将海藻酸钠中的NDF细胞悬浮液以0.6 mL/min的滴注速度和7 L/min的空气流量喷入凝胶溶液中。将海藻酸钙涂层珠在凝胶溶液中培养5分钟，然后在PBS中彻底清洗，并转移到温暖的完全培养基中。注射前，将珠在组织培养箱中的摇壶上培养至少24小时。通过Calcein AM（Thermo Fisher Scientific）/碘化丙啶（Sigma）染色活/死细胞，验证了海藻酸钠珠中嵌入的衰老NDF细胞的活性。
衰老NDF的植入
NDF细胞的微载体微珠培养物（有或没有藻酸盐涂层）在干净的RPMI培养基（Gibco；Grand Island，NY）中清洗三次，并通过16号针头将约300μl的填充微珠体积（200至300万个细胞）腹腔注射到异氟醚麻醉小鼠体内。由于树突状细胞可以直接嵌入海藻酸盐中，因此在海藻酸盐封装之前，无需在微载体珠上预先建立细胞。此外，直接嵌入产生了更多大小均匀的珠子，用于研究免疫系统反应的影响。将SC包埋的海藻酸钠珠（悬浮在海藻酸钠中的细胞）注入类似于微载体珠的溶液中。
氯膦酸盐处理
脂质体氯膦酸盐（Clodrosome®；5 mg/mL）和PBS中的脂质体载体（Encapsome®）来自Encapsula NanoSciences（Brentwood，TN）。这些脂质体制剂或PBS对照品（如图所示）以每只小鼠200μl注射剂（20-40 mg/kg）的形式通过腹腔内或静脉注射给小鼠。每只小鼠注射两次，间隔2-4天。对于使用海藻酸钠珠的实验，给小鼠两次腹腔注射，在最后一次注射后1-2天收集灌洗液和海藻酸钠粒。用于老p16的治疗LUC公司小鼠，小鼠接受第一次腹腔注射，2天后通过尾静脉进行第二次静脉注射。最后一次治疗后1-2天，从小鼠体内采集脂肪组织（腹股沟或性腺周围内脏脂肪）。
对于在体外用培养基清洗细胞培养物一次，然后用补充有1:100稀释的氯膦酸脂质体悬浮液（50μg/mL氯膦酸酯）、脂质体PBS对照或D-PBS对照（未处理）的培养基培养。在与处理一起孵育期间，细胞在标准条件下保持20小时。然后用D-PBS清洗盘子两次并拍照。然后提取细胞以测定荧光素酶活性。
生物发光成像
小鼠腹膜内注射200μl不含钙和镁的15 mg/mL D-荧光素钾盐（Syd Labs；马萨诸塞州波士顿）D-PBS溶液。注射后10分钟，异氟醚麻醉小鼠被放入IVIS光谱体内生物发光成像系统（PerkinElmer；Waltham，MA），用于检测荧光素酶活性（60秒曝光）。p16中的生物发光LUC公司通过Living Image®软件将小鼠量化为腹部发光信号的总通量（p/s）。
收集腹腔灌洗液和藻酸盐珠
将海藻酸钠珠植入腹膜后2至3周，从CO中收集腹腔灌洗液和游离海藻酸钠小球2-窒息的老鼠。剖开覆盖腹部的皮肤，露出完整的腹膜腔。然后用27克的针头将7毫升2%热灭活的FBS注入生理盐水中。轻轻按摩腹部后，用25号针头收集腹腔灌洗液。然后在制备细胞裂解物之前，将洗液储存在冰上。使用Via1-Cassette™测量收集的腹腔灌洗液的细胞密度，通过吖啶橙和DAPI染色在NucleoCounter®NC-200（ChemoMetec；Allerod，丹麦）上定量灌洗液中有核细胞的活细胞和死细胞计数。然后将腹腔灌洗液造粒（400 x g，4°C下5分钟），重新悬浮在从BD Biosciences（加州圣何塞）购买的BD Pharm Lyse赖氨酸缓冲液中（在无菌双蒸馏水中稀释至1倍），并在室温下黑暗中培养7分钟。在造粒细胞和在PBS中重新悬浮之前，添加三体积的完整培养基。
为了收集藻酸盐珠，打开腹部壁。然后用含有2%热灭活FBS的盐水从腹膜腔冲洗珠子。在分析之前，将珠子在PBS中清洗数次。用CyQuant®Direct Cell Proliferation Assay（Thermo Fisher Scientific）对封装藻酸盐小球的小鼠免疫细胞进行染色，并通过荧光显微镜对活免疫细胞的染色细胞核进行成像。
细胞裂解物的制备
红细胞溶解后，重新计算灌洗液的细胞悬液，并将等量的细胞转移到Eppendorf试管中进行离心（400xg，4°C下5分钟）。通过重新悬浮相等数量的灌洗细胞或体外将海藻酸钠珠放入1X Reporter Lysis Buffer（Promega）中，加入0.5%Triton X-100（Sigma）和1:100稀释的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-）。在室温下搅拌溶解5分钟，然后将样品放回冰中。使用凝胶加载吸管尖端，将细胞提取物从海藻酸钠珠中取出，放入干净的Eppendorf管中。通过离心（16000 x g，在4°C下10分钟）澄清裂解液，并将其储存在冰上，直到用于酶分析。根据制造商的说明，使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific；Waltham，MA）测量细胞裂解物的蛋白质浓度。
流式细胞术
染色前，用BD Pharm Lyse赖氨酸缓冲液（在无菌双蒸馏水中稀释至1X）处理小鼠腹腔灌洗细胞，以进行红细胞溶解，然后在流式细胞术染色缓冲液（eBioscience；加州圣地亚哥）中清洗并重新悬浮。使用酶解试剂TrypLE从海藻酸珠胶囊中释放细胞。用抗CD16/CD32抗体（克隆93，eBioscience）阻断10分钟后，用以下8色染色组合的表面受体荧光铬结合抗体对细胞进行染色：FITC-标记的抗Ly-6G（1A8，Miltenyi Biotec）；V500标记的CD11b（M1/70，BD Horizon）和来自eBioscience的抗体：PE标记的抗CD335（29A1.4）；PE/Cy5.5标记的抗CD19（eBio1D3）；PerCp-eFluor710标记的抗CD170（1RNM44N）；APC标记的抗CD45.2（104）；APC-eFuor780标记为F4/80（BMB）；eFluor450标记的抗Ly-6C（HK1.4）。在黑暗中的冰上培养30分钟后，用流式细胞仪染色缓冲液清洗细胞，并在相同的缓冲液中重新悬浮。为了区分死细胞，在采集前三分钟，将不渗透DNA染色剂Bobo3（俄勒冈州尤金市分子探针）添加到细胞悬浮液（最终浓度为20 nM）中。所有的分类和分析实验都是使用BD FACS Diva Software（BD Biosciences）在罗斯韦尔公园癌症研究所FACS设施的BD免疫细胞术系统定制仪器（分别为FACSAria I或LSRII）上进行的。收集0.2至1×10的数据6并使用FCS Express 4（De Novo Software；加利福尼亚州格伦代尔）进行分析。为了区分自荧光细胞和表达低水平单个表面标记的细胞（在CD11b、Ly-6G、F4/80和CD335标记的情况下），我们通过用荧光-减去一个控制染色组的样品染色来确定自荧光的上限，其中省略了感兴趣通道的试剂。使用用OneComp珠（eBioscience）或单染色细胞悬浮液制备的单色对照物进行补偿，并使用FACS Diva软件（用于分类）或FCS Express（用于成分分析）进行计算。
免疫荧光
组织样品被放置在塑料模具中，模具中填充NEG-50冷冻切片培养基（Fisher），并在2-甲基丁烷和干冰的浆液中进行snap冷冻。在CM1900冷冻刀（Leica）上切割12μm厚的新鲜冰冻切片，置于Histobond载玻片（StatsLab）上，干燥15分钟，并在−20°C下保存，直到染色。染色前，将载玻片加热至室温，用4%甲醛在PBS中固定5分钟，用PBS洗涤3次。切片用封闭溶液（5%正常驴血清，0.25%triton x-100，PBS）孵育，并用AlexaFluor488偶联的大鼠单克隆抗F4/80抗体孵育（BioLegend，1:50稀释）；与Cy5缀合的大鼠单克隆抗B220抗体（eBioscience，1:50稀释）；和与Cy3结合的小鼠单克隆抗平滑肌肌动蛋白（SMA）抗体（Sigma，1:1000稀释）。所有抗体在封闭溶液中稀释。染色切片用ProLong Diamond防褪色试剂和DAPI（Invitrogen）进行安装。为了对整个脂肪进行染色，组织首先在4°C的4%多聚甲醛中固定5小时。然后在PBS中清洗脂肪组织，在封闭溶液中孵育1小时，用兔多克隆抗GLB1（Abcam，1:200稀释）染色4小时，然后通过与AlexaFluor488（Jackson ImmunoResearch，2 ug/ml，2小时）结合的驴抗兔IgG二级抗体进行检测，和与AlexaFluor488偶联的大鼠单克隆抗F4/80抗体（BioLegend，1:50稀释）。免疫染色组织在80%果糖中孵育过夜，然后用Hoechst 33342（0.5μg/ml）进行核复染15分钟。染色切片和整个组织在配备有表荧光和AxioCam MRm数码相机（卡尔蔡司公司）的AxioImager Z1显微镜下进行分析。使用AxioVision软件（卡尔蔡司公司，4.5.3版）拍摄并处理图像。
萤火虫荧光素酶测定
根据制造商的说明，使用Bright-Glo™荧光素酶分析系统（Promega；麦迪逊，威斯康星州）对细胞裂解物的荧光素酶活性进行了少量修改。简言之，将细胞裂解物（如前所述）或D-PBS中的细胞悬浮液加入96孔白板（OptiPlate-96，Perkin Elmer）中，然后加入等体积的2倍重组Bright Glo™测定试剂。在Infinite®M1000 PRO微孔板阅读器（Tecan；瑞士梅内多夫）上采集发光信号。使用来自技术复制品的平均最大信号来估计每个样品的荧光素酶活性。用等量的2x荧光素酶试剂与D-PBS或裂解缓冲液（视情况而定）孵育后，测量背景读数。从样品信号中减去背景信号，并根据每个反应的细胞数或蛋白质含量进行标准化。计算每个样本的背景信号与样本信号之比（信噪比）。样品信号低于背景2倍被认为是不可靠的。为了估计给定样品的检测阈值，将背景信号归一化为反应中的细胞数或蛋白质量。
高斯（Gaussia）荧光素酶测定
定期（每周两次，最多28天）从携带用GLuc报告体转导的NDF细胞的SCID小鼠的大隐静脉（50μL）中采集血液，并将其放入肝素化收集瓶（Sarstedt；Nümbrecht，德国）。血浆在4°C下以10000 x g离心7分钟后获得，并在−80°C下保存，无明显信号损失。为了测量GLuc活性，将血浆在含有0.1%Triton X-100的PBS中以1:10的比例稀释到实心白色96-well微孔板中。接下来，向稀释的血浆样品中添加两份体积为100μM的辅以0.3M抗坏血酸和0.1%Triton X100（pH 7.5）的辅以1X PBS的柯尔酮嗪溶液，并使用500ms积分时间在微孔板光度计（Tecan）上立即测量发光信号。科伦特嗪是从NanoLight Technologies（亚利桑那州Pinetop）获得的一种干粉；将5 mg/ml的酸化乙醇储备溶液储存在−80°C。
β-gal的测定pH值6活动
β-加仑pH值6如前所述，对冷冻切片新鲜冷冻组织或整个脂肪组织的活性进行分析[77]。简单地说，用2%（v/v）副甲醛和0.2%（v/v）戊二醛将冰冻切片固定5分钟，在PBS中洗涤，并用0.1%（v/w）X-Gal在含有2 mM MgCl的100 mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液（pH 6.0）中孵育2，150 mM氯化钠，5 mM钾三铁（CN）6，5 mM K4铁（CN）6和0.02%（v/v）NP-40（37°C），并监测X-Gal产品的开发长达18小时。通过在PBS中清洗载玻片停止反应，然后用核固红进行复染（Ricca Chemical Company；德克萨斯州阿灵顿）。内脏和腹股沟脂肪的处理类似。
β-半乳糖苷酶的荧光底物4-MUG（4-甲基伞形花序基β-D-吡喃半乳糖甙；Sigma-Aldrich）用于定量在β-galpH6条件下（即pH 6.0）测定的细胞裂解液中的酶β-gal活性。在96 well白色微孔板中，将5μl稀释的细胞裂解液与45μl荧光β-galpH6反应缓冲液相结合：1 mM 4-MUG置于100 mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液中，pH 6.0，含有2 mM MgCl2、150 mM NaCl和0.02%NP-40。通过在2小时内定期测量反应混合物的荧光（Ex/Em 360nm/440nm）来确定室温下的产物形成动力学。通过添加150μl 700 mM碳酸钠来确定反应终点。测定每个样品的反应速率（RFU/min），并将每μg蛋白质归一化。
统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism 5.00版（GraphPad-Software，加州圣地亚哥）进行。使用未配对学生的双尾t检验对两组进行统计比较。对于涉及两个以上组的统计比较，使用Bonferroni事后检验进行单向方差分析（ANOVA），或使用Kruskal-Wallis单向方差分析和Dunn事后检验（针对非参数数据）来确定组间差异。当p值小于0.05时，差异被认为具有统计学意义：不显著（ns），p>0.05；*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；****，p≤0.0001。所有数据均表示为平均值±标准误差。
致谢
我们感谢诺曼·夏普莱斯赠送的p16LUC公司老鼠。我们感谢Liliya Novototskaya对小鼠群体进行维护和基因分型，感谢Craig Brackett、David Frescas和Katerina Gurova批判性阅读手稿，感谢Katerina-Andrianova激发讨论，感谢Mikhail Mogutov提供宝贵的建议和支持。埃弗龙生物科学公司（Everon Biosciences）向A.V.G.提供的赠款部分支持了这项工作。
缩写
| 联合国安全理事会 | 衰老细胞 |
| SASP公司 | 衰老相关分泌表型 |
| β-加仑pH值6 | β-半乳糖苷酶活性在SCs标志物pH6.0检测 |
| FACS公司 | 荧光激活细胞分选 |
| GLuc公司 | Gaussia princeps荧光素酶 |
| 静脉注射。 | 腹腔内的 |
| 移动AdMSC | 小鼠脂肪间充质干细胞 |
| 国家发展基金 | 新生儿皮肤成纤维细胞 |
| NK公司 | 自然杀伤细胞 |
| PGK公司 | 磷酸甘油酸激酶 |
| SCID公司 | 严重联合免疫缺陷 |
脚注
基金
这项工作由Everon Biosciences，Inc.资助。
利益冲突声明
A.P.、O.B.C.和A.V.G.是Everon Biosciences的联合创始人和股东。
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