慢性抗衰老治疗减轻老年或动脉粥样硬化小鼠的血管舒缩功能障碍

总结

介绍

缺血性心脏病的危险因素包括高胆固醇血症、动脉僵硬、慢性炎症、高血压、代谢综合征和衰老（Eckel等.,2013). 重要的是，这些风险因素导致内皮功能受损（Feletou和Vanhoutte，2006)有助于动脉重塑并加速动脉粥样硬化斑块的形成和扩张（Landmesser等.,2004).

最近的研究表明，衰老细胞负荷可因时间老化或早衰模型而显著增加（Lecka‐Czernik等.,1997; 贝克等.,2004; 瓦雷拉等.,2005)、高脂肪喂养（Shi等.,2007)、糖尿病（Verzola等.,2008)、烟草暴露（Nyunoya等.,2006)或动脉粥样硬化（Wang和Bennett，2012)以及对按时间顺序衰老或进行性衰老的小鼠进行短期的“衰老”药物治疗，可以缓解一些与衰老相关的表型（朱等.,2015年a,b条). 然而，长期清除衰老细胞对衰老或慢性高胆固醇血症患者血管反应性和结构的影响尚不清楚。

慢性衰老治疗能改善与年龄相关的血管病变吗？

为了确定用达沙替尼和槲皮素（D+Q）进行的去衰老治疗是否能降低衰老小鼠的衰老细胞负荷并改善血管功能，我们将C57BL/6J小鼠用标准食物喂养24个月，然后每月启动一次溶媒或D+Q，持续3个月（即用达沙替尼（5 mg kg）口服灌胃⁻¹)/槲皮素（10 mg kg⁻¹)每月一次鸡尾酒会，持续24至27个月）。TAF公司⁺（端粒相关病灶）细胞核被用作衰老细胞负荷的标记物（休伊特等.,2012). 塔夫⁺溶媒处理小鼠主动脉中细胞亚群（位于血管壁的内皮层和平滑肌层）的细胞核很明显（图1A–B和S1），并被D+Q显著降低（图1A–B和S1）。TAF减少⁺细胞也与D+Q后DNA损伤的减少有关（每个细胞的γ‐H2AX病灶数量）（图1C） ●●●●。

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图1

衰老治疗对衰老细胞负荷的影响，DNA年老小鼠的损伤、血管舒缩功能、一氧化氮信号、钙化和成骨信号。达沙替尼+槲皮素慢性治疗可降低衰老细胞负荷（A–B）和DNA主动脉损伤（C）（高倍下面板的A组假彩色图例：DAPI公司/核（蓝色），γH2A。X（绿色），端粒（红色）。上部图像中的低放大率显微照片被提供作为参考/原点的解剖框架）。白色方块标记在随后的显微照片中放大的区域，端粒相关的病灶在底部面板中编号。慢性衰老细胞清除可独立于硝普钠（E）的变化改善血管对乙酰胆碱（D）的舒张，并显著增加pVASP公司 ²³⁹水平（F）。达沙替尼+槲皮素的慢性衰老治疗也有减少血管钙化（G）的趋势，这与骨基质免疫荧光（H）的适度降低有关。在所有面板中，星号表示第页< 0.05.

在接受溶媒治疗的小鼠中，颈动脉对乙酰胆碱的舒张作用最小，使用隔离器官腔室浴系统进行评估（Miller等.,2010)，在连续3个月接受间歇性D+Q治疗的小鼠中显著改善（图1D） ●●●●。与我们之前在老龄小鼠中使用单剂量D+Q的研究相比，老龄小鼠中衰老细胞的清除并未改变硝普钠对血管的舒张作用（图1E） ，收缩反应峰值在D+Q后增加（图S5，支持信息）。在一个亚组的衰老细胞进行遗传清除后，观察到类似的衰老功效和表型变化墨水‐附件小鼠[允许清除p16^墨水4a通过caspase依赖机制（Baker等.,2011)]从而证实了衰老细胞清除的有效性和表型后果（图S2–S4）。总的来说，这些数据表明，急性衰老治疗通过增加VSMC对NO的敏感性来改善血管舒缩功能，而慢性间歇性衰老治疗通过提高NO的生物利用度来改善血管舒张功能。

为了探讨血管舒缩功能改善的机制，我们检测了内皮一氧化氮合酶磷酸化水平（p‐eNOS^序列1177，表明eNOS激活），但在溶媒治疗组和D+Q治疗组之间没有发现显著差异（图S6）。尽管有此发现，p‐VASP²³⁹（图1F） 是NO激活的cGMP依赖激酶（Sporbert等.,1999)在D+Q处理的老龄小鼠中显著升高。尽管之前的报告表明，年龄相关内皮功能障碍（Turgeon等.,2012; 鲁斯等.,2013)，我们没有发现在解酶处理后NOS相关或NADPH氧化酶相关酶的mRNA水平发生显著变化（图S7–S9）。总的来说，虽然我们的数据表明衰老治疗可以改善老年小鼠的NO信号传导，但这一现象背后的确切分子机制，包括其他内皮衍生舒张因子的潜在作用，尚待阐明。

为了确定衰老治疗是否引起导管动脉的结构变化，我们评估了加压器官腔室系统中颈动脉的压力-直径关系（松本等.,2007). 药物性衰老细胞清除后，未观察到颈动脉横截面顺应性或扩张性的变化（图S10）。然而，主动脉内侧血管钙化往往会因药物细胞清除而减少（图1G） 与之平行的是osterix蛋白水平的变化（图1H） ●●●●。衰老治疗对大动脉结构方面的适度影响可能是由于回归/逆转与年龄相关的结构变化所需的时间或衰老细胞清除的功效（例如，更高和/或更频繁地使用衰老药物）需要引起导管血管钙化或血管顺应性的有害变化的消退。

慢性衰老治疗能改善高胆固醇血症引起的血管病变吗？

在动脉粥样硬化模型中，为了确定用D+Q进行衰老分解治疗是否能减少衰老细胞负荷并改善血管功能和结构，ApoE^−/−给小鼠喂食西方饮食（TD88137；Harlan Teklad）4个月，以使其形成动脉粥样硬化（Dansky等.,1999). 然后每周给药一次溶媒或D+Q（即用达沙替尼（5 mg kg⁻¹)/槲皮素（10 mg kg⁻¹)鸡尾酒）。

与衰老小鼠类似，TAF阳性细胞核在媒介物处理小鼠的主动脉中和内膜斑块中大量存在（图2A–B）。有趣的是，衰老治疗降低了血管中段衰老细胞的负担（图2A–B），但在已形成内膜粥样硬化斑块的区域不存在（图2A–B）。DNA损伤指数与衰老细胞负荷的减少平行：DNA损伤的减少仅在动脉粥样硬化血管的内侧段明显（图2C） ●●●●。

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图2

衰老治疗对衰老细胞负荷的影响，DNA高胆固醇血症小鼠的损伤、血管舒缩功能和一氧化氮信号转导。达沙替尼+槲皮素慢性治疗可降低衰老细胞负荷（A–B）和DNA动脉粥样硬化斑块中的损伤（C），而不是内膜（高倍下面板的A组假彩色图例：DAPI公司/核（蓝色），γH2A。X（绿色），端粒（红色）。上部图像中的低倍显微照片作为解剖参考/来源框架提供）。慢性衰老细胞清除适度改善了血管对乙酰胆碱（D）的舒张作用，但显著改善了对硝普钠（E）的舒张，并显著增加了p电子NOS ^序列1177（F） 和p‐VASP公司 ²³⁹（G） 动脉粥样硬化血管的中膜和内膜。虽然达沙替尼+槲皮素的慢性间歇性衰老治疗并没有改变斑块的脂质组成（H），但衰老治疗确实显著减少了血管钙化（I），这与骨密度免疫荧光（J）显著降低有关。在所有面板中，星号表示第页< 0.05.

与时间老化小鼠不同，D+Q并没有改善器官室浴系统中孤立颈动脉环对乙酰胆碱的反应（图2D） ●●●●。然而，我们确实观察到硝普钠的松弛作用有所改善（图2E） 。血栓素A2激动剂U46619引发的峰值张力在治疗组之间没有差异（图S11）。

尽管对乙酰胆碱的血管舒缩反应缺乏改善，但我们发现D+Q显著增加了p-eNOS水平^第1177页（图2F） ●●●●。与衰老小鼠相似，我们观察到p-VASP增加²³⁹主动脉（图2G） 这表明动脉粥样硬化血管内侧和内膜区的基础NO信号都得到了改善。尽管我们观察到p‐eNOS相对较大的增加^序列1177p‐VASP增加²³⁹水平仍然很低（尤其是与p‐VASP的相对减少相比²³⁹内膜斑块区域自身的水平）。当观察到衰老治疗增加了内膜中NADPH氧化酶相关蛋白（图S13–S14），而不存在与NOS辅因子生成相关的酶的变化（图S12），我们的结论是，血管舒缩功能的改变可能是源于内膜的一氧化氮生物利用度与sGC或介质中下游信号转导分子的氧化状态之间复杂相互作用的结果（Landmesser等.,2004; 费利托和范霍特，2006).

关于衰老药物对主动脉粥样斑块负荷和成分的影响，我们发现接受D+Q 2个月的小鼠内膜斑块大小没有受到影响（图S15），而对油红O染色切片的分析表明，斑块的总脂质含量也不受衰老治疗的影响（图2H） ●●●●。此外，动脉粥样硬化血管中F4/80的表达没有明显变化（图S16），表明巨噬细胞总负荷的变化可以忽略不计。在其他可能性中，这可能与D+Q的内膜斑块外显率有关。新的senolytics的影响，如navitoclax（Zhu等.,2015年a,b条)，尚待确定。然而，我们发现D+Q组内膜斑块钙化显著减少与.载体处理的小鼠（图2一） ●●●●。这与骨肉瘤蛋白质水平的降低有关（图2J） 。衰老细胞清除没有显著改变内膜斑块纤维化（图S17）。鉴于钙化病变通常对经典的降脂干预措施不起作用，并且在血浆胆固醇水平没有变化的情况下发生，这一结果的结合非常显著（图S18）。然而，斑块形态的这些变化与之前的报告一致，这些报告表明，衰老细胞和过度表达与进展综合征相关基因的细胞更容易发生成骨分化在体外（房间等.,2013). 关键的是，与以往利用槲皮素等化合物进行慢性治疗的研究不同（例如，在饮用水中施用）（哈耶克等.,1997; 沈等.,2013)我们的研究表明，每周间断治疗足以在高胆固醇血症小鼠的血管系统中引发持久的分子和功能后果。总之，我们认为这些观察结果为未来的研究奠定了基础，这些研究旨在了解衰老药物单独对斑块组成和稳定性的影响，并将其作为降脂策略的补充治疗。

结论

总之，本研究表明，慢性药物清除衰老细胞可以减轻自然衰老小鼠和动脉粥样硬化小鼠的血管舒缩功能障碍。此外，衰老细胞清除减少晚期内膜斑块的成骨标志物，最终减少内膜斑块钙化。基于这些发现，我们得出结论，衰老细胞清除可能是经典风险因素管理的有效补充治疗，以降低与年龄相关的心血管疾病相关的发病率和死亡率。

资金筹措信息

这项工作得到了R01 HL111121（JDM）、R01 AG013925（JLK）、F30 AG046061（AKP）、Mayo再生医学诊所中心、Connor Group、Noaber Foundation和Ted Nash Foundation的支持。

利益冲突

JK、TT、YZ、TP和AP与本研究相关的财务利益。这项研究已经由梅奥诊所利益冲突审查委员会审查，并正在按照梅奥诊所的利益冲突政策进行。

支持信息

致谢

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