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单元格。作者手稿；PMC 2013年7月22日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2013年1月17日；152(0): 340–351.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2012.12.010
预防性维修识别码：项目经理3718011
尼姆斯：NIHMS486703标准
PMID：23332765

使用第16页INK4a公司-荧光素酶模型

克里斯汀·伯德，1,2 杰西卡·索伦蒂诺，2,三 凯利·克拉克，1,2 大卫·B·达尔，1,2 贾纳基拉曼·克里希那穆尔蒂，1,2 Allison M.交易，2 纳比尔·巴迪西，4 迭戈·H·卡斯特里隆，5 大卫·H·比奇，6和诺曼·夏普莱斯1,2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

在实验上监测体内的癌症和衰老仍然具有挑战性。这里，我们描述了一种荧光素酶敲除小鼠(第16页LUC公司)，它忠实地报告第16页INK4a公司，一种肿瘤抑制和衰老生物标志物。发光寿命评估第16页+/LUC公司小鼠的衰老呈指数级增长，这在同期饲养的同基因小鼠队列中是高度可变的。的表达式第16页INK4a公司随着年龄的增长，并不能预测癌症的发展，这表明衰老细胞的积累并不是癌症相关死亡的主要决定因素。在14个测试肿瘤模型中的14个中第16页LUC公司被早期肿瘤事件局部激活，使肿瘤可视化的灵敏度超过其他成像方式。激活第16页INK4a公司在新出现的肿瘤和周围的基质细胞中发现。这项工作表明第16页INK4a公司激活是所有新兴癌症的特征第16页LUC公司等位基因：肿瘤转化的敏感、无偏见的报告者。

简介

尽管小鼠模型提供了有关衰老和肿瘤发生机制的见解，但这些过程在体内的动力学仍不清楚。基因工程已经产生了忠实模拟人类癌症重要方面的小鼠系统。然而，在这些系统中监测疾病具有挑战性，特别是在早期肿瘤形成的情况下。与临床上使用的成像技术类似的成像技术（如MRI、FDG-PET和超声波）目前正在应用于啮齿动物模型；然而，这些方法的特异性、成本和技术挑战限制了它们的实用性，尤其是在早期检测和序列成像方面。为了应对这些挑战，已经使用了谱系特异性荧光和荧光报告子来动态跟踪肿瘤生长（在O'Neill等人，2010年). 尽管这些等位基因提供了对新生肿瘤的发展、进展和治疗反应的见解，但它们的表达并不局限于潜在的癌细胞，而是局限于肿瘤起源的谱系。相反，文献中报道了几个“肿瘤特异性”报告基因（例如。，E2f-LUC公司[Uhrbom等人，2004年],ARF-GFP公司[Zindy等人，2003年],ODD-Luc公司[Goldman等人，2011年;Safran等人，2006年]、和p21-p-luc[Ohtani等人，2007年])但这些模型并不理想，因为它们在肿瘤发生的后期被激活，局限于体内和序列成像，特定于潜在的肿瘤遗传学，和/或表现出高背景和小动态表达范围。同样，在小鼠衰老的情况下，长期监测也具有挑战性，因为在这种情况下，没有经验证的体内生物标记物。因此，影响衰老的基因修饰和治疗干预的发现目前依赖于耗资巨大的2至3年啮齿动物寿命研究。为了满足这些需求，我们试图利用内源性第16页INK4a公司发起人。

p16的表达INK4a公司限制细胞周期进展和促进细胞衰老以应对多种应激源，包括癌基因激活、端粒侵蚀、活性氧物种和停滞的复制叉(Collado等人，2007年;Sharpless和DePinho，2007年). p16的表达INK4a公司健康细胞中p16含量较低，但一旦被诱导INK4a公司结合并抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）活性，从而促进视网膜母细胞瘤（RB）依赖性细胞周期阻滞。这种肿瘤抑制机制被认为限制了潜在肿瘤的生长，因此，p16INK4a公司-CDK4/6-RB轴在大多数（如果不是全部）人类癌症中被破坏第16页INK4a公司是该途径最常见的病变（参见COSMIC[Forbes等人，2006年]). 尽管p16的诱导INK4a公司作为对致癌刺激的反应，产生有益的抗癌结果，这种肿瘤抑制因子的表达也有助于哺乳动物衰老的各个方面。衰老细胞和p16水平INK4a公司随着年龄的增长逐渐积累(Krishnamurthy等人，2004年;尼尔森等人，1999年;Zindy等人，1997年)与许多组织类型的复制能力下降有关(Chen等人，2011年;Janzen等人，2006年;Krishnamurthy等人，2006年;Liu等人，2011年;Molofsky等人，2006年). 因此，人类多态性影响第16页INK4a公司表达影响对多种年龄相关疾病（如癌症、2型糖尿病和动脉粥样硬化）的易感性(Jeck等人，2012年). 进一步支持p16的因果作用INK4a公司在衰老过程中，减少p16形成或破坏p16的措施INK4a公司-小鼠体内的表达细胞已被证明可以改善几种与年龄相关的表型（例如白内障、肌肉减少和胰腺β细胞功能障碍）(贝克等人，2011年;Berent-Maoz等人，2012年;Carlson等人，2008年;Chen等人，2011年).

利用高动态感应第16页INK4a公司为了应对致癌损伤和衰老，我们生成了一个体内报告系统，第16页LUC公司与以前由基因片段驱动的转基因报告系统不同第16页INK4a公司发起人(贝克等人，2011年;Yamakoshi等人，2009年)，我们选择采用有针对性的“敲门”策略顺式-调控元件位于第16页INK4a公司开放式阅读框(Visel等人，2010年;Witcher和Emerson，2009年). 我们使用了这个第16页LUC公司在定义明确的小鼠系统中监测衰老和肿瘤发生的最早步骤的等位基因。

结果

生成和表征第16页LUC公司阿勒

要生成第16页LUC公司等位基因是萤火虫荧光素酶互补DNA（cDNA），随后是SV40多聚腺苷化信号，靶向内源性第16页INK4a公司轨迹(图1A). 由此产生的敲除等位基因预计对p16无效INK4a公司表达仍保留外显子1α周围的内含子结构。通过Southern分析和PCR验证靶向性后(图S1A和S1B我们通过培养来测试等位基因的功能第16页+/+，第16页+/LUC公司、和第16页LUC/LUC小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在3T3计划中的生长、发光和墨水4/Arf基因表达。与先前结果一致(Krempnfort等人，2001年;夏普莱斯等人，2001年)，各基因型的MEF在传代早期表现出相似的生长动力学(图S1C). 此外，转录第19页农业研究基金和第15页墨水4b未被荧光素酶插入墨水4a/Arf轨迹(图S1D和S1E). 如预期，无内源性第16页INK4a公司在第16页LUC/LUC细胞，并且在第16页+/LUC公司单元格(图1B-1D). 培养的第16页+/LUC公司和第16页LUC/LUCMEF显示，随着传代，荧光素酶活性迅速增加，利用了该分析的整个动态范围(图1E). 例如，发光最初在第16页LUC/LUC电池（~300光单位/105电池），但增加了150倍以上（>50000光单位/105细胞）培养2周后(图1E). 诱导第16页LUC公司野生型等位基因的紧密平行转录第16页+/LUC公司MEF公司(图1F，第个2=0.81，p<0.0001），荧光素酶转录物的绝对水平几乎与本地的相同第16页INK4a公司成绩单（数据未显示）。

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设计和验证第16页LUC公司阿勒

（A） 的示意图第16页LUC公司敲门瞄准策略。“+Flp”表示Flp重组介导的新霉素选择盒切除后的靶向等位基因。

（B） 诱导第16页INK4a公司mRNA显示在以3T3计划传代的指定基因型的MEF中。折叠诱导是根据第16页INK4a公司第3天的转录水平。所示数据对应于三次重复的生物复制。误差条代表SEM。

（C） 第19页农业研究基金和第16页INK4a公司按3T3时间表培养的同窝MEF的western blots，并在指定的时间点收获。

（D） 折叠p16INK4a公司图（C）中所示的蛋白印迹显示了诱导作用。使用LICOR Odyssey系统对条带进行量化，归一化为总蛋白，并按照（B）进行分析。

（E） 所示基因型MEF中的荧光素酶活性，计算结果如（B）所示。误差线为±SEM。

（F） 荧光素酶活性与内源性第16页INK4a公司中的表达式第16页+/LUC公司MEF按3T3时间表传送。数据表示在多个体外时间点的≥3个生物复制，显示了最佳拟合线和95%置信区间（虚线）。采用线性回归计算p值和相关系数（r）。

（G） 具有代表性的哺乳期2分钟发光图像第16页+/LUC公司小鼠在相对于断奶日期（WD）的指定时间点。

（H） 代表性的，2分钟的照片和发光图像第16页+/LUC公司伤口愈合的老鼠。

请参见图S1获取其他相关数据。

接下来，我们试图验证第16页LUC公司通过检测先前与第16页INK4a公司激活：伤口愈合和乳房退化。为了在连续评估期间实现最佳灵敏度第16页LUC公司等位基因回交到无毛、免疫活性菌株SKH1-E上第16页INK4a公司表达式(Gadd等人，2001年;Jun和Lau，2010年;Natarajan等人，2003年)，在伤口愈合和乳房退化过程中，发光信号均呈局灶性增加(图1G和1H)并在这些过程完成后解决。总之，这些结果表明第16页LUC公司靶向策略导致p16等位基因为空INK4a公司不影响p15产生的表达墨水4b和第19页农业研究基金此外第16页LUC公司在体外和体内都忠实可靠地报道了内源性第16页INK4a公司表达。

第16页LUC公司激活与时间老化相关，但无法预测癌症死亡

p16增加INK4a公司与哺乳动物细胞衰老相关，并与时间年龄相关(Krishnamurthy等人，2004年;尼尔森等人，1999年;Zindy等人，1997年). 为了更准确地确定第16页INK4a公司表达和年龄，我们连续分析了第16页+/LUC公司生理衰老期间的小鼠。从16周龄（年轻成年期）开始，每2个月监测一次大样本人群的全身荧光素酶（TBL）活性第16页+/LUC公司动物（n=32）。在这个队列中，但不是在一个同时分析的第16页+/+动物，TBL活性在80周内增加(图2A、2B、和S2A公司; 从16周龄到80周龄，平均增长6.9倍）。同样地，荧光素酶与年轻对照组相比，用单分子原位杂交检测到的老龄小鼠皮肤表皮角质形成细胞和真皮中的mRNA水平增加(图2C). 这些数据证实了之前关于p16的发现INK4a公司衰老组织中的表达(Dimri等人，1995年;Jeyapalan等人，2007年;Krishnamurthy等人，2004年;Ressler等人，2006年;Waaijer等人，2012年;Zindy等人，1997年)，表明了这一点第16页LUC公司据报道，与年龄相关的基因表达增加。

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诱导第16页LUC公司与年龄相关，但与寿命无关

（A） 无毛小鼠的全身荧光素酶活性（SKH1-E）第16页+/LUC公司使用2分钟腹部图像对小鼠进行量化，并绘制出与年龄的关系图（n=32）。蓝线表示每个时间点的中值。80周龄的荧光素酶活性第16页+/+显示小鼠以进行比较。对于统计分析，计算每个时间点的全身发光与第16周的比值。采用Wilcoxon符号秩检验检验每个比率是否显著不同于1。除第24周外，所有比较的p<0.0001（p=0.018）。

（B） （A）所示研究中小鼠的代表性系列荧光素酶图像。每2分钟的图像显示相同的老鼠组，排列相同。鼠标2是第16页+/+，而所有其他小鼠第16页+/LUC公司.

（C） 老幼后肢皮肤第16页+/LUC公司动物被固定在同一石蜡块中，并接受单分子荧光素酶RNA原位杂交。显示的是来自同一石蜡块的具有代表性的组织图像荧光素酶显示为棕色圆点的消息。原始放大倍数=40×。

（D） （A）中所示队列的平均全身荧光素酶活性用蓝色绘制，95%置信区间用虚线表示。以黑色绘制的点表示每只小鼠（n=14）在寿命事件（肿瘤形成死亡）之前的图像中的全身荧光素酶活性。

（E） 计算56周龄时每只活小鼠的全身萤光素酶活性。使用该时间点的荧光素酶活性中值，将小鼠分为高组和低组。每组的卡普兰-迈耶曲线显示了使用对数秩检验计算的p值。

（F） 通过线性回归，计算每只存活56周的小鼠的荧光素酶增加率。通过使用该时间点的中位数增长率，将小鼠分为高组和低组。显示了各组的Kaplan-Meier曲线，并使用对数秩检验计算了p值。

请参见图S2获取其他相关数据。

鉴于第16页LUC公司为了连续评估体内衰老，我们接下来比较了第16页INK4a公司按时间顺序老化的诱导。对80周内收集的总数据的分析表明，两者之间存在很强的线性相关性（r2=0.963）在对数之间2-转换发光和年代学年龄，表示指数增长第16页INK4a公司-倍增时间”为0.45年(图S2A). 通过使用以下组合数据第16页INK4a公司两组18–91岁健康献血者T细胞的表达（n=208）(Liu等人，2009年; H.B.Muss等人，2011年，《临床杂志》。Oncol.公司。，文摘），我们估计第16页INK4a公司-翻倍时间为17.8年(图S2B). 这些数据表明，人/鼠的比例第16页INK4a公司-倍增时间（40倍）与人/小鼠的中位寿命和最大寿命之比相似(奥斯塔，1997年). 此外第16页LUC公司尽管女性似乎略高于男性，但性别之间没有显著差异第16页LUC公司早期水平（p=0.094；图S2C). 有趣的是，即使在这组同期饲养的同基因小鼠中，我们也观察到随着年龄增长，发光变化率的个体间差异显著(图2A和S2D系列)，表明对分子老化速率有相当大的非遗传贡献。

基于我们小组和其他人的大量工作，他们认为衰老细胞的积累促进了包括癌症在内的与年龄相关的表型(贝克等人，2008年，2011;Bavik等人，2006年;Berent-Maoz等人，2012年;Campisi等人，2011年;Chen等人，2011年;Coppé等人，2008年;Kang等人，2011年;Krishnamurthy等人，2006年;Krtolica等人，2001年;Laberge等人，2012年;Liu和Hornsby，2007年;Liu等人，2011年;Molofsky等人，2006年;Parrinello等人，2005年)，我们假设第16页LUC公司随着年龄增长的表达可以预测死亡率。如果正确，第16页+/LUC公司与年龄匹配的低发光小鼠相比，全身发光最高的动物更有可能发展与年龄相关的表型第16页LUC公司表达式。利用我们老龄化队列中任何给定时间点荧光素酶活性的巨大异质性，我们能够直接测试这一假设。然而，与预期相反，全身第16页LUC公司这种表达不能预测两种与年龄相关的表型：总死亡率和自发性恶性肿瘤的发展。动物临终事件（死亡或因明显肿瘤形成而实施安乐死）前4-6周的图像显示第16页LUC公司与年龄匹配的存活同代人相比的活动(图2D). 此外，在排除了有伤口或癌症的动物，并将我们的队列分为发光高于或低于中点的组后，卡普兰-迈耶分析显示，任何年龄段全身发光较高的动物与全身发光较低的动物的总死亡率相同(图2E和S2E–S2G系统). 同样，任何年龄段发光活性的变化率都不能预测死亡(图2F和S2H–S2J系列). 与之前对几种近交系和远交系小鼠死亡率的评估一致(Chrisp等人，1996年;Miller等人，2011年;Wilkinson等人，2012年)研究中的所有尸检动物都显示出晚期癌症的迹象。此外，在第16页+/+和第16页+/LUC公司动物(图S2K). 因此，这些发现表明第16页INK4a公司作为一种公认的细胞衰老体内标志物，在任何年龄段都不能预测正常小鼠衰老过程中自发性恶性肿瘤死亡的风险。

第16页LUC公司癌症信号

接下来我们转向了第16页INK4a公司杂交诱导早期肿瘤形成第16页LUC公司特征明确的基因工程小鼠原位癌模型的等位基因：C3（1）标签（SV40大T抗原驱动的基底样乳腺癌[Tag]）(Herschkowitz等人，2007年;Maroulakou等人，1994年)和三端双向可控硅(T型年-R（右）作为G12伏，我nk4a型/一个射频−/−黑色素瘤）(Chin等人，1997年). 尤其是，三端双向可控硅携带第16页LUC公司功能性p16的敲除等位基因为空INK4a公司(第16页−/LUC)但保留一份第19页农业研究基金在里面顺式针对荧光素酶等位基因。然而，我们已经标记了TyrRas公司G12伏第16页−/LUC阿尔夫−/+老鼠三端双向可控硅为了简洁起见。值得注意的是，C3（1）标签除了乳腺肿瘤外，小鼠还发展出爪子混合汗腺肿瘤(Maroulakou等人，1999年) (图S3A). 从年轻人开始，每两周监测一次由此产生的队列。年轻人的发光活性不明显第16页+/LUC公司或第16页−/LUC携带这些致癌转基因的小鼠；但是随着年龄的增长，乳腺和爪子内形成了强烈的、高度集中的发光区域C3（1）标签老鼠或皮肤三端双向可控硅老鼠(图3A–3D和S3A系列). 这些区域的焦点发光强度比随着年龄增长而观察到的高出10倍以上，这清楚地将它们与年龄相关的区域区分开来第16页INK4a公司激活(图S3B). 平均62天后（范围=0–408天），肿瘤在这些精确位置发生，提供了比传统方法更早、更动态地识别肿瘤生长的方法(图3E–3G和S3C系列). 年龄匹配组之间的发光活性没有差异第16页+/LUC公司无肿瘤第16页−/勒克三端双向可控硅老鼠(图S3D)表明仅黑素细胞中的癌基因激活不足以诱导显著的第16页INK4a公司表达式。相反，与肿瘤转化相关的后续事件似乎触发了第16页LUC公司转录。

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第16页LUC公司早期标记，新发肿瘤

（A） 代表性序列图像显示第16页LUC公司累积时间第16页+/LUC公司，C3（1）标签+肿瘤病灶持续8周。可见几个局灶性、乳腺和爪子肿瘤。一个可触及的肿瘤，比卡尺测量的要小，在红框中突出显示。

（B） 代表性序列图像显示第16页LUC公司在a处积累第16页−/LUC三端双向可控硅6周内出现耳肿瘤。

（C） 血红素和曙红染色显示三端双向可控硅耳肿瘤如（B）所示。

（D） 血红素和曙红染色显示几乎摸不到的C3（1）标签肿瘤在（A）中突出显示。

（E） 触诊或可视化之前在以下肿瘤中观察到荧光素酶活性的天数第16页+/LUC公司C3（1）标签老鼠。数据显示了单个肿瘤的中线检测优势。

（F） 触诊或可视化之前的天数，在这些肿瘤中观察到荧光素酶活性第16页−/LUC三端双向可控硅老鼠。数据描述如（E）所示。

（G） 联合Kaplan-Meier分析第16页+/LUC公司C3（1）标签和第16页−/勒克三端双向可控硅通过发光或触诊对小鼠进行肿瘤检测。显著性通过对数秩检验确定。

（H） 荧光素酶图像第16页+/LUC公司C3（1）标签早期乳腺肿瘤小鼠（腹部2分钟图像，侧面1分钟图像）。

（I） 在（H）和（J）中从小鼠身上解剖的乳腺肿瘤的照片图像。标尺哈希标记表示1 mm单位。

（J） 相同的FDG-PET图像第16页+/LUC公司C3（1）标签鼠标如（H）所示。FDG-PET无法显示肿瘤1。

请参阅其他图S3中的支持数据.

最初发现皮肤的发光灶(三端双向可控硅)或乳房(C3（1）标签)视觉和触诊显示正常。因此，我们进一步探索了第16页LUC公司等位基因。平均而言，发现了41个发光病灶(C3（1）标签; 范围：14–73）或87(三端双向可控硅; 范围：肿瘤触诊或可见前0-408天(图3E–3G). 通过发光观察到但尚未触及的代表性肿瘤被切除第16页+/LUC公司C3（1）标签小鼠和测量。在肿瘤小至1 mm的小鼠中可以检测到明确的发光信号三(图3H和3I). 此外，氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）与发光检测的比较显示，使用第16页LUC公司作为一种肿瘤检测方式(图3J). 由于肿瘤生物学和/或成像相关技术特征（例如肿瘤位置）的动物间差异，来自不同动物的相同大小肿瘤的信号强度不一致(图S3E). 重新开始的后续分析C3（1）标签肿瘤使用荧光素酶RNA原位杂交证实了第16页INK4a公司在全身发光成像可检测性之前，肿瘤早期的启动子(图S5B). 因此，使用第16页LUC公司等位基因比传统方法具有检测优势，可以在相当早的阶段对新发肿瘤进行可视化、切除和分析。

无偏倚肿瘤检测第16页LUC公司

的使用第16页LUC公司检测新生肿瘤形成并不局限于RB抑癌途径中存在缺陷的基因工程小鼠模型。致癌K-Ras引起的黑色素瘤G12D系列(刘等，2012)或B-RafV600E型(Dankort等人，2009年)，以及由Myc过度表达引起的血液系统恶性肿瘤(Harris等人，1988年)，显示强烈的焦点发光信号(图S4A–S4C). 此外，老年人自发性肿瘤第16页+/LUC公司小鼠很容易被检测到(图4A、4B、和S4D系列). 不仅在这些小鼠中容易检测到原发性肿瘤，而且常规观察到自发血液恶性肿瘤扩散到大脑、骨髓、脾脏和肝脏(图4A和S4D系列). 事实上，对14种不同肿瘤模型的测试未能确定肿瘤类型，其中第16页LUC公司在新出现的肿瘤中不是局部诱导的(表S1). 综上所述，这些数据表明第16页LUC公司标志着绝大多数（如果不是全部）恶性肿瘤，与细胞类型或驱动因子突变无关。

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第16页LUC公司体内活动检测自发性癌症

（A） （上图）110周龄儿童自发组织细胞恶性肿瘤的检测第16页+/LUC公司鼠标。所有显示的发光图像长度均为1分钟，但腹侧图像长度为2分钟。成像后立即拍摄器官图像。（下图）血红素和曙红染色的固定组织证实脑和肝脏荧光素酶阳性区域存在恶性肿瘤。

（B） （上图）78岁儿童自发播散性肺腺癌的发光检测第16页+/LUC公司鼠标。图像生成如（A）所示，组织学证实如下。

另请参见图S4和表S1.

非细胞自主激活第16页LUC公司

为了解决以下方面的贡献第16页LUC公司在肿瘤和肿瘤相关基质中的表达，我们进行了原位移植C3（1）标签肿瘤细胞没有第16页LUC公司等位基因转化为同基因第16页+/LUC公司老鼠(图5A)然后在肿瘤形成的早期阶段对这些动物进行连续成像。引人注目的是，归纳第16页LUC公司在肿瘤形成区域观察到，但在对侧注射苦参素的乳腺中未观察到。此外，注射MEF未能诱导第16页LUC公司(图S5A)证明了基质第16页INK4a公司激活是由局部恶性生长触发的。评估基质的普遍性第16页LUC公司诱导后，我们移植了五种不同的同基因非发光肿瘤细胞系（两个乳腺、一个胰腺、一个子宫内膜和一个肺），这些细胞系具有不同的致癌驱动基因突变(磅1损失，第53页损失，K-RasG12D系列和Her2-Neu过度表达）进入第16页+/LUC公司收件人(图5B和5安). 在所有情况下，荧光素酶活性局限于肿瘤发生部位，但在车辆注射对照组中未观察到。此外，重新检查C3（1）标签肿瘤使用荧光素酶RNA-ISH显示第16页LUC公司在早期肿瘤病灶周围的基质中(图S5B). 总之，这些结果提供了证据，表明新出现肿瘤中存在的外源性信号可诱导局部、非细胞自主性第16页INK4a公司表达。

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第16页LUC公司通过非细胞自主机制发出癌症活动信号

（A） 免疫能力，FVB/N第16页+/LUC公司小鼠按同基因所示进行原位注射第16页+/+C3（1）标签细胞单独存在于基质凝胶或基质凝胶载体中，并在肿瘤形成时成像。图中显示了具有代表性的2分钟图像。

（B） 同系的第16页+/+胸部(MMTV-HER2/诺伊和K14-CRE p53型洛克斯/洛克斯)，胰腺(Pdx-CRE LSL-K-ras公司G12D系列第53页洛克斯/洛克斯)，和子宫内膜(弹簧2f-CRE Lkb1洛克斯/洛克斯)将癌细胞系皮下注射到第16页+/LUC公司小鼠，肿瘤建立后成像。每个模型都显示了具有代表性的2分钟发光图像。

（C） 同基因移植第16页+/LUC公司骨髓进入第16页+/+接受者的行为如图所示。免疫重建后，同基因第16页+/+C3（1）标签将细胞原位移植到小鼠体内，并如（A）所示成像。记录成像时的肿瘤大小。在所有移植瘤中均观察到强大的荧光素酶活性，但仅在注射基质凝胶的对侧部位未观察到。

另请参见图S5.

确定宿主造血系统是否有助于第16页LUC公司移植瘤中的信号，FVB/单位小鼠接受致死性照射和骨髓移植第16页+/LUC公司捐助者(图5C). 植入后，小鼠原位注射同基因C3（1）标签肿瘤细胞缺乏第16页LUC公司等位基因。骨髓移植两个月后，荧光素酶成像显示出强烈的诱导第16页LUC公司特别是在肿瘤形成领域(图5C). 这些结果表明，肿瘤要么诱导第16页INK4a公司浸润性造血细胞或新兵的表达第16页INK4a公司-向发展中的肿瘤表达骨髓源性细胞。

讨论

这项工作建立了第16页LUC公司knockin等位基因作为第16页INK4a公司体内转录激活。我们使用该系统连续评估第16页INK4a公司随着年龄增长、组织损伤、乳房退化和肿瘤进展。从这些分析中得到的令人惊讶的发现是，细胞衰老标记物的有机表达与癌症相关死亡率之间缺乏联系，以及细胞衰老的非自主诱导作用第16页INK4a公司在新生肿瘤的良性基质中。

p16的表达INK4a公司已被认为是细胞衰老的最佳体内标志物之一。尽管激活了第16页LUC公司与我们队列中的年龄直接相关(图2A和S2A公司)，我们观察到全身的变化令人惊讶第16页INK4a公司表达式。例如，在80周龄的小鼠中，高表达和低表达小鼠的全身发光差异达10倍。我们利用这种表达的异质性直接测试是否可以通过体内激活肿瘤细胞来预测常见的年龄相关表型，即自发性恶性肿瘤的风险第16页INK4a公司是细胞衰老的经典指标。与我们的预期相反，全身发光和发光变化率不能预测死亡率(图2A、2B、2D–2F，S2A和S2E–S2J). 与之前的工作一致(Chrisp等人，1996年;Miller等人，2011年;Wilkinson等人，2012年)，我们队列中的所有死亡似乎都是由恶性肿瘤引起的。因此，该分析表明，细胞衰老标记物的全身表达与一个重要的年龄相关表型无关：即发生癌症的风险。

这一发现并非预测结果。包括我们在内的几个小组的研究表明，p16的积累INK4a公司-体内阳性和/或衰老细胞促进许多与年龄相关的表型(贝克等人，2008年，2011;Berent-Maoz等人，2012年;Chen等人，2011年;Krishnamurthy等人，2006年;Liu等人，2011年;Molofsky等人，2006年)包括肿瘤发生(Bavik等人，2006年;Campisi等人，2011年;Coppé等人，2008年;Kang等人，2011年;Krtolica等人，2001年;Laberge等人，2012年;Liu和Hornsby，2007年;Parrinello等人，2005年). 我们认为有两种方法可以使这些先前的结果与当前的工作相协调第16页INK4a公司表达报告可能不代表细胞衰老的组织损伤（例如，组织损伤）。因此，从形式上讲，p16的大规模、定型增加是可能的INK4a公司在所有哺乳动物中，随着衰老而出现的表达并不反映衰老细胞的积累，而是表明独立于衰老的细胞应激。考虑到大量工作表明p16INK4a公司在小鼠和人类组织中，表达是体内衰老最可靠、最有力的标志之一(贝克等人，2011年;Edwards等人，2007年;Koppelstaetter等人，2008年;Krishnamurthy等人，2004年;Lemster等人，2008年;Liu等人，2009年;Melk等人，2004年;尼尔森等人，1999年;Signer等人，2008年;Waaijer等人，2012年;Zindy等人，1997年). p16的发现INK4a公司不忠实地报告体内衰老将破坏先前描述完整生物体衰老的大多数工作，特别是对小鼠的研究。更可能的是，我们认为这些数据表明，导致我们群体死亡的自发性癌症并非由衰老细胞的积聚和与衰老相关分泌表型（SASP）相关的细胞因子的表达引起。该分析需要注意的是，人类自发性恶性肿瘤在进展时间和非整倍体程度等重要方面与实验饲养小鼠的癌症不同，SASP细胞因子可能在人类肿瘤进展中发挥更关键的作用。

除了癌症易感性和死亡率外，我们没有检测与年龄相关的表型。因此，我们的结果与某些与年龄相关的表型（例如，T细胞复制减少）的观点并不矛盾[Liu等人，2011年]和肌肉减少[贝克等人，2011年])与p16相关INK4a公司激活、衰老和SASP因子的精细化。例如，Van Deursen及其同事最近证明，通过体内清除衰老细胞，进展期小鼠中几种与年龄相关的表型得到改善(贝克等人，2011年)，但根据我们目前的发现，这些措施并不能延长寿命。我们仍然相信p16的测量INK4a公司人类组织中的表达对预测再生能力下降具有临床价值(Koppelstaetter等人，2008年;Liu等人，2009年;McGlynn等人，2009年;Nelson等人，2012年)，但我们的发现代表了一个重要的步骤，可以调和哪些与年龄相关的表型是由体内衰老细胞的积累引起的，哪些（例如小鼠癌症的发展）不是。

我们证明了第16页LUC公司等位基因是一个出乎意料的强健的检测新发肿瘤的检测器。虽然已经发表了组织特异性或需要体外转导的癌症报告系统（在O'Neill等人，2010年)，该系统的明显通用性和早期检测能力提供了显著的优势。肿瘤检测第16页LUC公司不依赖于CRE重组酶的表达，允许该系统用于监测致癌诱导的和自发产生的癌症(图3，​,4,4，S3A和S4A–S4D; 数据未显示）。与以前的癌症记者不同，第16页LUC公司在任何遗传背景或组织类型的肿瘤中都表现出强大的功能。也就是说，我们观察到第16页INK4a公司14种不同癌症模型中的启动子，包括转基因原位肿瘤、移植肿瘤和自发性肿瘤（见表S1和图3，​,4,4，​,5,5，S3、S4和S5)我们还没有发现与第16页INK4a公司归纳。甚至使用毛皮，杂合子第16页LUC公司我们注意到，与标准方法（即FDG-PET和触诊）相比，小鼠具有明显的时空优势(图3H-3J)无毛效果更佳，第16页LUC/LUC老鼠。使用同基因癌细胞尾静脉注射的初步结果表明，通过第16页LUC公司（数据未显示），这表明该记者对研究转移性传播也很有价值。然而，我们还没有在真正的从头开始转移的情况下测试等位基因。鉴于第16页LUC公司，我们相信该报告将对早期癌症检测、肿瘤进展的系列评估和抗癌化合物测试普遍有用。

我们认为该系统的两个特点说明了其在检测早期癌症中的作用。首先，先前的工作表明第16页INK4a公司启动子在体内异常动态(Krishnamurthy等人，2004年)，因此，我们注意到在第16页+/LUC公司MEF公司(图1E). 我们相信，每个细胞表达量的大幅增加是等位基因敏感性的基础，可以在体内检测到极小的肿瘤(图3H–3J和5亿). 第二，稳健归纳第16页INK4a公司在发展中的肿瘤基质中，肿瘤特异性信号放大，发生与特定肿瘤的驱动基因无关(图5和第5章). 由此产生的局灶性、持续性和强烈的信号可以很容易地将新出现的肿瘤与第16页INK4a公司与衰老和其他非恶性状态（如伤口愈合）相关的增加(图S3B).

由于最初观察到癌基因部分通过上调第16页INK4a公司(Serrano等人，1997年)，研究主要集中在细胞内的第16页INK4a公司表达，如DNA损伤(Pavey等人，1999年)，端粒缩短(Bartkova等人，2006年;雅各布斯和德兰格，2004年)、活性氧生成(Ito等人，2004年)和暂停的复制分叉(Ressler等人，2006年). 这些结果表明第16页INK4a公司也对迄今为止检查的每种类型的新兴肿瘤中存在的外在“场效应”做出反应。此外，这项工作还谈到了哺乳动物老年学中普遍存在的细胞内/外源性争论，因为我们发现新出现的肿瘤会触发细胞衰老有效效应物的局部、非细胞自主表达。事实上，据报道，非细胞自主因子（例如Wnt/β-catenin、Hh/Gli、PDGF和IL-7）可以调节第16页INK4a公司表达作为发育控制的潜在手段(Berent-Maoz等人，2012年;Bishop等人，2010年;Chen等人，2011年). 这些外部信号是否也有助于诱导第16页INK4a公司正常衰老背景下的表达和细胞衰老仍有待建立。

总之第16页LUC公司该系统代表了将小鼠作为模型系统的癌症和衰老研究的重大进展。该系统还允许对第16页INK4a公司在体内，这是激活细胞衰老的关键步骤。等位基因的效用反映了第16页INK4a公司体内表达及意外发现第16页INK4a公司激活肿瘤相关的非恶性基质，从而允许等位基因报告每种检测肿瘤类型的出现，而不考虑潜在的肿瘤遗传学。由于细胞衰老是肿瘤发生的主要障碍，并导致哺乳动物衰老第16页LUC公司该系统对于癌症和衰老的系列评估，以及对旨在改变体内这些过程的药物干预进行测试，都将是一项宝贵的资产。

实验程序

畜牧业和第16页LUC公司阿勒

动物工作是按照北卡罗来纳大学动物研究机构护理和使用委员会批准的方案进行的。标准同源重组程序用于靶向萤火虫荧光素酶，然后是内源性荧光素酶外显子1α的SV40多腺苷酸化位点第16页INK4a公司基因。用于第16页LUC公司基因分型如下：p16-LUC-F 5′-CTATGGCGTG GAG-3′（0.15μM）；p16-LUC-R 5′-CACGGTAGCTGCGAAATG-3′（0.15μM），p16-LUCR3 5′3′（0.2μM）；95℃15分钟，36×[94℃30秒，58℃30秒和72℃45秒]，72℃2分钟。PCR产物为312（野生型）和543(第16页LUC公司)碱基对长。

内源性Ink4a/Arf转录物的细胞分离、培养和检测

MEF生成于第16页LUC公司使用Gentle-MACS解离剂的杂合父母（Miltenyi Biotec，德国）。简言之，采集胚胎，在0.5%胰蛋白酶-EDTA中粗切，然后消化5-10分钟。然后将细胞放入GentleMACS C管中，连续两次使用程序“a”生成单细胞悬浮液。使用类似的方案从C3（1）标签和三端双向可控硅模型。

MEF、，C3-抗原，PDAC1(Bardeesy等人，2006年)和Kp53（小鼠肺腺癌细胞，W.Y.Kim的礼物，UNC）细胞在补充4.5g/l葡萄糖、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和2 mM l-谷氨酰胺的DMEM中培养。Her2/Neu过度表达的NT2细胞在添加20%FBS、2 mM L-谷氨酰胺、12 mM HEPES、0.1 mM NEAA、1 mM丙酮酸钠、1%青霉素链霉素、50μMβ-巯基乙醇和0.2单位/ml诺和林R胰岛素的RPMI-1640中培养。来自转移性肿瘤的子宫内膜Lkb1阴性肿瘤株弹簧2f-CRE Lkb1业务范围/业务范围女性(孔特雷拉斯等人，2010年)在补充有110 mg/l丙酮酸、10%FBS、2 mM l-谷氨酰胺和1×抗生素抗真菌剂（15240，Invitrogen）的低血糖DMEM中培养。

RT-PCR检测策略墨水4a/Arf之前描述过抄本(Burd等人，2010年;Krishnamurthy等人，2004年). 蛋白质印迹采用以下抗体，并在LICOR Odyssey系统上定量：p16INK4a公司（圣克鲁斯M126；1:500），第19页农业研究基金（Abcam AB80；1:1000）。

体内和体外荧光素酶检测

将异氟醚麻醉小鼠腹腔注射D-荧光素底物（Caliper Life Sciences；PBS中15 mg/ml），并使用IVIS Lumina或IVIS动力学系统（Caliper-Life Sciences）成像。基质给药后6-8分钟开始出现峰值发光。为了确保在同一时间点进行分析，在腹腔注射D-荧光素后立即开始一系列长度在10 s到2 min之间的序列图像。使用广角镜头同时捕获3只以上动物的图像。使用4（中等）的箱子拍摄图像。对于小鼠大小大致相同的肿瘤研究，给予300μl底物。在动物大小不同的衰老研究中，向小鼠注射10μl/g体重的底物。Living Image Software（Caliper Life Sciences）用于比较基质给药后在相同曝光和时间点拍摄的多张图像。对于所有分析，使用额外的ROI来对每个图像上的背景发光进行归一化。使用标准方法进行体外荧光素酶分析，并对细胞数量进行标准化。RNA-ISH是使用制造商描述的RNAscope 2.0技术进行的（高级细胞诊断）。

老化发光分析

从16周龄（成年期）开始，每两个月对小鼠进行一次成像，每组3至5只，如上所述。对D-荧光素给药后6分钟拍摄的2分钟腹部图像进行分析。跟踪每只小鼠的轮廓，并使用Living Image Software（Caliper Life Sciences）确定通量/像素。还计算了图像未占用区域的光通量/像素，并从跟踪区域中减去作为背景的光通度/像素。如果老鼠有可见的伤口，则将图像排除在分析之外。只有在伤口完全愈合后，才允许动物重新进入研究。在所有年龄段的健康小鼠中，肠系膜和颈部淋巴结的焦点发光强度都很常见。然而，身体其他部位的强烈发光信号往往预示着肿瘤的形成；因此，这些图像被排除在分析之外（参见图2B). 这些“肿瘤区域”从未解决。因此，这些小鼠从未再次参与研究。32人中第16页+/LUC公司在本研究中，每个时间点排除或死亡的小鼠数量如下：16周，0；24周，1周；32周，1周；40周，2周；48周，2周；56周，2周；64周，3周；72周，7周；80周和12周。Kaplan-Meier分析显示第16页+/+和第16页+/勒克我们队列中的老鼠(图S2K)，表明第16页INK4a公司在这项研究中，杂合动物与野生型动物一样容易发生与癌症相关的死亡。

基因工程肿瘤模型

女性C3（1）标签动物从大鼠C3启动子表达SV40大T抗原（TAg），并发展成具有类似人类基底样乳腺癌的转录谱的乳腺肿瘤(Herschkowitz等人，2007年;Maroulakou等人，1994年)以及爪子的唾液和混合汗腺肿瘤(Maroulakou等人，1999年).三端双向可控硅小鼠对墨水4/Arf致癌H-Ras的位点和表达G12伏来自黑素细胞特异性酪氨酸酶启动子(Chin等人，1997年)（NCI Mouse Repository菌株01XB1）。本研究中分析的TRIA小鼠为阿尔夫+/−因此，Arf功能并不完全不足（见结果）。这个Eμ-Myc公司模型来自Jackson Laboratories（库存002728）(Harris等人，1988年). 这个磅1−/−第53页−/−LSL-K-Ras公司G12D系列黑色素瘤模型先前已有描述(刘等，2012). B-RafV600E型 铂族−/−黑色素瘤模型来自Jackson Laboratories（库存013590）(Dankort等人，2009年). 跟随十字架第16页LUC公司，的C3（1）标签和三端双向可控硅模型占50%C57Bl/6型和50%FVB/n.Eμ-Myc p16LUC公司小鼠完全回交到白化C57Bl/6。这个磅1−/−第53页−/−LSL-K-Ras公司G12D系列和B-RafV600E型 铂族−/−黑色素瘤模型在混合背景下进行分析。

同基因肿瘤移植实验

收获培养的肿瘤细胞，在Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）中洗涤，并在基质凝胶（M；BD Biosciences）或HBSS（H）中以以下浓度重悬：8.0×105 C3（1）标签细胞/100μl注射液（M）；5.0 × 105NT2细胞/100μl（M）；5.0 × 105PDAC1细胞/100μl注射液（H）；5.0 × 105子宫内膜癌细胞/100μL注射（M）；5.0 × 105KP53细胞/100μl（H）；8.0×105MEF细胞/100μL（H）。表11细胞在野生型中通过连续传代得以维持BALB/c公司老鼠。每条通道，~5×105将悬浮在100μl 1:1 Matrigel:HBSS溶液中的细胞皮下注射。

骨髓移植

15个10至12周龄的野生型FVB/编号用铯源对小鼠进行致命照射（8Gy）。同一天第16页LUC公司杂合的FVB/编号将小鼠分离、清洗并重新悬浮在HBSS中。以2×10的浓度静脉注射细胞6细胞/100μl注射液。移植后两到三周，按照上述方法将肿瘤细胞原位注射给小鼠。在因肿瘤负担加重而牺牲之前，对小鼠进行成像以检测荧光素酶活性，并采集血液。将血液DNA的RT-PCR基因分型与混合野生型和混合野生型的标准曲线进行比较第16页LUC公司杂合子血检测移植后嵌合体。发现血液嵌合>89%第16页+/勒克成像时呈阳性。

PET成像

如前所述进行FDG-PET成像(Liu等人，2011年).

补充材料

Supp数据1

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Supp数据2

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致谢

我们感谢H.Yuan、K.Guley和UNC BRIC小型动物成像设施提供的成像协助；A.Moisan（MGH Cancer）提供技术援助；C.G.Peña（UT西南）、E.a.Akbay（UT东南）、D.T.Gammons（UNC）、W.Y.Kim（UNC；UNC动物临床化学、动物组织病理学和基因表达实验室以及G.Aloisio（UT Southwestern），用于组织处理和常规基因分型；UNC显微镜服务实验室和UNC动物研究设施提供技术援助；和UNC鼠标一期单元，用于提供动物和专业知识。这项工作得到了NIH（AG024379；CA137181；CA163896；AG036817）、Paul Glenn基金会和Burroughs Wellcome基金会的支持。

脚注

补充信息

补充信息包括五个数字和一个表格，可以在以下网站上找到这篇文章http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2012.12.010.

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