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.2015年8月；14(4):644-58.
doi:10.1111/acel.12344。 Epub 2015年4月22日。

衰老细胞的致命弱点：从转录组到衰老药物

易珠 1, 塔马拉·奇科尼亚 1, 塔马尔·皮尔茨哈拉发 1, 亚当·高尔 2, 虎生丁 1, 尼诺·乔尔加泽 1, Allyson K Palmer公司 1, 池野裕二 三 4, 吉恩·哈伯德 三 4, 马克·伦伯格 2, 史蒂文·奥哈拉 1, 尼古拉斯·F·拉鲁索 1, 乔丹·D·米勒 1, 卡罗琳·M·罗斯 1, 格蕾丝·维尔佐萨 1, 内森·勒布拉瑟 1, 乔纳森·德·雷恩 5, 约书亚·N·法尔 1, Sundeep Khosla公司 1, 迈克尔·B·斯托特 1, 萨拉·麦高文（Sara J McGowan） 6, 海克·富尔曼·斯特罗西格 6, 阿迪蒂·尤·古尔卡 6, 赵静（音译） 6, 黛博拉·科朗琪罗 6, 阿凯茨·多罗索罗 6, 袁元玲 6, 阿米拉·巴古西 6, 戴安娜·纳瓦罗 6, 东京三野 6, 保罗·德·罗宾斯 6, 劳拉·尼德恩霍夫 6, 詹姆斯·L·柯克兰 1
附属公司

衰老细胞的致命弱点：从转录组到衰老药物

易珠等。 老化细胞. 2015年8月.

摘要

使用转基因自杀基因杀死衰老细胞可以提高小鼠的健康寿命。使用小分子实现这一目标将对生活质量和与年龄相关的慢性病负担产生巨大影响。在这里，我们描述了一类新药物的鉴定和验证的基本原理，这种药物被称为衰老药物，可以选择性地杀死衰老细胞。通过转录物分析，我们发现衰老细胞中促生存网络的表达增加，这与它们对细胞凋亡的抗性一致。使用siRNA沉默该网络关键节点的表达，包括ephrins（EFNB1或3）、PI3Kδ、p21、BCL-xL或纤溶酶原激活抑制剂-2，杀死衰老细胞，但不杀死增殖或静止的分化细胞。针对这些相同因子的药物选择性地杀死衰老细胞。达沙替尼消除衰老的人类脂肪细胞祖细胞，而槲皮素对衰老的人类内皮细胞和小鼠骨髓基质干细胞更有效。达沙替尼和槲皮素联合使用可有效消除衰老MEF。在体内，该组合降低了按时间顺序衰老、辐射暴露和类进展Ercc1（-/Δ）小鼠的衰老细胞负担。在老年小鼠中，单次给药5天后，心脏功能和颈动脉血管反应性得到改善。在对小鼠的一条腿进行照射后，单次给药可在药物治疗后至少7个月内提高运动能力。定期给药延长了Ercc1（-/∆）小鼠的健康寿命，延缓了与年龄相关的症状和病理学、骨质疏松症和椎间盘蛋白多糖的丢失。这些结果证明了选择性消融衰老细胞的可行性，以及senolytics在缓解虚弱症状和延长健康寿命方面的功效。

关键词：PI3K三角洲；达沙替尼；依赖性受体；肾上腺素；第21页；纤溶酶原激活抑制剂；槲皮素。

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数字

图1
图1
衰老细胞可以通过抑制促生存机制选择性靶向。（A） 对衰老（绿色方块）和非衰老（红色方块）人类腹部皮下前脂肪细胞检测到的特征进行主成分分析，表明衰老和非衰老前脂肪细胞在总体基因表达方面存在重大差异。在RNA分离前25天，暴露于10Gy辐射（与假辐射相比）可诱导衰老。每个方块代表一个受试者（细胞供体）。（B，C）衰老细胞与非衰老细胞中抗凋亡、促生存途径上调。显示了衰老与非衰老前脂肪细胞中与抗凋亡功能、“凋亡负调控”（B）和“抗凋亡”（C）相关的基因集前沿的热图（红色=较高；蓝色=较低）。每列代表一个主题。样本按增殖状态从左到右排序(N个 = 8). 这些行表示单个基因的表达，并根据Student的绝对值从上到下排序t吨衰老细胞与增殖细胞之间的统计计算(即.，从最大到最小显著性，另请参见图S8）。（D–E）通过siRNA靶向生存途径降低辐射诱导衰老的人腹部皮下初级前脂肪细胞（D）和HUVEC（E）的存活率（ATPLite），其程度大于非新生的放射增殖细胞。第0天针对肾上腺素配体B1（EFNB1）、EFNB3、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶δ催化亚基（PI3KCD）、细胞周期素依赖性激酶抑制剂1A（p21）和纤溶酶原激活抑制剂-2（PAI-2）信息转导的siRNA诱导ATPLite活性衰老（实心条）与增殖（开放条）信息显著降低第4天的细胞（100个，用红线表示，是对照，打乱的siRNA）。N个 = 6; *P（P）< 0.05;t吨-测试。（F–G）衰老前脂肪细胞（F）和HUVEC（G）对siRNAs的反应导致存活率降低（结晶紫染色强度）。N个 = 5; *P（P）< 0.05;t吨-测试。（H） 测试EFNB-1、EFNB-3、PI3KCD、p21（CDKN1A）、PAI-1（SERPINE1）、PAE-2（SERPINB2）、BCL-xL和MCL-1之间链路的网络分析。
图2
图2
达沙替尼和槲皮素以衰老细胞为靶点。（A） D在选择性降低衰老前脂肪细胞的活力（ATPLite）方面比HUVECs更有效。将前脂肪细胞和HUVEC暴露于不同浓度的D中3天。红线表示第0天非分裂衰老（设置为100%）和增殖非基因细胞（也设置为100%的）的镀层密度。前脂肪细胞数据是四个不同受试者四个实验的平均值±SEM。HUVEC数据是每个浓度下五个重复的平均值±SEM。（B） Q比前脂肪细胞在选择性降低衰老HUVEC活性（ATPLite）方面更有效。将增殖和衰老的前脂肪细胞和HUVEC暴露于不同浓度的Q中3天。前脂肪细胞数据是四个不同受试者四个实验的平均值±SEM。HUVEC数据是每个浓度下五个重复的平均值±SEM。（C） 结合D和Q选择性降低衰老前脂肪细胞和衰老HUVEC的生存能力。将增殖和衰老的前脂肪细胞和HUVEC暴露在固定浓度的Q和不同浓度的D下3天。诱导衰老前脂肪细胞和HUVEC细胞死亡的最佳Q浓度分别为20和10μ米分别为。（D） D和Q不影响静止脂肪细胞的活性。用D+Q处理非衰老前脂肪细胞（增殖）、由前脂肪细胞制备的非增殖、非基因分化脂肪细胞（分化）以及25天前暴露于10Gy辐射诱导衰老（衰老）的非增殖前脂肪细胞48小时。N个=从不同受试者中分离出6种前脂肪细胞培养物*P（P）< 0.05;方差分析.100%表示每种细胞类型在第0天的ATPLite强度，条形图表示72小时后的ATPLSite强度。72小时后，这些药物导致增殖细胞中的ATPLite低于经载体处理的细胞，但ATPLite强度并未低于第0天的水平。这与抑制增殖一致，不一定是细胞死亡。脂肪细胞ATPLite没有受到药物的显著影响，这与即使是高剂量的D+Q对非增殖分化细胞也没有影响一致。暴露于药物72小时的衰老细胞中的ATPLite低于第0天的平板。由于衰老细胞不增殖，这表明药物降低了衰老细胞的生存能力。（E，F）D和Q引起的衰老细胞凋亡多于非衰老原代人前脂肪细胞（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记[TUNEL]分析）。（E） D（200 nM）加上Q（20μ米)在衰老但不增殖的非新生前脂肪细胞培养中，12小时后导致65%的凋亡细胞（TUNEL分析）。细胞来自三名受试者；四个重复**P（P）< 0.0001;方差分析（F）用DAPI染色原代人前脂肪细胞以显示细胞核，或用TUNEL分析以显示凋亡细胞。25天前用10Gy辐射诱发衰老。将增殖的非基因细胞暴露于D+Q中24小时，将来自相同受试者的衰老细胞暴露于载体或D+Q。条形图显示50μm。（G） 通过Western免疫分析，载体、D、Q或D+Q对非基因前脂肪细胞和HUVEC p21、BCL-xL和PAI-2的影响。（H） PCR检测载体、D、Q或D+Q对前脂肪细胞PAI-2 mRNA的影响。N个 = 3; *P（P）< 0.05;方差分析.
图3
图3
达沙替尼和槲皮素降低小鼠衰老细胞的丰度。（A） D的影响（250 n米)，Q（50μ米)，或D+Q对衰老水平的影响错误代码1-小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）缺陷。在分析SA-βGal之前，细胞接触药物48小时+使用C的单元格12FDG公司。所示数据为三个重复的平均值±SEM***P（P）< 0.005;t吨-测试。（B） D（500 nM）、Q（100μ米)和D+Q对来自前体细胞的衰老骨髓间充质干细胞（BM-MSC）的作用错误代码1−/Δ老鼠。在分析SA-βGal活性之前，衰老MSCs暴露于药物48小时。所示数据为三个重复的平均值±SEM**P（P）< 0.001;方差分析（C–D）与仅用溶媒（V）相比，单剂量老年药物（D+Q）治疗的24个月龄小鼠腹股沟脂肪中的衰老标记物SA-βGal和p16减少。治疗后5天，通过RT-PCR进行细胞SA-βGal活性测定和p16表达。N个 = 14; 指±SEM**P（P）SA-βGal<0.002*P（P）p16小于0.01(t吨-测试）。（E–F）D+Q处理小鼠的肝脏p16较少+细胞比车辆处理的小鼠。（E） p16 mRNA FISH的代表性图像。胆管细胞位于白色虚线之间，白色虚线表示胆管的管腔和外部边界。（F） 荧光强度的半定量分析表明，与载体相比，药物治疗动物的胆管细胞p16减少。N个=每组8只动物*P（P）< 0.05; Mann–Whitney U检验。（G-I）衰老药物降低辐射暴露小鼠股四头肌（G）中p16的表达和腹股沟脂肪（H-I）中细胞SA-βGal的表达。单侧腿部暴露于10 Gy辐射3个月的小鼠之前会出现灰色头发（图5A）和腿部老化细胞积聚。用D+Q（实心棒）或载体（开放棒）治疗小鼠一次。5天后，检测辐射腿的细胞SA-βGal活性和p16 mRNA。N个=8；指±SEM，p16：**P（P）< 0.005; SAβ-Gal：*P（P）<0.02；t吨-测试。
图4
图4
衰老药物对心脏（A–C）和血管舒缩（D–F）功能的影响。D+Q显著改善24月龄小鼠的左心室射血分数（A）。收缩功能的改善并不是由于心脏预负荷的增加（B），而是由于收缩末期尺寸的减少（C；表S3）。D+Q使乙酰胆碱（D）引起的内皮依赖性舒张功能略有改善，但对硝普钠（E）的反应显著改善了血管平滑肌细胞的舒张功能。D+Q没有显著改变对U46619（F）的收缩反应。在面板D–E中，松弛表示为预限制基线值的百分比。因此，对于面板D–F，降低数值表明血管舒缩功能得到改善。N个=每组8只雄性小鼠*P（P）< 0.05; A–C：t吨-测试；D–F：方差分析.
图5
图5
服用老年药物可减轻辐射对跑步机运动耐力的损伤。（A–B）对4个月大的小鼠的一条腿进行10 Gy的辐射。三个月后，受辐射的腿上的毛发变灰（A），受辐射小鼠的跑步机运动能力（B）降低(N个=13）比假辐射小鼠(N个 = 14). **P（P）< 0.002;t吨-测试。（C） 单次服用D+Q五天后，跑步机耐力优于车辆治疗对照组。D+Q对假辐射对照组无影响。(N=6-9个每组动物数）。条形代表平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.001;方差分析; Tukey–Kramer测试。（D） 单次剂量D+Q后7个月，再次检测跑步机耐力。所有小组在跑步机上跑了四次，每次间隔一周。横条代表每组在四次比赛中的平均表现的平均值±SEM。耐力显示为小鼠每次跑步时所有四组的整体表现的函数（表示为%：每组平均焦耳/当天所有组的总焦耳）。*与其他组不同；P（P）< 0.05;方差分析; 邓肯的测试。
图6
图6
D+Q周期性治疗延长了进展期错误代码1−/Δ老鼠。每周用D+Q或载体治疗动物。与衰老相关的症状每两周测量一次。动物在10-12周后被安乐死。N个=每组7-8只小鼠。（A） 老化评分直方图，反映了每个治疗组最大症状评分的平均百分比（每个时间点测量的所有症状的外观和严重程度的组合），反映了健康跨度（Tilstra等., 2012). *P（P）<0.05和**P（P）<0.01学生t吨-测试。（B） 在一对性别匹配的兄弟姐妹中测量的所有症状开始时的年龄代表图错误代码1−/Δ老鼠。每种颜色代表不同的症状。条形图的高度表示特定年龄段症状的严重程度。横杆的合成高度表示动物的整体健康状况（横杆越低越好）。用D+Q治疗的小鼠症状出现延迟(例如.，共济失调，橙色）和症状表达减弱(例如.，肌张力障碍，浅蓝色）。额外的成对分析如图S11所示。（C） 的代表性图像错误代码1−/Δ仅限D+Q治疗组或载体的小鼠。脚部出现脾脏是肌张力障碍和共济失调的征兆。用D+Q治疗的动物改善了运动协调。图示动物步态和身体状况的其他图像如图S10所示。（D） 16周龄儿童腰椎定量CT（QCT）衍生骨参数错误代码1−/Δ用任一种载体治疗的小鼠(N个=7）或药物(N个 = 8). BMC=骨矿物质含量；vBMD=体积骨密度*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001. （E） 椎间盘髓核（NP）的糖胺聚糖（GAG）含量。NP的GAG含量随着哺乳动物的衰老而下降，导致腰痛和身高降低。D+Q显著提高了错误代码1−/Δ小鼠与只接受载具的动物进行比较*P（P）<0.05，学生的t吨-测试。（F） 组织病理学错误代码1−/Δ接受D+Q治疗的小鼠肝、肾和股骨骨髓苏木精和伊红染色切片对其典型的年龄相关病理学严重程度进行评分错误代码1−/Δ老鼠。与年龄相关的病理学评分从0到4。病理学的样本图像如图S13所示。绘制的是所有兄弟组的单个动物的总病理学评分百分比（最大评分为12:3个组织x严重程度范围0-4）。每簇酒吧都是一个兄弟团体。白色条表示使用载具治疗的动物。黑色条表示接受D+Q治疗的同胞。√表示在死亡前衰老表型中差异最大的同胞组，这表明脆弱性的死亡前和死亡后分析之间存在强烈的相关性。
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