Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL

Reut Yosef; Noam Pilpel; Ronit Tokarsky-Amiel; Anat Biran; Yossi Ovadya; Snir Cohen; Ezra Vadai; Liat Dassa; Elisheva Shahar; Reba Condiotti; Ittai Ben-Porath; Valery Krizhanovsky

doi:10.1038/ncomms11190

国家公社。2016; 7: 11190.

2016年4月6日在线发布。数字对象标识：10.1038/ncomms11190

预防性维修识别码：项目经理4823827

PMID：27048913

通过抑制BCL-W和BCL-XL直接消除衰老细胞

鲁特·约瑟夫，^1,^* 诺姆·皮尔佩尔，^1,^* 罗尼特·托卡斯基-阿米尔，² 阿纳特·比兰，¹ 尤西·奥瓦迪亚，¹ 斯尼尔·科恩，¹ 埃兹拉·瓦代，¹ 利亚特·达萨，² 埃利舍瓦·沙哈尔，² 雷巴·康迪奥蒂，² Ittai Ben-Porath公司，^a、，²和瓦列里·克里扎诺夫斯基^b、，¹

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关联数据

补充资料: 补充信息补充图1-5和补充表1
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GUID:36691669-0D9D-4328-8A54-6A38E7143A5F

摘要

衰老细胞是为了应对生理和致癌压力而形成的，有助于防止肿瘤发生，并有助于组织修复。然而，这种细胞在组织中的积累会导致与年龄相关的疾病。衰老细胞对凋亡刺激的抵抗可能有助于其积累，但其延长生存能力的分子机制尚不明确。在这里，我们发现衰老细胞上调抗凋亡蛋白BCL-W和BCL-XL。siRNAs或小分子ABT-737联合抑制BCL-W和BCL-XL特异性诱导衰老细胞凋亡。值得注意的是，ABT-737对小鼠的治疗有效地消除了由肺部DNA损伤引起的衰老细胞，以及通过转基因p14激活p53而在表皮形成的衰老细胞^{农业研究基金}从表皮中消除衰老细胞会导致毛囊干细胞增殖增加。衰老细胞可以通过药物消除的这一发现为治疗年龄相关疾病的新策略铺平了道路。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为ncomms11190-i1.jpg 组织内衰老细胞的积聚在许多与年龄相关的病理中起着作用。约瑟夫和皮尔佩尔等证明这些细胞对凋亡的抵抗是由存活蛋白的上调驱动的，其药理学抑制触发小鼠衰老细胞的消除。

细胞衰老是一种稳定的细胞周期阻滞形式，限制了细胞的增殖潜能。衰老在许多细胞类型中被触发，以应对不同形式的细胞应激¹^，2^，三^，4癌前病变中衰老的激活是肿瘤发生的有力屏障。此外，衰老被证明有助于抗癌药物的细胞毒性，并通过限制细胞过度增殖来支持组织修复⁵^，6^，7^，8^，9^，10.

虽然短期诱导细胞衰老在各种情况下都是有益的，但衰老细胞的长期滞留似乎对生物体有害。这些细胞通常会分泌促炎因子，在某些情况下，这些因子可以被免疫系统清除¹¹然而，如果衰老细胞保留在组织中，这些因素会以非自主的方式促进局部炎症、组织老化、组织破坏以及潜在的肿瘤发生和转移¹^，三^，12^，13消除小鼠过早衰老模型中的衰老细胞可以减少组织衰老¹⁴因此，了解衰老细胞活力是如何在分子水平上调节的，可以指向能够特异性消除衰老细胞的药理靶点体内试验。这种消除可以评估细胞衰老在不同病理条件下的功能重要性，并可能导致治疗的发展。

据报道，衰老细胞对外源性和内源性促凋亡刺激具有抵抗力¹⁵^，16^，17虽然对衰老的驱动机制进行了深入研究，但对赋予这些细胞增加生存能力的机制的理解仍然有限。BCL-2蛋白家族通过多种机制，包括凋亡和自噬，在细胞死亡调节中起着核心作用¹⁶^，18^，19该家族包括抗凋亡蛋白BCL-2、BCL-W、BCL-XL、MCL-1和A1，并作为癌症药物干预的靶点进行了深入研究²⁰^，21我们开始评估这些BCL-2家族成员及其组合对衰老细胞生存能力的个人贡献。我们发现，BCL-W和BCL-XL的增加是衰老细胞抗凋亡的基础，它们的联合抑制导致衰老细胞死亡。我们发现，以BCL-2、BCL-W和BCL-XL蛋白（ABT-737）为靶点的小分子抑制剂可导致衰老细胞优先凋亡在体外和体内，并从组织中清除这些细胞，为有针对性地清除衰老细胞打开了大门。

结果

衰老细胞上调Bcl-2家族蛋白

为了检测衰老细胞对内源性和外源性凋亡途径的抵抗力，我们在正常原代人成纤维细胞（IMR-90）中诱导衰老，这是该程序研究中最广泛使用的细胞模型之一⁵^，22^，23这是通过三种不同的方法完成的：用DNA损伤剂足叶乙甙处理以诱导DNA损伤诱导衰老（DIS）；复制衰老的复制耗竭（RS）；和致癌的表达H-Ras公司^V12版本用于肿瘤诱导衰老（OIS）。将这些细胞与增殖（生长）的载体处理细胞或空载体转导细胞进行比较。然后用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和环己酰亚胺（CHX）联合或紫外线照射处理衰老和对照IMR-90细胞，分别诱导外源性或内源性凋亡途径。TNF-α治疗后，衰老细胞的存活率显著高于对照细胞（DIS或RS细胞与生长细胞（G）的存活率分别为76或82%和49%；OIS细胞与载体转导细胞（V）分别为85%和40%；图1a). 衰老细胞中凋亡水平较低的三个标志物的切割减少证实了这一点：多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）；半胱氨酸蛋白酶激活的DNA酶抑制剂（ICAD）；和半胱天冬酶-3(图1b). 类似地，衰老细胞比对照细胞更耐紫外线照射（对照（G）细胞对DIS或RS细胞的抗性为52%对86%或75%；对照（V）细胞和OIS细胞分别为72%和92%；图1c). 上述发现证实，衰老细胞比非衰老细胞对内源性和外源性促凋亡刺激更具抵抗力。

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图1

BCL-2家族成员在衰老细胞中升高，并对凋亡产生抵抗。

(一)通过DNA损伤（DIS）、复制衰竭（RS）或癌基因表达（OIS）诱导衰老的IMR-90人成纤维细胞，以及对照增殖细胞（生长，G）和空载体转染（V）细胞，治疗10次 h使用TNF-α和CHX（TNF-β）或车辆（DMSO）。通过定量剩余粘附细胞来确定细胞相对于载药处理细胞的存活率。直方图显示与G或V对照组相比，衰老（DIS、RS和OIS）细胞存活的百分比。数据以三次重复的平均值±标准偏差表示。(b条)来自衰老和对照IMR-90细胞的裂解的PARP、ICAD和胱天蛋白酶-3蛋白的蛋白质印迹分析（标记为一)，表明TNF-α和CHX治疗后的细胞凋亡水平。(c（c）)衰老细胞和对照细胞（标记为一) 24 紫外线照射后h（80 J型米⁻²). 数据以三次重复的平均值±标准偏差表示。(d日)BCL-2家族成员（BCL-W、BCL-XL、BCL-2和MCL-1）和衰老效应蛋白（p16、p21、p53）在人类（IMR-90）和小鼠（MEF）来源的衰老细胞（DIS、RS和OIS）和对照细胞（G、V）中的表达。(e（电子）)衰老细胞和对照细胞的存活率（如一)以及在24小时治疗后的静止（Q）对照细胞中 h，使用指定浓度的ABT-737（BCL-W、BCL-XL和BCL-2抑制剂）。数据以三次重复的平均值±标准偏差表示。(（f）)用ABT-737（10 μM）24 h，有或没有预处理6 h和泛酶抑制剂z-VAD-fmk。数据以三次重复的平均值±标准偏差表示。(克)Western blot分析（f）中的数据b条，d日，克分别是至少两个独立实验的代表性印迹。使用Student’st吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.005.

我们假设抗凋亡蛋白水平的增加是衰老细胞抵抗凋亡的原因。BCL-2蛋白家族成员是内源性和外源性凋亡的重要调节因子¹⁸^，19我们测量了抗凋亡蛋白BCL-W、BCL-XL、BCL-2和MCL-1的水平（参考文献。²⁰)衰老细胞和对照（G）细胞中。人（IMR-90）细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中BCL-W、BCL-XL和BCL-2的表达水平均增加，其中衰老是由DNA损伤或H-Ras公司^V12版本表达式(图1d). MCL-1的表达因应力刺激条件而异(图1d).

鉴于在所有受试类型的衰老细胞中观察到BCL-W、BCL-XL和BCL-2的持续上调，我们使用ABT-737（BCL-2、BCL-XL和BCL-W的一种有效小分子抑制剂）检测了它们对细胞活力的抑制作用²⁴^，25。所有三种类型的人类衰老细胞对ABT-737治疗的敏感性均显著高于对照细胞，在测试的最高浓度下，死亡率高达65%(图1e). ABT-737治疗衰老和对照MEF后观察到同样的效果(补充图1a).

为了确定ABT-737处理的衰老细胞是否发生凋亡，我们在泛胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk存在下用ABT-737处理DIS和OIS细胞。该抑制剂完全阻止了ABT-737对衰老细胞的细胞毒性作用(图1f)并消除衰老细胞中PARP和caspase-3裂解增加(图1g). 这些发现表明，BCL-W、BCL-XL和BCL-2赋予衰老细胞对凋亡的抵抗力，而ABT-737对其的抑制会特异性触发这些细胞的细胞死亡。

BCL-W和BCL-XL维持衰老细胞的活性

ABT-737与BCL-W、BCL-XL和BCL-2有很高的亲和力，但与MCL-1没有亲和力（参考文献。²⁴). 为了了解不同抑制剂对BCL-2家族成员的广泛抑制是否也会导致衰老细胞的清除增加，我们用obatoclax、BCL-W、BCL-XL、BCL-2抑制剂和MCL-1相对选择性抑制剂处理IMR-90细胞（参考文献。²⁶). 令人惊讶的是，奥巴托拉索诱导的对照细胞死亡明显多于衰老细胞（生长细胞与DIS细胞的剩余粘附细胞分别为44%和64%；V细胞与OIS细胞的剩余附着细胞分别为39%和72%；图2a). 因此，奥巴曲克不能诱导衰老细胞的特异性死亡。

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图2

BCL-W和BCL-XL维持衰老细胞的活性。

(一)IMR-90人成纤维细胞（DIS和OIS细胞，以及对照G或V细胞）治疗24小时 h使用指定浓度的奥巴托克或载体（DMSO）。通过定量剩余粘附细胞来确定细胞相对于载药处理细胞的存活率。直方图表示与G或V对照组相比，衰老（DIS和OIS）细胞存活的百分比。数据以三次重复的平均值±标准偏差表示。(b条)中描述的细胞存活率一之后24 h使用指定浓度的BCL-2抑制剂ABT-199和SH-SY5Y细胞进行治疗，这些细胞表达高BCL-2水平，并作为药物反应的阳性对照。数据以三次重复的平均值±标准偏差表示。(c（c）)靶向siRNAs转导DIS细胞的存活率BCL-2型，BCL-W公司和BCL-XL型或者如所指示的它们的组合。(d日)小干扰RNA处理DIS细胞后BCL-2、BCL-W和BCL-XL的Western blot分析。(e（电子）)靶向siRNAs转导DIS细胞的存活率BCL-W公司，BCL-XL型或两者兼而有之，使用或不使用BCL-2抑制剂ABT-199（10 μM）。数据以三次重复的平均值±标准偏差表示。使用Student’st吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.005, ***P（P）<0.0005.

接下来，我们研究了BCL-W、BCL-XL和BCL-2对衰老细胞抗凋亡的个体贡献。BCL-W或BCL-XL没有特异性抑制剂，但BCL-2可以被ABT-199特异性抑制（参考文献。²⁷). 有趣的是，只有OIS细胞在ABT-199治疗后表现出显著的剂量依赖性细胞活力降低(图2b). ABT-199治疗导致OIS细胞活性降低可能是因为这些细胞中BCL-2水平降低(图1d)，与增加对BCL-2依赖性的致癌环境有关，或与两者都有关。然而，ABT-199对衰老或生长MEF的生存能力没有影响(补充图2a). 这些结果表明，BCL-W和BCL-XL是衰老细胞抗凋亡的主要原因。

为了进一步研究BCL-W和BCL-XL对衰老细胞抗凋亡的作用，我们使用siRNAs分别或共同沉默这两个基因。针对其中一种的siRNA混合物BCL-W公司或BCL-XL型有效地降低了它们的蛋白质水平，但单独沉默这些基因只会导致DIS细胞活力的轻微降低(图2c、d). 相反，联合敲除BCL-W和BCL-XL具有协同作用，导致细胞活力显著降低（53%）(图2c)，与ABT-737治疗诱导的结果相当。我们无法测试BCL-2型沉默，因为尽管观察到mRNA水平降低，但针对该基因的siRNAs仅导致其蛋白质水平轻微降低(图2d和补充图2b). 为了进一步描述BCL家族三个成员的相对贡献，我们用siRNAs处理衰老细胞BCL-W公司，BCL-XL型或其组合，以及BCL-2抑制剂ABT-199(图2e). 类似地，当抑制剂与siRNAs联合使用时，ABT-199对BCL-2的抑制会降低细胞存活率BCL-W公司（增长14%），与BCL-XL型（16%）或两者都反对（13%）。然而，这种额外的作用只是加性的，而不是在BCL-W和BCL-XL联合抑制的情况下观察到的协同作用。因此，尽管所有三个家族成员都有助于DIS细胞的生存能力，但BCL-W和BCL-XL比BCL-2发挥更突出的作用。

BCL-W和BCL-XL蛋白的表达调控

接下来，我们着手揭示衰老细胞中BCL-W和BCL-XL蛋白积累的分子基础。首先，我们评估了这些基因的转录水平。这个BCL-W公司基因编码产生相同蛋白质的两个转录变体，并从不同的转录起始位点启动。定量实时PCR分析显示BCL-W公司与对照组相比，只有RS细胞的variant-1（v1）mRNA水平升高（G）(图3a). 相比之下BCL-W公司与对照组相比，在所有检测的衰老细胞中检测到variant-2（v2）mRNA水平(图3b). 因此，我们得出结论，BCL-W蛋白转录的增加可能是衰老细胞中观察到其蛋白水平升高的原因。BCL-XL型mRNA水平仅在OIS细胞中相对于对照细胞升高（V）(图3c). 因此，该基因的转录上调可能与OIS细胞中该基因的升高有关，但不能解释DIS或RS细胞中观察到的其蛋白表达的增加。

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图3

衰老细胞中调节BCL-W和BCL-XL蛋白水平的分子机制。

(一，b条)mRNA表达水平BCL-W公司IMR-90人成纤维细胞（DIS、RS和OIS细胞）以及IMR-90对照（G或V）细胞中的变异体1和2（分别为v1和v2）。数据以三次重复的平均值±标准误差表示。(c（c）)mRNA表达水平BCL-XL型在IMR-90人成纤维细胞（DIS、RS和OIS细胞）以及IMR-90对照（G或V）细胞中。数据以三次重复的平均值±标准误差表示。(d日)CHX在治疗后的指定时间点抑制蛋白翻译后，对BCL-W和BCL-XL进行Western blot分析。(e（电子）)蛋白质水平的量化d日数据表示为三个独立实验的平均值±s.e.m。(（f）)蔗糖梯度分馏后对照（G）和衰老（DIS）细胞的多糖体图谱。计算了单体（分数#1）和多核糖体（分数2−5）的曲线下面积，表明DIS细胞中的多糖体含量低于G细胞。数据以三个独立实验的平均值±s.e.m表示。(克)mRNA的分布GAPDH、肌动蛋白、p53和BCL-XL型衰老（DIS）细胞和对照（G）细胞的核糖体部分。所示的变化与总mRNA有关。数值表示来自三个独立核糖体分馏的总mRNA每一部分中mRNA的平均百分比。(小时)双顺反子结构的示意图。BCL-XL构造包含5′-UTR的IRESBCL-XL公司（参考。³³). (我)相对IRES活性由转染IMR-90细胞的所有构建物的Fluc/Rluc比率表示。数据以三个独立实验的平均值±s.e.m表示。使用Student’st吨-测试*P（P）<0.05. **P（P）<0.005.

BCL-XL蛋白在DIS细胞中的积累可能是由于其翻译或降解速度的差异所致。首先，我们开始研究蛋白质降解的改变是否能解释DIS细胞中BCL-XL蛋白水平的增加。我们用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞，并监测蛋白质降解率随时间的变化。12之后治疗h后，BCL-XL和BCL-W的蛋白质水平都降低了一半(图3d和补充图3a)对照组和DIS细胞的蛋白质降解率没有差异(图3e). 同样，在蛋白酶体机制受到抑制后，我们观察到蛋白质水平没有差异；这与已知由蛋白酶体调节的TP53（p53）蛋白水平的显著增加形成了对比²⁸(补充图3b，c). 因此，蛋白质降解速率的差异不太可能解释BCL-XL和BCL-W在DIS细胞中的积累。

接下来我们检查了在DIS细胞中BCL-XL的翻译率是否发生变化。我们通过蔗糖梯度分馏将控制细胞和衰老细胞的核糖体分离为单体（组分#1，未翻译）和多核糖体（多体，组分#2-5）(图3f). 在DIS细胞中，我们发现与对照细胞相比，多糖体含量较低，单糖体含量相应较高（多糖体分别为23%和37%，单糖体分别为77%和63%；图3f). 因此，正如其他类型细胞应激的报道²⁹，DIS单元中的全局平移减少。接下来，我们计算了不同核糖体组分中mRNA含量的分布。GAPDH和肌动蛋白mRNA在这些组分中的分布在对照细胞和衰老细胞之间保持不变。因此，这些基因可以代表对照，其在测试的两种细胞类型中的翻译水平相似(图3g). 然后我们检测了p53 mRNA的多体分布，其在衰老细胞中的蛋白水平上调(图1d). 因为p53的表达主要由蛋白酶体调节(补充图3b)，其mRNA在不同核糖体组分之间的分布没有变化(图3g). 然而，与p53不同BCL-XL型核糖体组分之间的mRNAs显示出向较重的多体组分的显著转移。在DIS细胞中，我们检测到与生长对照组相比，第3组分中BCL-XL的存在显著增加(图3g). 这种影响伴随着减少BCL-XL型在未翻译（分数#1）和相对轻多体分数（分数#2）中。这些结果与DIS细胞中BCL-XL翻译率增加一致。

细胞应激对哺乳动物细胞蛋白质翻译的影响³⁰DNA损伤后衰老细胞中调控BCL-XL翻译的机制可能依赖于cap依赖性和cap依赖型翻译，如前所述BCL-2（参考文献。³¹). 雷帕霉素（mTOR）的机制靶点通过控制翻译起始因子4E-结合蛋白（4EBP）和S6激酶（S6K1和S6K2）的磷酸化和活性水平来调节cap依赖性翻译（参考文献。³²). 我们发现与对照相比，DIS细胞中mTOR活性降低(补充图3d)与已知的p53抑制作用一致。雷帕霉素进一步抑制这些细胞中的mTOR并不影响BCL-W或BCL-XL蛋白水平(补充图3e).

这表明cap依赖性机制调节DIS细胞中BCL-W和BCL-XL蛋白的翻译。5′-非翻译区（UTR）BCL-XL型转录本包含一个内部核糖体进入位点（IRES）元件，该元件可能通过cap依赖性启动调节其翻译³³为了测试BCL-XL翻译是否受其IRES基序控制，用含有BCL-XL型IRES位于两个荧光素酶顺反子之间，因此IRES位于萤火虫荧光素素酶基因的上游(图3h). 对细胞进行双荧光素酶报告分析，并通过测量萤火虫与雷尼拉（Fluc/Rluc）萤光素酶发光比率计算BCL-XL IRES活性。由于DIS细胞中的cap依赖性翻译被抑制(补充图3d)，我们使用了一个缺少IRES元素的控制向量作为参考³⁴.显著增加BCL-XL型在DIS细胞中检测到IRES活性，与生长对照组相比（G）(图3i). 因此，DIS细胞中BCL-XL翻译增加可能受其IRES基序调控。总之，我们的研究结果表明，衰老细胞中BCL-XL和BCL-W的表达增加是由转录和翻译机制共同调节的。

ABT-737消除DNA损伤后的衰老细胞体内

我们的上述实验表明，ABT-737处理可选择性消除组织培养中的衰老细胞，包括通过直接诱导DNA损伤而诱导衰老的细胞。因此，我们开始测试ABT-737治疗在消除DNA损伤诱导的衰老细胞方面的有效性体内为此，我们通过电离辐射诱导小鼠的肺损伤和衰老，电离辐射会导致衰老细胞在肺中长期积累，而衰老细胞很容易通过持续的DNA损伤来识别³⁵照射后7天，用ABT-737处理小鼠2天，1天后，切除肺并分析衰老标记物的表达。SA-β-Gal染色显示ABT-737治疗后衰老细胞数量显著减少(图4a、b). 这种减少伴随着γH2AX阳性肺细胞数量的显著减少(图4c)衰老标志物p53和p21的表达减少(图4d，e). ABT-737、BCL-XL和BCL-W的分子靶点在受照射的肺中表达，并且其水平因治疗而降低(图4d，e). 衰老标记物和ABT-737靶蛋白表达的减少伴随着caspase-3裂解的增加，表明治疗后肺细胞凋亡增加。这些发现证实了ABT-737治疗可以消除DIS细胞体内.

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图4

ABT-737可消除受照小鼠肺部的衰老细胞。

(一)照射后7天，用ABT-737治疗小鼠(n个=5）或车辆(n个=5）连续2天。1天后解剖肺部，切片，并对切片进行SA-β-Gal染色。比例尺，10 微米。(b条)赋形剂或ABT-737处理小鼠细支气管区域SA-β-Gal染色的定量。数据以每组五只小鼠的平均值±标准偏差表示。(c（c）)在载体或ABT-737治疗后的第1天，分离肺组织，进行γH2AX染色，并用FACS进行分析。通过此分析定量γH2AX阳性细胞的百分比。数据以每组五只小鼠的平均值±标准误差表示。(d日)小鼠Bcl-w、p53和p21的Western blot分析一。两只老鼠代表每种情况，每行代表一只老鼠。(e（电子）)未受辐射小鼠和一对Bcl-xL、p53和凋亡标记裂解caspase-3进行染色。比例尺，10 微米。中的数据b条，c（c）使用Student的t吨-测试*P（P）<0.05, ***P（P）<0.0005.

ABT-737消除皮肤中p53诱导的衰老细胞

接下来，我们测试了ABT-737对BCL蛋白家族的抑制是否可以消除皮肤中p53直接激活诱导的衰老细胞。为此，我们使用双转基因K5-rtTA/tet-p14小鼠，其中人类第14页^{农业研究基金}基因在皮肤表皮的基底层诱导表达³⁶.诱导第14页^{农业研究基金}在这些小鼠中，激活p53并生成衰老的表皮细胞，这些细胞在组织中保留数周³⁶为了生成衰老细胞，我们激活了第14页^{农业研究基金}在3周龄小鼠中放置4周，然后用ABT-737连续治疗4天。通过SA-β-Gal染色测定，ABT-737处理小鼠的表皮中衰老细胞的数量显著减少，而与车辆处理小鼠相比(图5a–c). ABT-737治疗这些小鼠2天后，观察到类似程度的消除（数据未显示）。同时，转基因p14的表皮细胞百分比^{农业研究基金}可以检测到的蛋白质减少了(图5d，e)，表明首选消除转基因表达细胞。ABT-737治疗2天后，表皮细胞凋亡水平增加(图5f，g)与细胞凋亡增加相一致，这是衰老细胞消除的机制。这些发现表明，BCL家族蛋白提供的生存信号是衰老细胞保留在组织中能力的重要组成部分，如果没有BCL家族蛋白质，衰老细胞会迅速死亡。

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图5

ABT-737治疗可消除衰老的表皮细胞并诱导干细胞增殖。

(一)对照tet-p14（Ctrl）小鼠和用dox治疗4周以激活p14的K5-rtTA/tet-p14小鼠的SA-β-Gal（蓝色）皮肤切片染色^{农业研究基金}随后连续4天用ABT-737（p14+ABT）或载体（p14+V）治疗。(b条)SA-β-半乳糖⁺小鼠每个显微视野的细胞数一(c（c）)SA-β-Gal活性的FACS分析（C₁₂FDG染色）。闸门指示SA-β-Gal⁺细胞百分比。FSC-A正向散射。(d日)人类p14的皮肤切片染色^{农业研究基金}（白色，箭头所示）在ABT-737或溶媒治疗2天后从指定的小鼠身上取下。K14（绿色）标记基底表皮。(e（电子）)第14页^{农业研究基金+}小鼠每场细胞数c（c）(（f）)老鼠的部分，如c（c）对凋亡标记裂解caspase-3（CC3，箭头）进行染色。(克)CC3号机组⁺同一只小鼠的每场细胞数。(小时)在ABT-737或载体治疗4天后，表达p14的小鼠的毛囊隆起部分进行增殖标记Ki67（绿色，箭头）和隆起标记K15（红色）染色。(我)Ki67的数量⁺K15号公路⁺小鼠每个卵泡的细胞数小时点表示单个小鼠的平均数，结合三个独立实验。(j个)在ABT-737或载体治疗2天后，对指定小鼠的表皮细胞进行典型的FACS分析，并对其进行CD34、CD49f和Sca1染色。图表仅显示Sca1^–（滤泡）细胞。门表示CD34的百分比^+/CD49f型^高的毛发干细胞。n个=每组2只小鼠，实验进行两次。自始至终，点表示单个小鼠，条形表示平均值±s.e.mb条，e（电子），（f）显示小鼠结合了四分之二的独立实验*P（P）<0.05; **P（P）<0.005; ***P（P）<0.0005（学生）t吨-测试。比例尺，25 μm。

在第14页^{农业研究基金}3周龄小鼠的激活几乎所有毛囊都在静息状态（休止期）停止，只有隆起部位的罕见干细胞表达增殖标记Ki67（参考文献。³⁶) (图5h，i). 有趣的是，我们发现在p14的2-4周后用ABT-737治疗^{农业研究基金}诱导导致隆起部增殖的发际干细胞数量增加(图5h，i). 停止治疗三天后，这种效果也很明显(补充图4). 此外，CD34的数量⁺/CD49f型^高的治疗后突起干细胞增多(图5j). 这些发现表明，消除衰老的毛状干细胞可以使其他（非遗传）隆起细胞开始增殖并重新填充干细胞室。

讨论

我们的研究结果表明，BCL蛋白家族激活是衰老细胞获得更强的抗凋亡能力并支持其在组织内滞留的一个中心分子机制。衰老细胞抵抗急性损伤引起的凋亡可能对机体有益，因为这些细胞可能有助于在修复过程中维持组织完整性；一旦不再需要它们的存在，衰老细胞可能会被免疫系统清除⁵^，15这种抗性也可能有助于在胚胎发育期间维持衰老细胞³⁷^，38^，39然而，在慢性损伤的情况下，由于不同组织和不同病理条件下的免疫监测差异，衰老细胞可能会积聚。这种积累会对生物体有害^三.

我们发现，BCL-XL和BCL-W是BCL家族成员中支持DIS细胞生存的核心，这些蛋白通过转录增加和cap依赖性翻译的结合而上调。我们测试的所有类型的衰老细胞中BCL-W表达的调节主要通过基因短变异体的转录调节来实现，该基因是从另一个转录起始位点转录的。由于BCL-W的mRNA水平增加，我们采用的多聚体分离方法无法识别翻译差异。因此，我们不能排除翻译调控也在BCL-W表达中起作用的可能性，类似于我们在DIS细胞中检测到的BCL-XL的特异性翻译增加。这种特异性翻译是由基因5′-UTR中存在的IRES元件驱动的，该元件被证明具有增强cap依赖性翻译的能力³³值得注意的是，帽依赖性翻译在对各种形式的细胞应激的反应中受到抑制²⁹DNA损伤反应引起的细胞应激是导致衰老和年龄相关疾病衰老的中心机制²^，三^，12因此，在这些条件下积累的衰老细胞中，特定翻译模式的激活可能是导致BCL-XL上调和抗凋亡的中心机制。与这些细胞相比，肿瘤诱导的衰老细胞增加了mTOR信号，导致整体翻译增加⁴⁰^，41在这种情况下，观察到的mRNA水平的增加可以导致细胞中BCL-W和BCL-XL的积累，并支持其生存能力。因此，BCL-XL和BCL-W蛋白的表达调控可能依赖于衰老诱导的特定环境。

重要的是，我们在这里表明，抑制BCL-W和BCL-XL特异性地诱导衰老细胞的凋亡在体外和体内这是首次证明从活组织溶栓药物治疗中有效靶向药物去除衰老细胞的证据之一。我们在两个独立的衰老模型中显示了ABT-737的衰老活性体内：全身照射引起的肺部DIS，以及在没有DNA损伤的情况下由p53激活诱导的皮肤衰老转基因模型。

在肺中，照射后检测到大量表达Bcl-xl和DNA损伤标记物γH2AX的衰老细胞，这些细胞通过处理被消除。在皮肤中，我们之前已经显示p14^{农业研究基金}这种表达导致表皮中衰老细胞的积累，并且这些细胞会保留数周³⁶在这里，我们显示ABT-737治疗可以消除大多数这些衰老细胞，表明抗凋亡信号对其在组织中的滞留至关重要。此外，第14页^{农业研究基金}激活使毛发干细胞不可逆转地停止生长，阻止卵泡生长³⁶我们在这里显示，ABT-737允许一些隆起干细胞重新进入细胞周期，导致干细胞总数增加。造血系统中最近的类似观察强烈支持了这些观察与不同组织和条件的相关性⁴²然而，在我们的实验期间，我们没有观察到这些小鼠毛发的显著再生，这表明在此期间积累的活化干细胞总数不足以执行此任务，或者毛囊的额外损伤阻止了它们的再生。总的来说，这些发现表明，清除衰老细胞可以导致组织更新和适应能力的提高，这一可能性与最近的发现一致，即通过转基因技术和组合治疗消除衰老细胞可以改善衰老相关的表型¹⁴^，43.

药物消除衰老细胞的能力体内这为研究衰老细胞在检测到它们的各种生理环境中的作用打开了大门，并剖析了它们的有益和有害功能。重要的是，这是朝着在衰老相关疾病等环境中潜在的衰老药物临床应用迈出的早期一步。通过化疗消除癌前病变和肿瘤中的衰老细胞也可能被证明是有益的，尤其是在肿瘤或基质中衰老细胞具有促肿瘤功能的特殊情况下。总的来说，我们的发现揭示了维持组织中衰老细胞存活和保留的中心分子机制，并表明通过抑制该机制消除衰老细胞是一种在肿瘤发生和年龄相关疾病中靶向衰老细胞的有希望的策略。

实验程序

细胞培养

人IMR-90成纤维细胞从ATCC获得。根据标准程序隔离MEF⁴⁴细胞保存在补充了2 百万分之一L（左）-谷氨酰胺，100 单位/ml青霉素，100 微克毫升⁻¹链霉素和10%胎牛血清。DNA DIS通过依托泊苷处理（E1383，Sigma）引入，浓度为50 48μM h.处理7天后，细胞获得衰老表型。通过逆转录病毒感染突变的H-Ras（pLPC-mCherry-H-Ras12V质粒）引入OIS⁴⁵)3%氧气。空载体转导细胞作为对照。细胞在选择后7天获得衰老表型。通过组织培养中细胞的长期传代诱导RS。细胞在40个群体加倍后获得衰老表型。

细胞凋亡测定

将靶细胞以1.2×10的比例放置在12孔板中⁵每个孔的细胞数。接种后24小时，用75 纳克毫升⁻¹TNF-α（210-TA-020，研发系统）和10 微克毫升⁻¹CHX（C1988，Sigma）用于10 h.存活率是根据使用PrestoBlue试剂（A13262，Life Technologies Ltd.）对剩余粘附细胞相对于对照DMSO处理细胞的定量来确定的。

紫外线敏感性分析

如上所述对靶细胞进行铺板。种子细胞清洗后24小时，用Hank的缓冲液培养，并在254℃下用UV-C照射 nm，使用低压汞灯（TUV 15w G15T8，飞利浦）。使用配备254的UVX辐射计（UVP）测量紫外线剂量率 nm探测器。照射后，细胞在新鲜培养基中再培养24小时 h.使用PrestoBlue试剂相对于未辐照细胞对剩余贴壁细胞进行定量。

细胞存活分析

按照上述方法对靶细胞进行电镀，并将指示的分子以指示的浓度添加到每个孔中24 h.从Selleck Chemicals购买ABT-737和Obatoclax（分别为S1002和S1057）。ABT-199从ChemieTek（CT-A199）购买。Z-VAD-FMK购自圣克鲁斯生物技术公司（SC-311561A），并添加到细胞4中添加浓度为100的ABT-737前h 微米。

免疫印迹法

细胞裂解物（15-30 μg蛋白质）通过15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶溶解，并转移到Immobilion P膜（IPVH00010，Millipore）上。在TBST中用5%的BSA阻塞1天后（TBS用0.01%吐温20） h、用抗裂解-PARP（#9541）、裂解-ICAD（#9731）、裂解caspase-3（#9661）、BCL-W（#2724）、BCL-XL（#2764）和BCL-2（#2870）（均来自细胞信号）、Mcl-1（1239-1，表观）、p16（sc-1207，Santa Cruz）和β-Tubulin（sc-9104，Santa Cruz）、p21（556431，BD Bioscience）、，p53（DO-1和PAb1801的混合物，由Weizmann科学研究所Moshe Oren教授善意提供）和β-肌动蛋白（A5441，Sigma）。用化学发光检测法观察抗体（34080，美国赛默飞世尔科技公司）。为了进行蛋白酶体降解分析，细胞与MG-132（BML-PI102-0005，Enzo）在指定的浓度和时间下培养。最重要的斑点扫描显示在补充图5.

小干扰RNA

细胞转染50 nM的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA靶向Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL（分别为L-003307-00-0005、L-004384-00-0005和L-0030458-00-00005）或非靶向siRNA池（D-001810-10-20）作为对照（均来自Thermo Scientific）。整夜进行转染。转染后4天，用PrestoBlue试剂定量剩余的粘附细胞。

定量实时PCR

使用RNeasy试剂盒（74104，Qiagen）提取总RNA，然后进行DNase I处理。使用随机六聚体产生cDNA。在StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）中，使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix（11744-500，Life Technologies）扩增cDNA样本。使用GAPDH或Actin的表达水平对相对表达进行标准化。引物序列见补充表1.

多聚体剖面

细胞接种于15 cm板。48小时后，将细胞培养5小时最小值为100 微克毫升⁻¹CHX，用PBS+CHX清洗，收获后再悬浮0.5 ml改良LBA缓冲液（20 mM Tris，pH值8140 mM氯化钾，5 mM氯化镁，100 微克毫升⁻¹瑞士，1.8 米DTT，200 U型毫升⁻¹Rnasine、蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物，均来自Sigma）³⁴然后，将Triton X-100和脱氧胆酸盐分别添加到0.5%的最终浓度，用于5 冰上min，然后是5 12000分钟离心克等外径单位（260 nm）从每个样品中加载到10–50%线性蔗糖梯度上，并在260173下离心克(39,000 r.p.m.）100 4时最小值摄氏度。梯度从顶部分为200个使用NanoDrop（NanoDrot 2000c，Thermo）手动测量μl组分（总共51个）和RNA。分析后，合并OD级分，并根据制造商的方案，使用TRI试剂（Sigma）和Direct zol RNA MiniPrep试剂盒（R2050，Zymo Research）从每个级分中提取RNA。RNA在25年内重新悬浮 μl无RNase水。对于带有反转录反应的PCR，1 从每个梯度的不同部分提取μg RNA，然后进行逆转录PCR。

双荧光素酶测定

BCL-XL 5′-UTR的双顺反子结构和对照结构由A.Kimchi（魏茨曼研究所）善意提供。对于双核糖核酸酶分析，7×10⁴IMR-90细胞在24孔板中的每个孔中被镀，24孔板转染前h。使用TurboFect转染试剂（Thermo Fisher Scientific）用双顺反子构建物转染细胞。测定了Renilla和Firefly荧光素酶活性48 h转染后，使用双荧光素酶报告分析系统（美国普罗米加），根据制造商的协议，使用Veritas光度计（美国普罗米加）。通过计算萤火虫萤光素酶/雷尼拉萤光素酶发光比率来确定相对IRES活性。

老鼠

所有实验均经魏茨曼研究所和希伯来大学动物护理和使用委员会批准。K5-rtTA/tet-p14转基因小鼠和单个转基因同胞对照（C57Bl/129sv背景）接受多西环素（2 毫克毫升⁻¹，Sigma）在3周龄时饮用水中激活p14^{农业研究基金}转基因。转基因激活2-4周后，ABT-737（75 毫克公斤⁻¹在30%丙二醇、5%吐温80、3.3%葡萄糖溶液（pH 4-5）或载体中注入p14^{农业研究基金}-连续2天或4天腹腔内表达小鼠。然后将小鼠剃毛并处死，将背部皮肤石蜡包埋进行免疫组织学检查，或将其冷冻在OCT溶液中进行冰冻切片和SA-β-半乳糖染色。为了诱导DNA损伤和衰老，6-8周龄的雄性小鼠接受8 Gy.照射后7天，小鼠腹腔注射75 毫克公斤⁻¹ABT-737或车辆2天。老鼠被杀24只最后一次注射ABT-737后h。

免疫组织学

根据5日的标准程序进行免疫组织学检查 μm石蜡切片，使用过氧化物酶底物试剂盒（载体）或荧光标记的二级抗体（杰克逊）。使用的抗体：p14^{农业研究基金}（Abcam，ab3642）、CC3（细胞信号，#9661）、Ki67（Labvision，RM-9106）、K14（Progen，GP-CK14）和K15（Santa Cruz sc-56520）。对于SA-β-Gal染色，10-12 μm OCT包埋小鼠皮肤冰冻切片在0.5%戊二醛中固定15 最小值，并按照前面所述进行染色³⁶。使用奥林巴斯CX41和DS-Fi1摄像头采集明亮的视野图像，并使用NIS Elements软件（尼康）进行处理。使用奥林巴斯FV1000共焦显微镜采集荧光图像。细支气管区SA-β-Gal染色采用ImageJ定量，皮肤目视评分定量。在所有污渍中，每个样品的显微镜视野都超过10个。通过计算K15的数量对增殖的发际干细胞进行评分⁺Ki67号机组⁺每个卵泡的细胞数，在每只老鼠的>15个场中（每个场1–3个卵泡）；数值表示每只小鼠的平均数。

荧光辅助细胞筛选分析

使用参考文献中描述的程序分离成人表皮细胞。⁴⁶稍作修改。小鼠背部皮肤被剃光并切除。皮肤的真皮侧用手术刀刮去脂肪和肌肉组织。皮肤在胰蛋白酶0.25%EDTA溶液中漂浮过夜，4 °C，然后刮去表皮，切碎并悬浮在胰蛋白酶-PBS 0.5%BSA溶液中，并通过70 μm细胞过滤器，然后通过40 μm细胞过滤器。总计1×10⁶将活表皮细胞重悬于100 μl含0.5%BSA的PBS，孵育30 4时最小值 °C与以下结合抗体：CD34（BD Bioscience 562608）、CD49f（eBioscision 17-0495-80）和Sca1（Biolegend 108113）。使用荧光β-半乳糖苷酶底物C测定SA-β-Gal活性₁₂FDG（Invitrogen D-2893），如上所述⁴⁷使用MACSQuant荧光激活细胞分选（FACS）分析仪（Miltenyi）分析样品。C类₁₂FDG（33 μM）添加到1×10⁶活悬浮细胞并孵育1 37小时 °C，轻轻摇晃，荧光细胞通过FACS评分。对于肺细胞中的γ-H2AX定量，将肺切碎并通过培养1 h，RPMI补充0.5 毫克毫升⁻¹胶原酶IV和0.02 毫克毫升⁻¹DNase I在37 摄氏度。然后用100过滤细胞 μM尼龙过滤网，用PBS洗涤两次，并用抗γ-H2AX一级抗体培养过夜（细胞信号）。细胞清洗两次并培养45 用二级抗体（Jackson ImmunoResearch）进行min，然后再进行两次清洗和10次 DAPI染色。然后用FACS分析细胞。

统计分析

数据以平均值±标准误差表示。使用Student’st吨-测试。考虑了统计显著性的标准P（P）<0.05.

其他信息

如何引用本文：约瑟夫。等通过抑制BCL-W和BCL-XL直接消除衰老细胞。国家公社。7:11190 doi:10.1038/ncomms11190（2016）。

补充材料

补充信息：

补充图1-5和补充表1

单击此处查看。^{（800K，pdf格式）}

致谢

我们感谢A.Kimchi和D.G.A.Burton（魏茨曼研究所）对手稿的批判性阅读和富有洞察力的建议；Shira Weingarten-Gabbay（魏兹曼研究所），帮助进行荧光素酶报告试验；M.Oren（魏茨曼研究所）提供p53抗体；和克里扎诺夫斯基实验室的所有成员进行深入讨论。这项工作得到了欧盟第七框架计划下欧洲研究理事会对V.K.的拨款支持。I.B.-P.得到了以色列科学基金会（批准号1009/13）和雅各布和莱娜·乔尔斯纪念基金会生命与医学卓越高级讲座的支持。V.K.是生命科学卡尔和弗朗西斯·科恩职业发展主席的现任者。

脚注

作者贡献R.Y.、N.P.、R.T.-A.、A.B.和Y.O.设计并执行了实验。S.C、E.V、L.D.、E.C.和R.C.进行了实验。R.Y.、I.B-P.和V.K.撰写了手稿。I.B.-P和V.K.监督了该项目。

工具书类

Salama R.、Sadaie M.、Hoare M.和Narita M。细胞衰老及其效应程序.基因发育。 28, 99–114 (2014).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
Munoz-Espin D.和Serrano M。细胞衰老：从生理到病理.自然修订版分子细胞生物学。 15, 482–496 (2014). [公共医学][谷歌学者]
坎皮西J。衰老、细胞衰老与癌症.每年。生理学评论。 75, 685–705 (2013).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
Kuilman T.、Michaloglou C.、Mooi W.J.和Peeper D.S。衰老的本质.基因发育。 24, 2463–2479 (2010).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
克里扎诺夫斯基五世。等。活化星状细胞的衰老限制肝纤维化.单元格 134, 657–667 (2008).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
米哈洛格鲁C。等。人痣BRAFE600相关衰老样细胞周期阻滞.自然 436, 720–724 (2005). [公共医学][谷歌学者]
科拉多·M。等。肿瘤生物学：癌前肿瘤的衰老.自然 436, 642 (2005). [公共医学][谷歌学者]
陈志。等。p53依赖性细胞衰老在抑制铂缺乏肿瘤发生中的关键作用.自然 436, 725–730 (2005).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
布雷格·M。等。癌基因诱导的衰老是淋巴瘤发展的初始障碍.自然 436, 660–665 (2005). [公共医学][谷歌学者]
施密特C.A。等。由p53和p16INK4a控制的衰老程序有助于癌症治疗的结果.单元格 109, 335–346 (2002). [公共医学][谷歌学者]
萨吉夫A.和克里扎诺夫斯基V。衰老细胞的免疫监测：衰老计划的光明面.生物老年学 14, 617–628 (2013). [公共医学][谷歌学者]
Ovadya Y.和Krizhanovsky V。衰老细胞：年龄相关疾病的SAP驱动因素.生物老年学 15, 627–642 (2014). [公共医学][谷歌学者]
Krtolica A.、Parrinello S.、Lockett S.、Desprez P.Y.和Campisi J。衰老成纤维细胞促进上皮细胞生长和肿瘤发生：癌症和衰老之间的联系.程序。国家科学院。科学。美国 98, 12072–12077 (2001).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
贝克·D·J。等。清除p16Ink4a阳性衰老细胞延缓衰老相关疾病.自然 479, 232–236 (2011).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
萨吉夫A。等。颗粒胞吐介导衰老细胞的免疫监视.癌基因 32, 1971–1977 (2013).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
王毅（Wang E.）。衰老的人成纤维细胞抵抗程序性细胞死亡，并且不能抑制bcl2参与其中.癌症研究。 55, 2284–2292 (1995). [公共医学][谷歌学者]
Sasaki M.、Kumazaki T.、Takano H.、Nishiyama M.和Mitsui Y。尽管Bcl-2水平较低，但衰老细胞仍能抵抗死亡.机械。老龄化发展。 122, 1695–1706 (2001). [公共医学][谷歌学者]
叶克伟（Yip K.W.）和里德（Reed J.C.）。Bcl-2家族蛋白与癌症.癌基因 27, 6398–6406 (2008). [公共医学][谷歌学者]
Cory S.、Huang D.C.和Adams J.M。Bcl-2家族：在细胞生存和肿瘤发生中的作用.癌基因 22, 8590–8607 (2003). [公共医学][谷歌学者]
Azmi A.S.、Wang Z.、Philip P.A.、Mohammad R.M.和Sarkar F.H。新型Bcl-2抑制剂治疗癌症.专家操作。急救药物 16, 59–70 (2011).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
泽特林·B.D.、泽特林·I.J.和诺·J.E。抑制圈扩大：Bcl-2小分子抑制剂作为抗癌细胞和抗血管生成药物.临床杂志。昂科尔。 26，4180–4188（2008年）。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
成田M。等。高迁移率A族蛋白在细胞衰老和异染色质形成中的新作用.单元格 126, 503–514 (2006). [公共医学][谷歌学者]
Serrano M.、Lin A.W.、McCurrach M.E.、Beach D.&Lowe S.W。癌基因ras引起与p53和p16INK4a积累相关的细胞过早衰老.单元格 88, 593–602 (1997). [公共医学][谷歌学者]
奥尔特斯多夫T。等。Bcl-2家族蛋白抑制剂诱导实体瘤消退.自然 435, 677–681 (2005). [公共医学][谷歌学者]
梅里诺D。等。在淋巴和白血病细胞中，Bcl-2、Bcl-x（L）和Bcl-w不是ABT-737和navitoclax（ABT-263）的等效靶点.血液 119, 5807–5816 (2012).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
Nguyen M。等。小分子obatoclax（GX15-070）拮抗MCL-1并克服MCL-1介导的细胞凋亡抗性.程序。美国国家科学院。科学。美国 104, 19512–19517 (2007).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
苏尔斯·A·J。等。ABT-199是一种有效且选择性的BCL-2抑制剂，在保留血小板的同时具有抗肿瘤活性.自然医学。 19, 202–208 (2013). [公共医学][谷歌学者]
Haupt Y.、Maya R.、Kazaz A.和Oren M。Mdm2促进p53的快速降解.自然 387, 296–299 (1997). [公共医学][谷歌学者]
Holcik M.和Sonenberg N。应激和细胞凋亡中的翻译控制.自然修订版分子细胞生物学。 6, 318–327 (2005). [公共医学][谷歌学者]
Spriggs K.A.、Bushell M.和Willis A.E。细胞应激条件下基因表达的翻译调控.分子电池 40, 228–237 (2010). [公共医学][谷歌学者]
马拉什L。等。DAP5促进Bcl-2和CDK1的cap依赖性翻译，以促进有丝分裂期间的细胞存活.分子电池 30, 447–459 (2008). [公共医学][谷歌学者]
Laplante M.和Sabatini D.M。生长控制和疾病中的mTOR信号.单元格 149, 274–293 (2012).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
Yoon A.公司。等。先天性X连锁角化不良IRES介导的翻译控制受损.科学类 312, 902–906 (2006). [公共医学][谷歌学者]
Weingarten-Gabbay S.公司。等。翻译起始因子DAP5促进IRES驱动的p53 mRNA翻译.癌基因 33，611–618（2014年）。[公共医学][谷歌学者]
Le O.N.公司。等。电离辐射诱导小鼠衰老标志物的长期表达与p53和免疫状态无关.老化细胞 9, 398–409 (2010).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
托卡斯基-阿米尔R。等。p14ARF诱导表皮衰老细胞形成和滞留动力学研究.癌症研究。 73, 2829–2839 (2013). [公共医学][谷歌学者]
斯托尔·M。等。衰老是一种促进胚胎生长和发育的发育机制.单元格 155, 1119–1130 (2013). [公共医学][谷歌学者]
穆诺兹·埃斯普林D。等。哺乳动物胚胎发育过程中的程序性细胞衰老.单元格 155, 1104–1118 (2013). [公共医学][谷歌学者]
丘普林A。等。ERVE1或麻疹病毒诱导的细胞融合导致细胞衰老.基因发育。 27, 2356–2366 (2013).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
拉贝奇R.M。等。MTOR通过促进IL1A翻译调节促肿瘤衰老相关分泌表型.自然细胞生物学。 17, 1049–1061 (2015).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
Herranz N.公司。等。mTOR调节MAPKAPK2翻译以控制衰老相关分泌表型.自然细胞生物学。 17, 1205–1217 (2015).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
张杰（Chang J.）。等。ABT263清除衰老细胞对小鼠衰老造血干细胞的再生作用.自然医学。 22, 78–83 (2016).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
朱Y。等。衰老细胞的致命弱点：从转录组到衰老药物.老化细胞 14, 644–658 (2015).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
McCurrach M.E.和Lowe S.W。非永生细胞中促凋亡和抗凋亡基因的研究方法.方法细胞生物学。 66, 197–227 (2001). [公共医学][谷歌学者]
比兰A。等。衰老细胞通过细胞间蛋白转移进行通讯.基因发育。 29, 791–802 (2015).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
Jensen K.B.、Driskell R.R.和Watt F.M。用分离的成年小鼠表皮检测干细胞的增殖和分化能力.《国家协议》。 5, 898–911 (2010). [公共医学][谷歌学者]
Debacq-Chainiaux F.、Erusalimsky J.D.、Campisi J.和Toussaint O。检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-betagal）活性的协议，该酶是培养和培养中衰老细胞的生物标记物体内.《国家协议》。 4, 1798–1806 (2009). [公共医学][谷歌学者]

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