自然。作者手稿；PMC 2016年8月3日发布。
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尼姆斯：NIHMS747009
自然发生的p16墨水4a-阳性细胞缩短健康寿命
，1 ，2 ，1 ，1 ，2 ，1 ，1 ，1 ，三 ，4 ，4 ，三和1,2
达伦·贝克
1美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院儿科和青少年医学系，邮编55905
Bennett G.Childs公司
2美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编55905
马特杰·杜里克
1美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院儿科和青少年医学系，邮编55905
梅林德·维杰斯
1美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院儿科和青少年医学系，邮编55905
辛西娅·西本
2美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编55905
建中
1美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院儿科和青少年医学系，邮编55905
雷切尔·索特内斯
1美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院儿科和青少年医学系，邮编55905
卡西克·杰加纳坦
1美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院儿科和青少年医学系，邮编55905
格雷斯·维尔索萨
三美国明尼苏达州罗切斯特梅奥临床医学院心血管外科，邮编55905
阿卜杜勒·穆罕默德·佩泽什基
4美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院免疫学系55905
Khashayarsha Khazaie公司
4美国明尼苏达州罗切斯特梅奥临床医学院免疫学系，邮编55905
乔丹·D·米勒
三美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院心血管外科55905
Jan M.van Deursen先生
1美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院儿科和青少年医学系，邮编55905
2美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系55905
1美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院儿科和青少年医学系，邮编55905
2美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编55905
三美国明尼苏达州罗切斯特梅奥临床医学院心血管外科，邮编55905
4美国明尼苏达州罗切斯特梅奥临床医学院免疫学系，邮编55905
- 补充资料
1
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2
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摘要
细胞衰老，一种应激诱导的不可逆生长停滞，通常以p16为特征墨水4a表达和独特的分泌表型，阻止癌前细胞的增殖，并在胚胎发生和伤口愈合过程中的组织重塑中发挥有益作用。随着时间的推移，衰老细胞在各种组织和器官中积累，并被推测在衰老中起作用。为了探索自然衰老细胞的生理相关性和后果，我们使用了一个先前建立的转基因，油墨-附件，诱导p16细胞凋亡墨水4a-从一岁开始每周两次注射AP20187，表达野生型小鼠的细胞。在这里，我们表明，与单独使用载体相比，AP20187治疗延长了两种不同遗传背景的雄性和雌性小鼠的中位寿命。p16的间隙墨水4a-阳性细胞延迟了肿瘤的发生，减轻了一些器官的年龄相关性退化，而没有明显的副作用，包括肾脏、心脏和脂肪，这些器官的清除保留了肾小球的功能，即心脏保护性钾列车自动防护系统通道和脂肪细胞。因此，p16墨水4a-成年期积累的阳性细胞会对寿命产生负面影响，并促进多个器官的年龄依赖性变化，治疗性去除这些阳性细胞可能是延长健康寿命的一种有吸引力的方法。
介绍
细胞衰老是一种公认的癌症防御机制，也被假设在衰老和年龄相关疾病中发挥作用，可能通过干细胞和祖细胞的耗竭以及衰老相关分泌表型（SASP）的不利作用，由多种促炎细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶和生长因子组成1–三与这一观点一致的是，对BubR1进展型小鼠中衰老细胞积累的干扰可以延缓这些动物产生的几种与衰老相关的疾病4，5然而，由于进行性综合征不能忠实地模拟复杂的衰老退行性变化，这些发现的相关性尚不清楚。此外，最近的研究表明，衰老细胞在损伤修复和组织重塑中具有有益的作用6–10他们质疑了衰老只是年龄依赖性疾病的驱动因素的简单观点，提出了这样一种担忧，即衰老细胞清除可能会去除有害细胞之外的有用细胞。在这里，我们使用油墨-附件(此后AT-TAC）4，一种转基因小鼠，其在最小第16页墨水4a启动子片段在衰老细胞中的转录活性4，11早些时候我们已经表明在BubR1孕激素小鼠中，附件烧蚀第16页墨水4a-AP20187（AP）是一种激活FKBP-fused Casp8的二聚体，给药后阳性衰老细胞4。我们的第一个目标是验证附件自然发生的第16页墨水4a-阳性衰老细胞。
附件清除衰老脂肪祖细胞
我们的初始验证主要针对脂肪。我们收集了GFP+和GFP−12个月大的腹股沟白色脂肪组织（iWAT）细胞群附件FACS小鼠(). GFP公司+细胞表达更高水平的第16页墨水4a和FKBP-Casp8型比GFP−细胞以及广泛的衰老标记(). GFP公司+细胞，但不是GFP−细胞衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal；). 此外，来自老年人而非年轻人的完整iWAT附件小鼠具有SA-β-Gal活性，但低于BubR1进展型小鼠的iWAT，差异也反映在第16页墨水4a，FKBP-Casp8型、和GFP公司转录水平().
清除衰老脂肪前体细胞减轻年龄相关性脂肪营养不良一，所示小鼠iWAT单细胞悬浮液的FACS图谱。b条、GFP+和GFP−12个月龄iWAT的细胞群附件鼠标（请参见一用于分类支架）通过qRT-PCR分析(n个＝6只小鼠）。c（c）GFP中的SA-β-Gal活性+和GFP−iWAT细胞(n个=3只小鼠）。日期：，绿色荧光粉+所示iWAT细胞群中的细胞（“Rest”表示iWAT血管基质部分减去白细胞、内皮细胞和祖细胞）。e–i，C57BL/6的脂肪相关分析附件给药前（12 m）或给药6个月后（18 m–AP）或AP（18 m+AP）的小鼠。e（电子）iWAT（IAT）和eWAT（附睾）中的SA-β-Gal活性。（f），电子显微镜显示18个月龄的车用C57BL/6血管周围X-Gal阳性细胞附件男性。A、 脂肪细胞；C、 毛细管。箭头标记内皮细胞。克，含有X-Gal晶体的iWAT细胞的定量(n个=每次治疗4只小鼠）。小时，脂肪质量测量。我iWAT和eWAT仓库重量。j个iWAT中的平均脂肪细胞直径。k个，iWAT中脂肪生成标记物的表达(n个=每组4只小鼠）。比例尺：10μm inc（c）; 0.5厘米英寸e（电子）; 主面板中2μm（f）插图中为200 nm。中的图例i–k如中所示小时误差条表示标准误差b条通过使用理论平均值1的一个样本t检验和所有其他面板的非配对双尾t检验确定。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
18个月大的iWAT附件从12个月起，用AP进行双周治疗的小鼠的GFP减少了8倍+尽管脂肪祖细胞总数保持不变，但脂肪祖细胞比车辆注射对照组多(和). SA-β-Gal染色和衰老标记的qRT-PCR分析证实第16页墨水4a-iWAT中的阳性衰老细胞在12到18个月之间增加，AP消除了大部分这些细胞(和). 与祖细胞衰老一致，SA-β-Gal染色iWAT的透射电镜（TEM）显示，X-Gal晶体存在于血管周围小细胞中，而不是内皮细胞、白细胞或脂肪细胞中(). 在AP处理小鼠和对照小鼠的iWAT细胞总数中，分别有0.2%和1.6%发现X-Gal晶体().
的间隙第16页墨水4a-阳性细胞可防止12个月至18个月期间出现的脂肪量损失(和). 年龄依赖性脂肪组织功能障碍的特征是脂肪生成减少和脂肪细胞萎缩12与此相一致的是，脂肪细胞在12至18个月大时减小()脂肪生成的两个关键转录调控因子PPARγ和C/EBPα的转录水平(). AP治疗附件小鼠阻止了这些减少。总的来说，这些数据表明衰老有助于年龄依赖性脂肪组织的改变。
幼体脂肪组织附件小鼠缺乏SA-β-Gal活性，但含有p16墨水4a(). 此p16墨水4aAP治疗后血池并没有下降。早期传代获得了类似的结果附件MEF公司()，表示基线第16页墨水4a非基因细胞中的启动子活性不足以支持FKBP-Casp8介导的凋亡。此外，附件缺少第16页墨水4a稳定表达内源性基因的癌前细胞复制中转基因诱导所需的启动子元件第16页墨水4a由于Rb失活，AP无法杀死这些细胞().附件在外周血T淋巴细胞中也未被诱导，而T淋巴细胞与内源性第16页墨水4a随着年龄的增长，没有多种衰老标记的伴随表达2，13()这进一步表明转基因诱导对衰老具有很强的选择性。然而，这些有限的分析当然不排除其他第16页墨水4a-阳性非基因细胞参与附件暴露于AP后死亡(补充文本).
清关人附件是局部的和组织选择性的
为了扩展我们对附件，我们分析了第16页墨水4a，FKBP-Casp8，绿色荧光蛋白以及在2个月龄、12个月龄和18个月龄未经处理的广泛组织中的一组衰老标记附件小鼠，包括骨骼肌、眼睛、肾脏、肺、心脏、肝脏、结肠和脾脏。附件将用AP治疗12至18个月的小鼠包括在内，以评估衰老细胞清除率。第16页墨水4a在12至18个月期间，所有受检组织中的表达均显著增加，这与诱导FKBP卡套8，GFP公司和多种衰老标记(). AP处理使除结肠和肝脏外的所有受检组织中这些转录物的高表达不同程度减弱，表明附件系统消除第16页墨水4a-部分和组织/器官选择性方式的阳性衰老细胞。年龄依赖性增长的减弱伊尔6，Il1α、和肿瘤坏死因子αAP治疗后脂肪、骨骼肌和肾脏的表达()表明第16页墨水4a-阳性细胞清除改善这些组织的炎症。
第16页墨水4a-阳性细胞缩短寿命和健康寿命
检查第16页墨水4a-阳性细胞清除率对健康和寿命的影响，我们依次建立了两个队列附件转基因小鼠(). 最初的队列是以C57BL/6-129Sv-FVB混合遗传背景喂养含有9%脂肪的饮食。我们注意到，与寿命研究中通常使用的5%脂肪的饮食相比，这种饮食缩短了寿命(和补充文本). 后一组为同类C57BL/6背景，喂食标准的5%脂肪饮食。12个月大时第16页墨水4a-阳性细胞开始在几个组织中积聚(和)，小鼠每周注射两次AP或载体，直到它们奄奄一息或自然死亡。从长寿组中分离出来的小鼠在18个月龄时进行了一系列对年龄敏感的结果检测，每个组中死亡的小鼠相对较少。两性合并数据显示，混合和C57BL/6 AP处理动物的中位寿命分别增加了27%和24%。无论遗传背景如何，接受过抗药性药物治疗的队列中每种性别的平均寿命也显著延长，增幅从17%到35%不等().
衰老细胞清除延长寿命一，在混合和C57BL/6小鼠队列中清除衰老细胞的研究设计。健康跨度分析是在18个月龄时进行的，在这个年龄段，使用运载工具（Veh）或AP-治疗的小鼠死亡相对较少，并且不太可能因选择长寿动物而产生偏见。b条，c（c）、车辆生存曲线-（-AP）和经AP-处理的（+AP）混合(b条)和C57BL/6小鼠(c（c）). 显示了中位生存期（以天为单位）和中位生存率增加的百分比。我们注意到，我们的载体治疗组的中位寿命与给予AP的野生型小鼠的中位寿命相似(c（c）). 使用对数秩检验确定统计显著性。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
最大使用寿命14混合AP治疗的雄性和雌性联合用药显著增加(第页=0.0295），但不适用于雌性和雄性。C57BL/6 AP处理动物的最大寿命没有延长，无论是联合还是单独处理。重要的是，AP治疗缺乏附件转基因并没有提高寿命(). 我们注意到，在不同的实验室中，经车辆处理的C57BL/6雄性（而非雌性）的平均寿命低于未经处理的该菌株雄性的正常寿命范围()15–28，表明重复的车辆注射压力可能对C57BL/6男性寿命产生了负面影响(补充文本).
在这两个队列中，尽管肿瘤潜伏期增加，但AP治疗对尸检时肉眼可见肿瘤的发生率或波谱没有影响(和). 无肿瘤死亡的AP治疗小鼠的寿命延长中位数为24%至42%()这表明寿命的延长不仅仅是由于肿瘤保护作用。在18个月大的时候，经AP处理的小鼠与被车辆注射的同窝小鼠明显没有区别，但通常在22个月大时外观更健康(). 在C57BL/6背景下，AP治疗延缓了男性和女性白内障的形成(). 尽管在18个月龄时没有明显差异，但AP-治疗阻止了自发活动和探索行为的年龄依赖性降低（通过野外测试测量）()这与性别和遗传背景无关。
清除衰老细胞延长健康寿命一，生存曲线AT-TAC公司死于癌症的小鼠（死亡时有明显肿瘤的小鼠；包括有淋巴瘤、肉瘤和癌的小鼠，无肿瘤的小鼠被审查）。显示了中位生存率和百分比增加。b条，具有和不具有衰老细胞清除功能的老龄小鼠的代表性图像。c（c）、自发运动和探索行为附件通过野外试验对小鼠进行分析。误差条表明s.e.m.对数秩检验用于确定一; 未配对双尾t检验用于c（c）.*中，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
对这些小鼠的进一步测试表明，在运动协调和平衡、记忆力、运动能力和肌肉力量方面没有差异()，表明6个月第16页墨水4a-阳性细胞清除率不影响这些对年龄敏感的治疗。同样，与年龄相关的循环造血谱变化，包括调节性T细胞水平，也没有受到影响(). 18个月时，AP和车用C57BL/6的空腹血糖水平、糖耐量、胰岛素敏感性和循环IGF1水平无显著差异附件雌性，脂肪、肾脏和肌肉中IGF1和胰岛素受体下游的信号传导，我们在这三个组织中观察到第16页墨水4a-阳性细胞().
肾上皮细胞衰老与肾小球硬化
为了进一步调查第16页墨水4a-生理功能随年龄变化的阳性细胞29，我们重点关注肾脏和心脏，这两个重要器官是我们观察到的附件-中介清除。肾老化的特点是形成硬化性肾小球，影响肾小球滤过率，损害肾功能，导致血尿素氮（BUN）水平升高30，31事实上，在12至18个月期间，经车辆治疗的患者肾小球硬化症显著增加附件老鼠。AP治疗显著降低肾小球硬化，与性别和遗传背景无关()与BUN的年龄相关性增加减弱相关()，表示肾功能保留。肾切片的SA-β-Gal染色证实，AP介导的衰老细胞处理是非常有效的(). 通过TEM，我们在18个月大的治疗组和未治疗组小鼠肾脏细胞中分别观察到0.3%和1.2%的X-Gal晶体(). 令人惊讶的是，SA-β-Gal阳性细胞并不位于肾小球中，而是位于近端小管中()提出了衰老的肾小管刷状缘上皮细胞如何促进肾小球硬化的问题。
衰老细胞导致肾小球硬化、肾功能障碍和肾RAAS过度活动一，所示小鼠的硬化（左）和正常（右）肾小球图像。b条硬化性肾小球的量化。c（c），血尿素氮水平的测量。d日、SA-β-Gal染色肾切片。e（电子）电子显微照片显示，含有X-Gal晶体的肾上皮细胞带有刷状边界膜（箭头）。插图显示X-Gal晶体特写。（f）肾切片中含有X-Gal晶体的细胞百分比(n个=每个治疗组5个TEM网格）。克，肾脏表达Agtr1a公司qRT-PCR分析(n个=每组4只小鼠）。小时，检测Agtr1a的肾裂解物的蛋白质印迹(n个=每个治疗组3只小鼠）。Ponceau S染色作为负荷控制。我，肾切片Agtr1a的免疫染色。黄色圆圈表示肾小球。比例尺：50μm英寸一; 250μm英寸d日; 5μm（主面板）和200 nm（插入）英寸e；100μm（顶部）和50μm（底部）英寸我中的图例c（c），（f）和克如中所示b条误差条表明s.e.m.统计显著性是通过非配对双尾t检验确定的b、 c（c），（f）、和克. *,P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001. 有关凝胶源数据，请参见补充图1.所有老鼠都在d–i日为C57BL/6附件。+AP、AP处理小鼠、–AP、车辆处理小鼠。
血管紧张素受体阻滞剂可在血压正常的情况下减轻与年龄相关的肾小球硬化，这导致了局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的过度激活导致硬化性肾小球的形成31，32与此一致的是，该系统的关键组成部分血管紧张素受体1a（Agtr1a）的肾脏转录水平在12到18个月之间增加(). 相反，在经AP处理的小鼠中没有观察到这种增加。Western blotting证实经AP处理的肾脏样本中Agtr1a含量较低(). 肾小管和肾小球都有助于这种下降，如Agtr1a肾切片的免疫标记所示(). 这些数据表明，衰老的肾上皮细胞可能产生SASP成分，从而过度激活肾脏中的局部RAAS。
第16页墨水4a-阳性细胞导致心脏老化
12个月大的小鼠心脏在心房和心室表面显示SA-β-Gal活性()，在经车用药物治疗但未经AP治疗的小鼠中，随着年龄增长而增加。TEM显示心包纤毛上皮细胞和成纤维细胞含有X-Gal晶体(). 我们还观察到经载药处理的动物主动脉根部壁中的SA-β-Gal阳性平滑肌细胞(和). 18个月时，接受车辆和AP治疗附件超声心动图分析显示，小鼠的心率、左心室重量、厚度和直径、射血分数和缩短分数与12月龄小鼠无显著差异(). 在组织学水平上，心脏衰老的特征是由于替换凋亡或坏死心肌细胞的能力下降而导致心室心肌细胞损失，从而导致剩余心肌细胞肥大33心脏切片的形态分析表明，溶媒和AP治疗动物的心室壁厚度相同，无论性别如何(). 然而，AP处理小鼠的心室心肌细胞要小得多()这意味着他们的心肌细胞比车辆处理的小鼠多。综合起来，这些数据表明第16页墨水4a-阳性细胞是这一年龄相关心脏表型的关键驱动因素。
衰老细胞促进年龄相关性心肌细胞肥大和心脏应激耐受能力丧失一，SA-β-Gal染色的心脏。插图显示了横切面上的主动脉根部（ar）（箭头表示主动脉根部壁）或心室（v）和动脉（a）装箱区域的闭合。b条心包X-Gal阳性细胞的电子显微镜照片（红色星号标记纤毛）。插图显示X-Gal晶体的特写。c（c）、用X-Gal晶体定量内脏心梗细胞(n个=每次治疗4只小鼠）。d日，测量左心室壁厚度(n个=每组4只小鼠）。e（电子），代表性心肌细胞横截面图像(n个=每组4只小鼠）。（f），量化(e（电子）)克，分析苏尔2aqRT-PCR在心脏中的表达(n个=每组4只小鼠）。小时，通过测量注射致死剂量异丙肾上腺素后的死亡时间来确定心脏应激耐受性。我，异丙肾上腺素亚致死剂量（10 mg/kg）引起的左心室（LV）质量变化−1)在5天内给药10次后。比例尺：1毫米英寸一; 2μm（主面板）和200 nm（插入）英寸b条中的图例f–h如中所示d日误差条表示s.e.m.统计显著性由非配对双尾t检验确定c、 d日和f–i型. *,P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001. 所有老鼠，除了小时，为C57BL/6附件。+AP，AP处理的小鼠，–AP，载体处理的小鼠。
心脏老化还表现为应激耐受性降低，这归因于ATP-敏感钾（K列车自动防护系统)心肌细胞肌膜中的通道由于Sur2a表达的年龄相关性减少，Sur2a是K的关键调节亚单位列车自动防护系统通道34.心脏苏尔2a在载体处理的小鼠中，表达在12至18个月之间确实下降()，但在经AP处理的小鼠中未观察到这种下降，这表明心脏应激耐受性得以保持。为了验证这一点，我们测量了注射580毫克/公斤后致心律失常的死亡时间−1β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素35与年龄相关的心脏应激抵抗力下降相一致，18个月龄的车用小鼠比12个月龄小鼠死亡更快(). 相反，经AP处理的小鼠的死亡时间并没有加快。在第二个更具生理应激性的测试中，我们通过给药10毫克/公斤体重，在6天的时间内诱发心脏应激前后，对心室重量进行超声心动图测量−1异丙肾上腺素一天两次。在18个月大的车用治疗小鼠中，心脏重量显著增加，而经AP治疗的小鼠能够应对施加的压力，而没有这种适应性反应，与年轻小鼠类似().
我们还检查了AP-治疗是否会导致任何偏离目标或有害影响。野生型小鼠缺乏附件接受AP治疗后，健康寿命没有改善(). 衰老细胞仅在伤口修复期间发挥有益作用6–8，18个月大的AP处理附件在愈合期间暂停给药时，小鼠修复了皮肤伤口(). 当在伤口闭合期间使用AP时，愈合延迟，动力学与4个月或18个月大的婴儿相似附件未经AP治疗的小鼠表明，急性衰老机制随着年龄的增长而保持不变，不受衰老细胞组成清除的影响三此外，尽管衰老细胞在组织修复期间起到限制纤维化的作用，但18个月大的AP处理小鼠的皮肤和其他组织中没有显示出纤维化增加的迹象().
讨论
在这里我们消除了第16页墨水4a-非转基因小鼠的阳性细胞附件开始研究衰老细胞如何影响健康和寿命。我们观察到经AP治疗的患者的平均寿命延长附件小鼠有两种不同的遗传背景和饮食，表明与年龄相关的第16页墨水4a-阳性细胞对寿命有负面影响。这将有助于进一步优化衰老细胞去除方案和方法，因为重复的载体注射应激似乎对雄性C57BL/6小鼠的寿命产生了负面影响，并且因为清除是部分的，并且一些关键组织（包括肝脏和结肠）对清除是不敏感的。这对于进一步研究最大寿命尤其重要，延长最大寿命被认为是更普遍的“抗衰老”效应的反映29(补充文本).
撇开这些方法学上的警告不谈，我们发现第16页墨水4a-无论遗传背景和饮食如何，中年时的阳性细胞都会延迟肿瘤疾病的进展。清除对死后肿瘤的频谱或发病率没有影响，这与衰老细胞有助于创造组织微环境以促进肿瘤进展的假设一致1此外，多种年龄相关的变化29包括脂肪、眼睛、心脏、肾脏的变化，以及自发活动和探索行为的随年龄增长而下降，在第16页墨水4a-阳性细胞清除始于中年。补充机制研究表明第16页墨水4a-脂肪、肾脏和心脏中的阳性细胞通过不同的机制发挥作用，分别涉及祖细胞功能障碍、RAAS过度激活和Sur2a下调，尽管鉴于此处应用的清除方法的全局性，不能排除系统性影响。
因此，我们的数据最适合以下模型：第16页墨水4a-阳性细胞通过促进肿瘤进展和年龄依赖性变化缩短健康寿命，这些变化在功能上损害某些组织和器官，包括肾脏和心脏等重要器官。这一点，以及消除第16页墨水4a-阳性细胞与任何明显的有害影响无关，这增加了这种方法可能有助于治疗与年龄相关的功能衰退、涉及衰老细胞的与年龄相关疾病或产生衰老细胞的治疗的副作用36.
方法
小鼠菌株和药物治疗
所有研究均使用附件小鼠在转基因品系3上进行实验，该品系包含13个插入到单个位点的转基因拷贝（数据可根据要求提供）。生成和表征附件转基因品系先前已详细描述4.两组附件连续建立小鼠模型并进行分析。第一组包括129Sv（40%±5%）×C57BL/6J（35%±5%）x FVB（20%±5%）混合遗传背景的小鼠，由哈伦实验室使用已建立的SNP小组确定(补充表1). 在整个研究期间，这些小鼠被随意喂食辐照颗粒饲养员食物：LabDiet产品#5058，脂肪含量为9%（21.635%的热量来自脂肪）。从12个月大开始，随机将该队列中的小鼠分为两组，每周注射AP20187（B/B同聚物，克隆泰克，加州山景城，美国）或载剂两次。在12至18个月期间，剂量为0.2μg AP20817/g体重（与之前用于BubR1进展型小鼠衰老细胞清除的剂量相同；参见参考文献4)和2.0μg AP20187/g体重。第二个队列是在完成附件3号线回交到纯C57BL/6J遗传背景上（杰克逊实验室股票编号000664）。C57BL/6的详细育种信息附件队列在中提供补充表2在整个研究期间，同类附件转基因小鼠可以随意食用标准辐照颗粒食物：含有5%脂肪含量（13.205%脂肪热量）的5053号LabDiet产品。与混合队列相比，C57BL/6J队列中的小鼠数量有所增加，以便在18个月大时进行更全面的健康跨度分析。C57BL/6J队列被随机分配接受2.0μg AP20187/g体重或从12个月到生命结束的溶媒治疗。C57BL/6J非转基因小鼠附件转基因杂交用于建立对照队列，以确认AP20187在缺乏附件转基因。丁腈橡胶R1高/高;附件本研究中使用的小鼠是按照前面描述的方法制造的4在整个研究期间，动物被安置在无致病屏障的环境中，并保持12小时的光暗循环。具体而言，将小鼠5只/笼安置在静态高压灭菌HEPA通风微隔离器笼中，笼长446 cm2（27×16.5×15.5 cm），仅在二级生物安全柜内打开。限制进入房间需要钥匙卡才能打开门。进入隔离设施需要穿戴高压灭菌服、一次性手套、帽子和鞋套。人员在进入屏障之前，不得进入任何其他啮齿动物设施。通过接触哨兵（每个啮齿动物架一个笼子）监测该设施中的鼠群，每季度评估一次是否存在以下病原体：仙台病毒、小鼠肺炎病毒（PVM）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠微小病毒（MVM）、泰勒鼠脑脊髓炎病毒（TMEV株GDVII）、呼肠孤病毒、，轮状病毒（EDIM）、小鼠细小病毒（MPV株1和2）、小鼠诺如病毒（MNV）、，肺支原体，四翅无丝酵母和Syphacia公司此外，每年对以下几种病毒进行筛选（且不含）：淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）、鼠痘病毒（mousefox）、K病毒、多瘤病毒、鼠腺病毒（MAV 1型和2型）、汉坦病毒、展望山病毒（PHV）、鼠巨细胞病毒（MCMV）和乳酸脱氢酶失活病毒（LDEV）楔状脑囊炎、纤毛相关呼吸杆菌（CARB）、小鼠胸腺病毒（MTV、MTLV）、，梭状杆菌，肌瘤菌spp和肌球蛋白类spp.Autoclaved Enrich-o’Cobs（美国俄亥俄州毛米安德森公司）用作床上用品。每周更换笼子和床上用品。老鼠可以随意使用紫外线消毒过的市政水。室温保持在21°C至23°C之间。耳朵标签（#1005-1，National Band and Tag Co.，Newport，KY，USA）在基因分型时应用于幼崽，以进行鉴定。所有动物程序均由梅奥诊所动物护理和使用机构委员会批准。
统计分析
Prism软件用于统计分析和生成存活率、白内障和肿瘤潜伏期曲线。双尾未配对t吨除非另有说明，否则测试用于两两显著性。生存率、白内障和肿瘤潜伏期曲线采用对数秩检验。为了进行最大寿命延长分析，使用了双侧Wang碰撞试验14为了保持这些比较的一致性，以下表示所有数字的重要性：*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001. 我们注意到没有使用功率计算。样本大小基于之前公布的实验，其中观察到了差异。没有排除任何样本。在实验和结果评估期间，研究人员对分配是盲目的，除了极少数不可能盲目的情况。
单细胞制剂和流式细胞术
为了确定脂肪中积累的衰老细胞的细胞类型来源，我们从iWAT中制备了单个细胞，通过离心收集基质血管部分，并用特定的细胞表面标记物标记所得细胞，以收集CD45+如前所述，通过FACS检测内皮细胞和祖细胞（脂肪细胞干细胞+前脂肪细胞）4，35，37为了量化祖细胞，我们将从基质血管部分恢复的祖细胞数量除以基质血管部分中的细胞总数。伤口单细胞制剂的制备方法类似。GFP比例+如前所述，使用流式细胞术评估每个群体中的细胞4.
年龄相关表型分析
按照描述每两周进行一次白内障检查5iWAT细胞直径、脂肪库重量、皮肤厚度和骨骼肌直径测量如前所述4.在50 cm×50 cm的盒子中进行开放式现场测试，并使用TopScan软件（美国弗吉尼亚州雷斯顿市CleverSys Inc.）进行分析。按照描述进行硬化性肾小球和BUN评估38为了确定心肌细胞的横截面积，使用试剂盒（Poly Scientific R&D，k098）用周期性酸-Schiff对间隔400 um的三个中室矢状截面进行染色。使用Image J软件测量每节左心室游离壁中至少150个心肌细胞。如前所述，进行了致死性异丙肾上腺素挑战38使用Vevo2100成像系统（VisualSonics Inc.，加拿大多伦多）和30 mHz换能器通过超声心动图测定心功能参数。用异氟醚（0.8–1.5%）轻度麻醉小鼠，对心率影响最小。对乳头肌水平的心脏胸骨旁短轴进行了多个m型记录，并随后进行了分析。对于非致死性异丙肾上腺素激发，在基线检查时（第0天）对小鼠进行分析，然后连续五天给予10毫克/千克的治疗−1如前所述，每天两次39。然后在第6天评估小鼠左心室重量的变化。对于心脏结构的纵向测量，在清醒的动物中采集记录。每个动物在每个时间点至少有三个不同的记录被分析。Rotarod评估与之前发布的一样40锻炼能力如前所述4.按照说明进行了新的物体识别试验41.握力按先前发布的方法确定42。通过使用Hemavet 950（Drew Scientific Inc.，Miami Lakes，FL，USA）分析EDTA处理的全血来评估大体血液学。基于FACS的外周血白细胞群分析如前所述43.CD3+根据制造商说明，从外周血收集T淋巴细胞（使用从Miltenyi Biotec购买的CD3 MicroBeads和MACS柱进行分离）。通过在腹腔注射葡萄糖（1.0 g/kg）之前和之后的时间点测量血糖水平来评估隔夜禁食小鼠的葡萄糖耐受性−1). 在禁食4小时后，通过测量腹腔内注射胰岛素（0.6 mU.g）前后的血糖水平来测量胰岛素敏感性−1). 根据制造商的说明（研发系统，目录#MG100），通过ELISA测定血清IGF1浓度。如前所述进行伤口愈合评估44如前所述，对福尔马林固定的石蜡包埋组织样品进行PTAH染色35.
定量实时PCR
小鼠不同组织和CD3的RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR分析+从外周血中采集的T淋巴细胞按规定进行检测5根据制造商的说明（Qiagen RNeasy迷你试剂盒）从细胞系中提取RNA。引物序列FKBP-Casp8型，EGFP公司，第16页墨水4a，第19页阿尔夫，第21页，伊尔-6，排1，Igfbp2和百万像素13与之前发布的一样4此外，还使用了以下引物：百万3正向5′-CTCGATGT-TGGTGGCTTCA-3′，反向5′-TCCTGTAGGTGATGTGGGATTTC-3′；Pparg公司正向5′-TCTTCCATCACGGAGGTC-3′，反向5′-GATGCACTGCCTATGAGC-AC-3′；Cebpa公司正向5′-TTGTTGGCTTATCTCGGC-3′，反向5′-CAAGAAG-TCGGTGGACAAG-3′；Il1α正向5′-TCAACAACTATATATATATATCAGATGT GG-3′，反向5′-CGAGTAGCATACATCATTATATACTTAC-3′；Tnfα正向5′-AGGTCTGTGGCACATAACT-3′，反向5′-CAGCCTCTTCTCATTCGC-3′；Agtr1a公司正向5′-AAGGGCCATTTTGCTTT-TCT-3′，反向5′-AACTCCACAG-CAACCCCCAA-3′；和Abcc9（苏尔2a）正向5′-CAATG-GAGGCTGTCAGAACA-3′，反向5′-GGAGCTGACAGAACACA-3′。免疫球蛋白5正向5′-ATACACCAGAACGCCAGCT-3′，反向5′-ACCTGGGCTATGCATG-3′。
SA-β-Gal染色、电子显微镜和X射线元素分析
对于肾脏冷冻切片上的SA-β-Gal染色，将组织包埋在OCT中，以10μm厚切片，并进行空气干燥。在PBS中再水化后，使用细胞信号试剂盒（#9860）进行染色，固定12分钟，然后在37°C的染色溶液中培养12小时。使用试剂盒（细胞信号试剂）对脂肪、肾脏和心脏进行全量SA-β-Gal染色，固定20分钟，然后将样品浸泡在37°C的染色溶液中12小时（iWAT和eWAT）或48小时（心脏和肾脏）。如前所述，通过透射电子显微镜检测X-Gal晶体45具体而言，将含X-Gal的整体坐垫固定在特朗普的固定剂中，在4°C下固定12小时，并对OsO进行常规处理4/铅染色。在80 kV加速电压的Jeol 1400+电子显微镜上采集图像并进行量化。X-Gal晶体的真实性通过X射线元素分析得到证实，而晶体形成的特异性则通过未染色SA-β-Gal的脂肪和心脏组织进行验证。为了测量AP或载药小鼠肾脏切片中X-Gal结晶细胞的百分比，我们筛选了5个网格（>1500个细胞/网格）在3000倍放大率下，每个治疗组的细胞X-gal阳性细胞。计数含有一个或多个晶体的细胞和细胞总数。iWAT和内脏心包的评估类似，含有一个或多个晶体的细胞被认为是X-Gal阳性。对于iWAT，我们仅在基质血管细胞中观察到晶体，其形态和血管周围位置与脂肪细胞祖细胞一致，因此表达了总细胞的X-Gal部分。>iWAT对每只动物的500个总脂肪细胞进行了评分（n=4只/组）。通过从五个1500×场的细胞数推断出细胞总数。由于解剖和处理，大多数样本的浆液性心包丢失，因此仅内脏心包通过TEM进行评分。只有纤毛上皮细胞SA-β-Gal染色阳性，因此我们将该组织的X-Gal阳性表达作为该细胞类型的百分比。对每只动物一个TEM网格上的整个可见心包进行评分，每组4只动物。用于GFP中SA-β-Gal阳性细胞的定量+和GFP−从iWAT收集的细胞组分中，每个组分对100个细胞进行评分（n=3只动物）。
组织免疫荧光染色和western印迹
石蜡包埋的肾组织切片（5μm）再水化（2×10分钟二甲苯；2×5分钟100%EtOH；1×5分钟95%EtOH；1×5分钟70%EtOH），在来自灰色链霉菌（Sigma，P6911；0.75 mg/ml，在Tris缓冲液中，0.05 M，pH 7.6）在37°C下保存1小时以获取抗原，用啮齿动物阻断剂M（BioCare Medical）封闭30分钟，并用兔抗Agtr1a抗体（Novus Bio，NBP1-77078；1:250）在抗体稀释液（Dako）中在4°C下培养12小时。根据标准方法对组织裂解物进行蛋白质印迹，将硝酸纤维素膜与以下抗体在4°C下孵育过夜：Agtr1a（如上所述；1:750）、S6K（细胞信号传导，#2708；1:1000）、磷酸-S6K（细胞信号传导，#9234；1:1000）、AKT（细胞信号传导，#9272；1:1000）和磷酸-AKT第473页（细胞信号，#9271；1:1000）。p-S6K/S6K和p-AKT的定量第473页/AKT比率按说明执行46，47.
细胞培养
附件MEF的生成如前所述4.蛋白质印迹第16页墨水4a小鼠抗肌动蛋白如前所述48。生长曲线如前所述生成48根据制造商的说明（Qiagen），使用Micro RNeasy试剂盒进行RNA提取。早期通过p16-3磁共振MEF公司8Judith Campisi和Marco Demaria慷慨提供。早期传代纯合子p16-流体MEF公司49由Christin Burd慷慨提供。如前所述，通过表达SV40大T抗原使MEF永生化50通过PCR基因分型鉴定细胞系基因型。他们没有接受支原体污染测试。
扩展数据
扩展数据图1
附件转基因表达追踪iWAT中衰老标记的表达并诱导AP给药后衰老细胞凋亡一，完整iWAT中SA-β-Gal活性的对比分析。b条、内源性分析第16页墨水4a和附件iWAT中转录SA-β-Gal活性的qRT-PCR分析。缩写：高/高(丁腈橡胶R1高/高) (n个=每组4只小鼠）。比例尺，0.5厘米。c（c），基于FACS的18个月龄iWAT祖细胞数量定量附件用溶媒或AP治疗的小鼠。日期：，的表达式附件qRT-PCR检测iWAT中的转基因和衰老标记(n个=每组4只小鼠）。单个条形图上方的星号表示2个月大的小鼠出现显著变化；括号上方的星号表示18个月大的溶媒和AP治疗小鼠之间的显著差异。e、，肾周、肠系膜、肩胛下和棕色脂肪储存重量。f、，2月龄婴儿iWAT中的SA-β-Gal活性附件小鼠在断奶时开始服用溶媒或AP。克，第16页墨水4aiWAT中所述小鼠的水平（f）使用肌动蛋白作为负载对照。小时，的表达式附件和衰老标记mRNA在小鼠中的表达（f）(n个=每组3只小鼠）。（i）–k）早期通过非遗传附件MEFs快递第16页墨水4a但在AP存在下培养时，对FKBP-Casp8-介导的消除不敏感。我，p16的水平墨水4a在油道3中附件小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），有无AP治疗。j、，第3通道的生长曲线附件MEF公司(n个=每组4条独立生成的MEF线），有无AP治疗。k、，的表达式附件第3代衰老标记mRNA附件MEF公司(n个=每组3条独立生成的MEF线），有无AP治疗。误差条表示s.e.m.统计显著性由非配对双尾t检验确定。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001. 有关凝胶源数据，请参见补充图1.
扩展数据图2
附件缺乏在表达高水平内源性的复制活性细胞或老化淋巴细胞中表达所需的启动子元件第16页墨水4a（a–c）SV40大T抗原-商品化附件MEF稳健表达内源性第16页墨水4a（由于SV40大T介导Rb失活），但未能激活附件并不会受到FKBP-Casp8-介导的消除。a、，第16页墨水4ap4原发性MEF和用SV40 Large-T抗原永生化的MEF中的蛋白质水平。肌动蛋白被用作加载控制。b条，第16页墨水4a用载体或两种浓度的AP处理的永生化MEF中的蛋白质水平。肌动蛋白被用作加载控制。c（c），的表达式附件p4原代MEF、载药处理的永生化MEF和AP处理的永化MEF中的衰老标记转录物(n个=每组3条独立生成的MEF线）。日期：，内源性的示意图第16页墨水4a轨迹和各种第16页墨水4a启动子区驱动附件，3MR公司和萤火虫荧光素酶(FLUC公司).附件和p16-3磁共振小鼠有2.6 kb和~50 kb第16页墨水4a启动子片段分别驱动转基因活性。p16-流体萤火虫荧光素酶是否被敲到内源性第16页墨水4a保持整个启动子区域完整但消融p16的基因座墨水4a蛋白质表达。e（电子），第16页墨水4a早期传代初级和SV40 Large-T抗原永久化的蛋白质水平p16-3磁共振MEF公司。（f）、衰老标记mRNA在早期和晚期原代MEF和SV40 Large-T抗原的表达p16-3磁共振MEF公司(n个=每组1条独立生成的MEF线，一式三份）。克、衰老标记mRNA在早期和晚期原代MEF和SV40 Large-T抗原的表达p16-流体MEF公司(n个=每组1条独立生成的MEF线，一式三份）。小时，的表达式附件CD3中的衰老标记+12个月龄和18个月龄的T细胞附件老鼠(n个=每组5只小鼠）。误差条表示s.e.m.统计显著性由非配对双尾t检验确定。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001. 我们注意到（f）和克有一个P（P）与p4 MEF相比<0.05，但标记为NS的MEF不显著。有关凝胶源数据，请参见补充图1.
扩展数据图3
附件-介导的衰老细胞清除是部分和组织选择性的，并减弱炎症标记物的表达a、，的表达式附件通过RT-PCR测定腓肠肌、眼睛、肾脏、心脏（心房）、脾、肺、肝和结肠中的转基因和衰老标记物(n个=每组4只雌性）。b、，的表达式伊尔6，Il1α和Tnfα通过qRT-PCR在不同年龄段小鼠iWAT、肾脏和骨骼肌中的测定(n个=每组4只雌性）。伊尔6值如所示（iWAT）和3a（肾脏和腓肠肌）。18个月龄非哺乳C57BL/6雌性大鼠炎症标记物的表达水平表明，反复给药不是组织炎症的来源。误差线表示s.e.m.统计显著性由非配对双尾t检验确定。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001. 中单个条上方的星号(一)表示对2个月大的小鼠的显著变化；括号上方的星号表示18个月大的溶媒和AP治疗小鼠之间的显著差异。
扩展数据图4
不同饮食和住房设施下的寿命比较一，未经处理的野生型129Sv-C57BL/6小鼠喂食5%与9%脂肪饮食的存活曲线。显示了中位寿命（以天为单位）。b条，未经处理的野生型129Sv-C57BL/6小鼠喂食9%脂肪饮食的存活曲线与载脂剂（-AP）和载脂剂处理（+AP）129Sv-C57BL/6-FVB的存活曲线对比附件来自的老鼠这些数据表明，车辆注射129Sv-C57BL/6-FVB对照小鼠的寿命在其饮食中相当正常，不太可能受到重复腹腔注射的负面影响。使用对数秩检验确定统计显著性。*，P（P）<0.01; **P（P）<0.001; ***,P（P）<0.001.c（c），d日，未注射C57BL/6雄性大鼠的中位生存数据(c（c）)和女性(d日)来自不同实验室的小鼠与我们设施的结果进行比较。
扩展数据图5
衰老细胞清除增加延缓肿瘤和白内障形成一，b条，混合生存曲线(一)和C57BL/6(b条)附件死于癌症的小鼠（死亡时有明显肿瘤的小鼠；只包括有淋巴瘤、肉瘤和癌的小鼠）。显示了中位生存率（天）和百分比增加。c（c），日期：，混合人群死亡时肉眼可见肿瘤（淋巴瘤、肉瘤和癌）的发病率(c（c）)和C57BL/6(d日)附件存活组小鼠。e（电子），C57BL/6-129Sv-FVB小鼠无癌死亡后的生存曲线（排除死亡时有明显肿瘤的小鼠，包括淋巴瘤、肉瘤和/或癌）。显示了中位生存率（天）和百分比增加。（f）–克，混合性白内障发病率(（f）)和C57BL/6(克)附件老鼠群。使用对数秩检验确定一，b条、和e–g. *,P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
扩展数据图6
衰老细胞清除不会影响18个月大的协调、记忆或运动能力附件老鼠a、，18个月大的婴儿在定速旋转试验期间所花费的平衡时间附件老鼠(n个=每组6只雄性和8只雌性小鼠）。b、，新物体调查试验。绘制了一个新物体的调查百分比除以总调查的百分比。钥匙和动物编号如所示a、c、e，耗尽时间(c（c）)，距离(d日)和工作(e（电子）)在跑步机运动测试中。动物编号如所示c、f，腓肠肌重量附件老鼠(n个=6只12个月大的雄性和雌性；n个=4名18个月大的AP男性和女性；n个=4名18个月大的婴儿+AP男性和女性）。g–i，离体腓肠肌肌纤维直径的测量(克)，腹部(小时)和椎旁肌(我). 动物编号如所示f.j公司，前肢握力分析附件老鼠。中的图例d–j日如中所示c（c）误差条表示s.e.m.未配对双尾t检验用于确定统计显著性。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
扩展数据图7
衰老细胞清除率对血液学参数和白细胞群年龄相关变化没有影响a–l，未经治疗的3个月龄和10个月龄婴儿的血液学结果附件C57BL/6小鼠和18个月大的溶媒和AP治疗附件C57BL/6小鼠。白细胞计数(一)，血小板计数(b条)，红细胞计数(c（c）)，血红蛋白浓度(d日)，红细胞压积(e（电子）)，平均红细胞体积(（f）)，平均红细胞血红蛋白(克)，中性粒细胞(小时)，淋巴细胞(我)，嗜碱性粒细胞(j个)，单核细胞(k个)、和嗜酸性粒细胞(我).（m–q），评估未经治疗的3个月龄和10个月龄婴儿的白细胞亚群附件C57BL/6小鼠和18个月大的载体和AP治疗附件C57BL/6小鼠。CD4细胞+T细胞（外周血单个核细胞或PBMC的百分比）(米)，CD8+T细胞（PBMC的%）(n个)，CD44你好CD4细胞+T细胞（CD4的%+) (o个)，CD44你好CD8（CD8）+T细胞（CD8的%+) (第页)和NK1.1+细胞（PBMC的%）(q个). 中的键和动物编号b–l类如所示一中的键和动物编号n–q个如所示米误差条表示s.e.m.未配对双尾t检验用于确定统计显著性。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
扩展数据图8
去除衰老细胞不会影响体内的生长轴信号a、，18个月大的溶媒和AP治疗组在隔夜禁食后腹腔注射葡萄糖后的血糖水平附件C57BL/6只雌性。b、，18个月大的溶媒和AP-治疗组在禁食4小时后腹腔注射胰岛素后的正常血糖水平附件C57BL/6只雌性。c中，血清Igf1水平附件C57BL/6小鼠(n个=每组4只小鼠）。日期：，磷酸-S6K、总S6K、磷酸-AKT的代表性蛋白质印迹第473页iWAT、肾脏和骨骼肌组织溶解物中的总AKT，来自18个月龄的载药和经AP-处理的附件C57BL/6只雌性。血清Igf1水平附件C57BL/6小鼠(n个=每组4只小鼠）。e、，来自(d日),n个=每组4只小鼠。f、，磷酸-AKT的定量第473页从(d日),n个=每组4只小鼠。误差条表示s.e.m。在a–c和e–f使用非配对双尾t检验。有关凝胶源数据，请参见补充图1.
扩展数据图9
衰老细胞清除不会改变“休息”小鼠的心脏形态和功能，AP治疗对缺乏附件转基因一，主动脉根部含有X-Gal晶体细胞的电子显微照片。VSMC公司，血管平滑肌细胞。比例尺，1μm（主面板）和200 nm（插图）。（b–g）心率的超声心动图测量(b条)，左心室重量(c（c）)，后壁厚度(d日)，左心室内径(e（电子）)，喷射分数(（f）)以及心脏的部分缩短(克)在12个月龄未经治疗的小鼠和18个月龄的小鼠中附件用溶媒或AP治疗的小鼠。小时，脂肪量(n个=每组9只小鼠）。18个月大附件车辆处理的小鼠值与.我iWAT和eWAT仓库重量(n个=每组4只小鼠）。18个月大附件车辆处理的小鼠值与.j个，k个、肾硬化(j个)和血尿素水平(k个) (n个=每组4只小鼠）。18个月大附件车辆处理的小鼠值与.我，异丙肾上腺素给药后的死亡时间(n个=每组4只小鼠）。18个月大附件车辆处理的鼠标值与中所示相同.动物图例和数量c–g如中所示b条，中的图例i–l如中所示小时误差条表示s.e.m.使用非配对双尾t检验未观察到统计上的显著差异。
扩展数据图10
衰老细胞清除对伤口愈合和组织纤维化的影响一，闭合18个月大的3-mm穿孔活检伤口附件如果在皮肤穿刺前2天停止药物治疗或在伤口闭合过程中继续药物治疗，则使用载药剂或AP治疗6个月后的女性(n个=6处伤口，适用于–AP；–AP和+AP；–AP和n个=AP的10处伤口+AP和+AP+AP）。在伤口愈合过程中施用AP可显著降低伤口闭合率，而与损伤前是否发生衰老细胞去除无关。b条，闭合4个月大的3-mm穿孔活检伤口附件女性受伤后使用车辆或AP进行治疗(n个=每组10处伤口）。与18个月大的小鼠相似，在伤口愈合过程中施用AP可显著降低伤口闭合率。c（c），总GFP的量化+从4个月大的小鼠的3-mm穿孔活检伤口中分离出的细胞，进入用载体（黑色）或AP（红色、，n个=每组3只小鼠）。d日，18个月大的PTAH染色组织切片附件用于检测纤维化的小鼠。比例尺，100μm。误差条表明s.e.m.未配对双尾t检验用于确定a–c。小鼠在愈合过程中接受AP一和b条与第1.5天到第9.5天使用溶媒治疗的患者有显著差异。*，P（P）<0.05.
致谢
我们感谢滨田正明、约翰·雷尼、郭倩倩、斯维特兰娜·博恩斯奇勒格尔、李明、卡罗琳·M·罗斯、滨田内美和张斌的协助，感谢克里斯汀·伯德、圣地亚哥·雷耶斯·拉米雷斯、保罗·加拉尔迪和大卫·卡兹曼以及AG041122项目赠款成员的有益讨论。我们非常感谢Richard Miller和Steve Austad在设计和解释我们的寿命研究方面提供的帮助。我们感谢Christin Burd和Judith Campisi的分享第16页墨水4a-LUC和3小时分别为MEF。这项工作得到了美国国立卫生研究院（J.M.v.D.R01CA96985和AG041122项目1）和（J.D.M.，HL111121）、保罗·F·格伦基金会（J.M.v.D.和D.J.B.）、埃里森医学基金会（D.J.B以及Robert和Arlene Kogod老龄化中心（D.J.B.）。
脚注
作者贡献
D.J.B.对附件老鼠。B.G.C.设计并进行实验，通过TEM鉴定和定量X-GAL阳性细胞，并分析小鼠心肌细胞肥大和肾脏局部RAAS活性。M.E.W.J.Z.和R.S.协助了健康跨度分析的各个方面：他们的贡献程度反映在作者顺序中。C.J.S.在含有5%或9%脂肪的饮食中对C57BL/6-129Sv/E杂交小鼠进行了寿命分析。K.B.J.研究了促生长轴信号传导。G.C.V.、D.J.M.和M.D.通过超声心动图分析了静息时的心脏功能。医学博士设计并进行了心脏应激试验。A.P.和K.K.分析了白细胞亚群。J.M.v.D.、D.J.B.和B.C.在所有合著者的参与下撰写了这篇论文。J.M.v.D.与D.J.B.合作指导和监督研究的所有方面。作者们宣布了相互竞争的经济利益。有关详细信息，请参阅该论文的在线版本。J.M.v.D.和D.J.B.是梅奥诊所授权Unity Biotechnology的专利发明者，J.M.v.D.是Unity Bietechnologies的联合创始人。欢迎读者在以下网址评论本文的在线版本：www.nature.com/nature（自然）.
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