第53页突变在人类肝癌中很常见6通常具有很强的攻击性，对非手术治疗有抵抗力。为了确定这种癌维持过程中p53缺失的需要，我们使用可逆RNAi7在嵌合体肝癌小鼠模型中控制p53()4,5纯化的胚胎肝祖细胞（成肝细胞）用表达致癌基因的逆转录病毒转导ras（拉斯维加斯）(HrasV12型)，四环素反式激活蛋白tTA（“et-off”）和tet反应性p53 miR30设计的短发夹RNA（shRNA；补充图1a)7,8并在脾内注射后植入裸鼠肝脏4,5.为了方便体内成像，致癌ras（拉斯维加斯）逆转录病毒共表达绿色荧光蛋白（GFP），在一些实验中，成肝细胞也与荧光素酶报告子共转导。
p53的激活导致肝肿瘤的消退一用四环素调节的p53 shRNA（TRE.shp53）、tTA和H转导胚胎肝祖细胞-ras（拉斯维加斯）肝癌发病后，通过强力霉素（Dox）治疗可以恢复p53的表达。b条，p53的激活导致肿瘤快速消退。从第0天开始用Dox治疗荷瘤小鼠，并在指定的时间点进行成像(n个= 9).c（c），皮下肿瘤来源于ras（拉斯维加斯）-用tet-off shRNA（TRE.shp53）或非调节性shRNA（MLS.shp5）在裸鼠体内培养转化的肝祖细胞。数值代表平均值±标准差(n个= 4).d日，p53激活被Dox退出逆转。用Dox脉冲处理4天的肝祖细胞蛋白裂解物进行p53免疫印迹。e（电子）、代表性小鼠(n个=6）如中所示b条接受Dox脉冲治疗4天，并在指定时间进行成像。
p53的表达在缺乏强力霉素（Dox）的情况下被有效抑制，并在添加Dox后迅速恢复(补充图1b、c). 在移植到受体小鼠的肝脏中时，共表达Ras和条件p53 shRNA的成肝细胞群在没有Dox的情况下迅速产生侵袭性肝癌()而单独表达每个载体的细胞则没有（数据未显示）。这些肿瘤是GFP阳性的，如果表达荧光素酶，可以通过生物发光成像对外部进行可视化().
对患有晚期肿瘤的动物进行Dox治疗，以重建p53表达(). Dox给药后不久，p53 microRNA（miRNA）被关闭，p53表达增加(补充图1). 虽然未经治疗的小鼠的肿瘤进展迅速，但在多克斯治疗的动物中，肿瘤开始退化，并在12天内几乎无法检测到(). 在皮下环境中也观察到类似的结果，在皮下环境下，可以使用卡尺测量准确监测肿瘤(，左侧面板）。重要的是，ras（拉斯维加斯）-使用组成型p53 shRNA产生的诱导性肝癌的生长与Dox治疗无关(，右），表明肿瘤退化不是由于Dox毒性。当p53在肿瘤中被重新激活时，这种回归也会发生，同时表达一种组成性激活阿克特或内源性致癌K-ras公司等位基因和条件p53 shRNA（W.X.、L.Z.和S.W.L.，未发表数据）。
为了确定短暂的p53重新激活是否也会导致肿瘤退化，我们用Dox处理培养或荷瘤小鼠中的转化细胞4天，然后去除药物。免疫印迹显示，在加入和退出Dox后，p53可以被瞬时诱导(). 在培养细胞中，即使两天的Dox治疗也会将菌落形成降低到持续Dox治疗后观察到的水平(补充图2a). 此外，两者都是就地皮下肝癌在接受Dox治疗仅四天后就完全消退(;补充图2b). 因此，p53可以通过一个过程诱导肿瘤退化，这个过程一旦激活，似乎是不可逆的。这些观察结果与小鼠肿瘤中有条件表达各种癌基因的结果类似，其中起始癌基因的沉默通常会导致肿瘤退化9,10.
重新表达p53的肝癌的快速消退与p53促进细胞凋亡的特征性能力一致。因此，我们检测了p53修复前后肿瘤的凋亡和增殖(). 令人惊讶的是，我们观察到在p53重新激活后很少有TUNEL阳性或含有活化caspase 3的细胞，这表明对p53的主要反应不是凋亡。同样，在退化的肿瘤中未观察到实质性坏死。相反，这些肿瘤的增殖（Ki67）明显减少，这与细胞分化的迹象有关(补充图3).
p53激活的主要反应不是凋亡一，Dox治疗前（p53关闭）和治疗后（p53打开）肝肿瘤凋亡细胞（TUNEL和Caspase 3染色）和增殖细胞（Ki67染色）的苏木精和伊红（H&E）免疫组织化学染色。肿瘤的组织病理学表现为人肝细胞癌和胆管细胞癌。插图（P）表示阳性对照（辐照胸腺，20Gy（20灰色））p53在第6天显示典型肿瘤。比例尺，100μm。b条，量化一值代表平均值±标准差(n个= 4; **P（P）<0.002).
p53还可以促进细胞衰老，这是一种明显不可逆的细胞周期阻滞形式，是肿瘤发生的有力屏障11–14并可由过度活跃的Ras或PI3K信号触发12,15有趣的是，肝癌表达两种致癌基因ras（拉斯维加斯）或阿克特p53活化后出现明显的衰老迹象体内(; 未显示Akt）的数据，包括衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性的积累()和衰老标记p16INK4a公司、DcR2和p15墨水4b()13,15在短暂的Dox治疗后，肿瘤中也观察到SA-β-gal活性()表明p53活性脉冲足以触发衰老体内.
p53活化诱导细胞衰老一未经治疗（p53关闭）或使用Dox（p53在第6天）治疗的代表性肿瘤肝脏的SA-β-Gal染色(n个= 3).b条，肿瘤切片的SA-β-Gal染色(n个= 3). 肿瘤要么未经治疗（p53关闭），要么持续用Dox治疗8天（p53打开8天），要么短暂治疗4天，不治疗8天。比例尺，25μm。c（c），免疫印迹法检测正常肝脏或使用Dox治疗0、4和6天的肝肿瘤中的衰老标记物。d日，肝祖细胞窝藏ras（拉斯维加斯）和tet-off shp53在含有Dox的培养基中培养6天（p53 on），并染色SA-β-Gal。值代表平均值±标准差(n个=3**P（P）< 0.0001).e（电子），代表性图片来自d日.（f），单元格如中所示d日分别培养有（p53开，红线）或无Dox（p53关，黑线）的细胞，计数细胞数。数值代表平均值±标准差(n个=4).
鉴于衰老是一种细胞抑制程序，p53激活导致细胞衰老和肿瘤退化令人惊讶。事实上，转化细胞积累了SA-β-gal活性，但随后在p53活化后仍被抑制在体外()，表明肿瘤消退涉及非细胞自主过程。对p53活化后不同时间采集的肿瘤进行显微镜检查，发现累及多形核白细胞的渐进性炎症反应，最初在肿瘤周围区域发展，最终扩散至整个肿瘤(). 我们还观察到退行性肿瘤血管周围有强烈浸润，最终导致以血管硬化、出血和吞噬红细胞为特征的显性血管炎(补充图7). 形态学、免疫荧光和流式细胞仪分析确定浸润的白细胞为中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞(补充图4-6). 这些组织病理学特征支持一个连续事件模型，该模型由肿瘤中的p53活化、剧烈炎症反应的激活、随后肿瘤细胞的破坏和新生血管形成启动。
先天免疫反应清除肝肿瘤a–fp53活化后退化肿瘤的渐进性免疫浸润（H&E；n个= 4). 箭头表示肿瘤周围多形核（PMN）白细胞。箭头表示肿瘤内多形核白细胞。比例尺，100μm。e（电子），高倍视图d日.克p53活化导致衰老肿瘤中趋化因子和粘附分子的表达增加(体内)和培养的肝祖细胞(在体外). 数值代表平均值±标准差（重复样品和三份qPCR）。与D0相比，所有D4和D8值都具有统计学意义(P（P）<0.05).小时在衰老肿瘤中，p53活化伴随着免疫细胞转录物的增加(体内)但在培养细胞中没有(在体外). 值表示来自微阵列的重复样本的平均值。我用Dox治疗皮下肝癌以诱导肿瘤消退。给予巨噬细胞毒素GdCl（红线）、抗中性粒细胞抗体（紫色）或抗自然杀伤细胞抗体（蓝色）。盐（实心黑线）或同型对照抗体（虚线黑线）作为对照。数值代表平均值±标准差(n个= 4; *P（P）< 0.02; **P（P）<0.002（第16天）。j个，先天免疫细胞的阻断不能阻止p53诱导的衰老。对照动物或免疫拮抗剂处理动物的冰冻切片进行SA-β-Gal活性染色(n个= 3). 比例尺，50μm。
衰老细胞通常获得一种基因表达特征，包括炎症细胞因子和其他免疫调节剂的上调16,17因此，在p53活化后不久，肝肿瘤中已知可吸引巨噬细胞（Csf1和Mcp1）、中性粒细胞（Cxcl1）和自然杀伤细胞（Il15）的炎性细胞因子上调(). 在培养的肝癌细胞中，这些基因也由p53诱导，表明它们不仅在浸润的白细胞中表达，而且在肿瘤细胞中表达(). 此外，一些粘附分子包括Icam1(参考18)和Vcam1在p53激活后被诱导(，数据未显示），表明衰老细胞可以促进免疫识别的一种方式。最后，中性粒细胞（Ncf2、Ncf4）、巨噬细胞（Mgl2、MSR2、CD68）和自然杀伤细胞（Klrb1、Klrd1）的特异性转录物在衰老肿瘤中增加，但在培养细胞中没有增加。因此，先天免疫系统的多种成分在p53活化后渗入肿瘤。
为了确定肿瘤清除是否需要天然免疫细胞，用氯化钆（一种巨噬细胞毒素）治疗携带有条件p53 shRNA的皮下肝癌小鼠19,20或中和抗体抑制中性粒细胞或自然杀伤细胞功能20,21，并监测Dox治疗后肿瘤的消退。p53激活后，所有三种治疗均显著延缓了肿瘤的消退()从而证实了先天免疫系统的组成部分可能通过协调反应积极参与肿瘤清除。重要的是，每种拮抗剂都能有效、特异地耗尽脾脏或外周血中的靶向免疫细胞(补充图8)但不能防止肿瘤细胞衰老(). 同样，在NOD/SCID小鼠体内生长的肿瘤中，在p53重新激活后，几乎没有观察到肿瘤退化，这些小鼠的先天免疫系统高度受损22-尽管p53仍然诱导细胞凋亡和衰老(补充图9). 因此，肿瘤清除延迟不能用免疫系统吞噬死亡或死亡细胞的失败来解释。相反，这些结果表明，诱导细胞衰老和诱发的免疫攻击协同促进肿瘤清除。值得注意的是，这里使用的裸鼠缺乏功能性B和T细胞，这些细胞通常会增强但也可以减弱炎症反应23然而，小鼠肉瘤中的p53活化也可以在完全免疫活性的环境中诱导衰老和肿瘤清除24.
我们的研究使用可调节的RNAi来证明p53缺失是维持侵袭性肝癌的必要条件。我们怀疑肿瘤隐藏第53页突变可能对p53信号的恢复非常敏感，因为它们具有致癌损伤或能够有效激活p53的损伤信号(参考文献3,25). 然而，恢复p53信号的后果可能取决于肿瘤起源或基因型；因此，虽然p53活化在肝癌和肉瘤中诱导衰老，但淋巴肿瘤通过凋亡对p53作出反应24.肿瘤也可能最终摆脱对第53页突变，但短暂的再激活可以导致肿瘤完全退化，这一事实支持了暂时性的可能性第53页再激活疗法26,27甚至对于晚期癌症。
我们的结果还确定了一种新的肿瘤抑制机制，涉及肿瘤细胞衰老程序和先天免疫系统之间的协同作用。他们进一步证明，尽管衰老程序具有细胞抑制性，但衰老细胞可以翻转体内.这种周转是否是衰老的一般特征体内不清楚14,28，但当存在时，可能会在恶性肿瘤前期或用衰老或分化促进疗法治疗后的肿瘤中增强衰老的肿瘤抑制作用26,29相反，我们的结果确定了一种情况，在这种情况下，先天免疫系统被激发，协同攻击肿瘤细胞，可能通过吞噬作用和直接细胞毒性杀伤，从而促进其消除。虽然已经证实由衰老基质细胞或其他因素引发的慢性炎症可以促进肿瘤的发生19,30我们的研究表明，当靶向衰老肿瘤细胞时，先天免疫细胞如何也具有抗肿瘤作用。专门利用这些过程的策略可能是一种有前途的治疗方法。
