临床投资杂志。2004年11月1日；114(9): 1299–1307.
墨水4a/Arf表达是衰老的生物标志物
，1 ，1 ，1 ，2 ，三 ，2和1
贾纳基拉曼·克里希那穆尔蒂
1医学和遗传学系2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学院Lineberger综合癌症中心微生物与免疫学系。三美国伊利诺伊州斯普林菲尔德南伊利诺伊大学医学院生理学和内科。
查德·托里斯
1医学系和遗传学系，以及2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学院Lineberger综合癌症中心微生物与免疫学系。三美国伊利诺伊州斯普林菲尔德南伊利诺伊大学医学院生理学和内科。
马修·R·拉姆齐
1医学和遗传学系2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学院Lineberger综合癌症中心微生物与免疫学系。三美国伊利诺伊州斯普林菲尔德南伊利诺伊大学医学院生理学和内科。
格里戈里·科瓦列夫
1医学和遗传学系2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学院Lineberger综合癌症中心微生物与免疫学系。三美国伊利诺伊州斯普林菲尔德南伊利诺伊大学医学院生理学和内科。
哈立德·勒盖伊
1医学和遗传学系2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学院Lineberger综合癌症中心微生物与免疫学系。三美国伊利诺伊州斯普林菲尔德南伊利诺伊大学医学院生理学和内科。
苏立山
1医学和遗传学系2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学院Lineberger综合癌症中心微生物与免疫学系。三美国伊利诺伊州斯普林菲尔德南伊利诺伊大学医学院生理学和内科。
诺曼·夏普莱斯
1医学和遗传学系2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学院Lineberger综合癌症中心微生物与免疫学系。三美国伊利诺伊州斯普林菲尔德南伊利诺伊大学医学院生理学和内科。
1医学和遗传学系2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学院Lineberger综合癌症中心微生物与免疫学系。三美国伊利诺伊州斯普林菲尔德南伊利诺伊大学医学院生理学和内科。
通信地址：Norman E.Sharpless，Lineberger综合癌症中心，美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗来那大学医学院医学和遗传学系7295号校区信箱，27599-7295，电话：（919）966-1185，或（919”966-4067；传真：（919）966-8212；电子邮件：ude.cnu.dem@sen. 收到日期：2004年6月18日；2004年7月27日接受。
- 补充资料
补充数据
GUID:4B32806B-676E-4CCB-8542-3EDB39ABB155
摘要
这个墨水4a/Arf基因座编码2个肿瘤抑制分子p16INK4a公司Arf是细胞衰老的主要介质。为了研究衰老和体内衰老之间的联系，我们检测了墨水4a/Arf在啮齿动物衰老模型中的表达。我们显示p16的表达INK4a公司随着年龄的增长，几乎所有啮齿动物组织中的Arf都显著增加，而其他相关细胞周期抑制剂的表达几乎没有变化。表达的增加仅限于研究的每个器官中定义明确的隔室，并发生在不同谱系的上皮细胞和基质细胞中。与年龄相关的p16表达增加INK4a公司肾脏、卵巢和心脏中的Arf因热量限制而减弱，这种减少与体内衰老标记物表达减少以及这些器官病理学降低有关。最后，与年龄相关的墨水4a/Arf表达式可以独立地归因于等-1，已知p16INK4a公司转录激活物，以及未知墨水4a/Arf协同调节分子。这些数据表明墨水4a/Arf抑癌基因座是哺乳动物衰老的强大生物标志物和可能的效应器。
介绍
衰老是一组复杂的表型，其特征是丢失或受损细胞的修复和/或再生减少。尽管低等生物体的研究已经将代谢和氧自由基的产生与衰老速度联系起来（参考文献。1)，对哺乳动物衰老的分子效应知之甚少。与具有有丝分裂后体的生物体内的内稳态相反，例如果蝇属和秀丽隐杆线虫哺乳动物的体内平衡依赖于组织再生所必需的自我更新组织干细胞库的持久和专属性功能。因此，干细胞寿命的调节因子被认为在人类衰老中发挥作用（参考文献综述）。2). 特别是，衰老介质是一种重要的肿瘤抑制机制和生长停滞的特殊形式，已被认为通过限制这些自我更新间隔的长期生长在衰老中发挥作用（参考文献综述）。三，4). 例如，研究表明，p53的过度活性会导致多种组织类型的小鼠过早衰老(5，6). 基于这些原因，有人认为衰老的某些方面可能是由于衰老介质（如p53、ARF和p16）的有益抗癌功能所致INK4a公司.
我们试图研究p16的作用INK4a公司ARF和相关细胞周期抑制剂在哺乳动物衰老中的作用。这一选择的动机是p16的重要性INK4a公司和/或ARF在许多小鼠和人类细胞类型（例如胰岛）的体外衰老中的作用(7)，成纤维细胞(8，9)，角质形成细胞(10，11)和巨噬细胞(12); p16的表达INK4a公司啮齿动物和人类的各种组织随着正常衰老而显著累积(13–19); 以及p16的事实INK4a公司Arf似乎是体内干细胞寿命的主要介质(20–24). 为此，我们试图确定衰老啮齿动物中细胞周期抑制剂的表达模式，并确定已知的衰老调节因子（如热量限制）对这些增殖抑制剂表达的影响。
结果
体内Ink4a/Arf的表达。
我们测定了细胞周期依赖性激酶抑制剂（CDKI）家族成员的表达，这些成员是哺乳动物细胞周期的主要调节器(25). CDKIs抑制Cdk2、Cdk4和Cdk6的激酶活性，从而抑制其靶蛋白Rb的磷酸化并引发G1期阻滞。18种定量实时PCR策略（补充表1；补充材料可在http://www.jci.org/cgi/content/full/114/9/1299/DC1)用于测定同系成年啮齿动物的老鼠和幼鼠组织中CDKI的表达（图、A和B）。我们还测试了Arf的表达，Arf是一种通过调节p53稳定性的细胞周期抑制剂，因为Arf与p16协同调节INK4a公司（图，A和B），其在小鼠中的表达先前已显示随着年龄增长而增加(18).
的表达式墨水4a/Arf基因座随年龄增长而增加。(一个)相对表达式。比率（对数2细胞周期抑制剂（年龄26个月）/年轻（2.5个月）在15个组织中的表达，用±SEM绘制。每个估计值代表4-6只小鼠独立RNA样品上8-32个定量RT-PCR反应的平均值*老年人/年轻人比率的最低估计值。(B类)绝对表达式。的绝对副本数第16页INK4a公司和阿尔夫mRNA分子（log10用±SEM对年轻（2.5个月）和老年（26个月）小鼠15个组织的每90ng总RNA RT-PCR进行了图示。显示了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在早期（P4）和晚期（P7）传代的比较。#显示最大估计表达，因为表达低于检测水平。
A marked increase (3-fold or greater) in the expression of第16页INK4a公司在从15只小鼠和12只大鼠组织分析的27个器官中的26个器官中可见。在小鼠盲肠、肾脏、卵巢和子宫中，老年组织与年轻组织（老年/年轻比率）中的RNA表达相对增加幅度特别大（>30倍）（图A；日志2而老龄动物的肺、淋巴结、肾上腺和子宫的绝对表达量最高（图B类；日志10比例）。在所分析的15个小鼠组织中，老/幼比率的几何平均值为9.7（即，平均组织中的第16页INK4a公司随着老化）。这个值可能低估了真正的平均倍数增长，因为在胰腺和骨髓等组织中（图A） ，第16页INK4a公司幼年动物的表达低于检测水平。因此，在这些组织中，只能确定这些组织中表达增加倍数的最小估计值。同样，阿尔夫在大多数检查的组织中，尤其是心脏、十二指肠、肾脏和子宫，表达增加了数倍（图、A和B）。几何平均值阿尔夫老/幼比率增加了3.5倍，而第二高的细胞周期抑制剂p21运费、保险费付至指定目的地仅为平均增长1.4倍。这些数据并不排除另一CDKI在特定组织中的特定作用；例如，第15页墨水4b随着年龄的增长，心脏中的表达增加了约5倍。同样，我们的数据也不排除某些CDKI（例如p18）INK4c（墨水4c）[参考文献。26]或第27页KIP（基普）[参考文献。27])随着年龄增长，主要以转录后方式进行调节。尽管如此，墨水4a/Arf在许多组织类型中，上调似乎与生物体衰老密切相关，这种显著且广泛的上调在哺乳动物细胞周期的主要体内抑制剂中是独一无二的。
就绝对转录数和蛋白质表达而言，p16的表达INK4a公司老年小鼠组织中的Arf明显低于小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物（图B） 甚至在第4代（体外不到14天）。这一观察结果强调，文化本身的行为有力地诱导了墨水4a/Arf轨迹(28)但也表明在体内墨水4a/Arf表达仅在给定组织内相对较小的细胞亚群中增加（例如胰腺的β细胞；图A和参考。17). 确定在哪些器官隔室中表达墨水4a/Arf增加后，我们进行了额外的分析，包括免疫组织化学（IHC）和分选细胞纯化群体的mRNA定量（图、A和B以及未显示的数据）。使用这些方法，我们能够确定p16的室间表达INK4a公司和/或老龄啮齿动物选定组织中的Arf（汇总于表).
第16页INK4a公司通过免疫组织化学和细胞纯化在特定的细胞室中表达。(一个)种系石蜡包埋切片的免疫过氧化物酶染色第16页INK4a公司-使用抗p16的缺陷（KO）、WT幼鼠（3.5个月）和WT老鼠（25个月）组织INK4a公司抗体。阳性染色细胞显示细胞核和细胞质表达。GC，生发中心。(B类)相对表达率（老/年轻，对数2刻度），共第16页INK4a公司在骨髓（lin）的特定隔室中（所有部分的平均纯度>94%）–, 2%; 林+，97%），脾（B220+, 48%; Mac1电脑+, 9%; B220型–Mac1电脑–，22%）和淋巴结。星号表示第16页INK4a公司在幼年小鼠的这些细胞群中未检测到表达，因此显示了对倍数增加的最小估计。
表1
p16的表达INK4a公司与已发表的人类IHC数据相比，在小鼠组织中（目前的工作）
这一分析得出了几个结论。首先，在大多数组织中，mRNA表达和蛋白质表达之间存在良好的相关性。然而，肺是一个例外，其RNA表达第16页INK4a公司即使是年轻小鼠的绝对值也高于老年小鼠的几个组织（图B） 然而，IHC或免疫沉淀-Western分析（未显示）未检测到蛋白表达。这一结果可能归因于p16的翻译调节INK4a公司(29)或降低该组织中的蛋白质稳定性。此外，我们检测到p16INK4a公司在多种细胞类型中表达，包括衬里上皮（如肾皮质）、间质（子宫）、淋巴细胞（脾和淋巴结）和特殊内分泌组织（如胰岛和肾上腺）（图、A和B；表). 例如，在子宫中，p16有显著表达INK4a公司在老年小鼠的基质中，但在子宫上皮中，IHC的影响较小。在肾脏中，皮质小管中的表达显著增加，髓质和肾小球中的表达明显减少。在脾脏中，p16的表达增加INK4a公司在基质（红髓）和淋巴细胞（白髓）中都观察到了隔室，尽管基质中的隔室更高（图、A和B）。总的来说，这些数据表明第16页INK4a公司随着年龄的增长，不同组织起源的细胞中的mRNA和蛋白质增加。这些结果表明墨水4a/Arf正如相关的体外观察所表明的那样，基因座可以在体内的许多（如果不是大多数）细胞类型中诱导(7–12)以及基因座在抑制多种癌症类型中的作用(30).
为了量化第16页INK4a公司，采集造血器官并纯化特定细胞类型（图B） ●●●●。的表达式第16页INK4a公司在淋巴结的基质和细胞（主要是T细胞）区室中随着年龄的增长而增加，但在基质中增加的程度更大（42倍对13倍）。同样，脾脏的基质和细胞室也显示出第16页INK4a公司随着年龄增长（15倍vs.5倍）。在脾细胞成分中，淋巴细胞（B220）显著增加+（占脾细胞总数的48%）和不表达B淋巴细胞或髓细胞标记物的细胞（Mac1和B220双重阴性，22%的细胞），而髓细胞室（Mac1+，9%的细胞）。最后，我们比较了第16页INK4a公司和阿尔夫在谱系阴性（2%）与谱系阳性（98%）的骨髓细胞中。在这个隔室中，表达增加的主要是血统阴性细胞，这些细胞富含造血干细胞和祖细胞（HSPC）(31). 这一发现与所报道的墨水4a/Arf成年小鼠HSPC和早期承诺祖细胞的表达(21). 因此，墨水4a/Arf可在多种造血器官细胞类型中表达，包括基质细胞、淋巴细胞和祖细胞。
热量限制延缓p16INK4a公司积累。
热量限制（CR）可以延缓许多物种的衰老，但其分子效应尚不清楚(32). 检查CR对第16页INK4a公司表达，我们从热量限制（CR）和随意喂养（AL）Fischer 344（F344）大鼠的器官中获取总RNA（补充图1、A和B）(33). 我们确认了墨水4a/Arf随着年龄增长，AL大鼠12种不同组织中的表达增加（典型数据如图所示A） ●●●●。褶皱的增加具有极好的一致性墨水4a/Arf和第21页运费、保险费付至指定目的地AL动物的小鼠和大鼠组织之间的表达，睾丸除外。在小鼠睾丸中第16页INK4a公司被发现（图，A和B），而在大鼠睾丸中第16页INK4a公司注意到表达（图A） ●●●●。然而，对老年AL雄性大鼠睾丸的组织学检查表明，Leydig细胞瘤明显累及（补充图1C），该肿瘤在24个月以上的大多数AL F344大鼠中自发发生(34)，高度表达了第16页INK4a公司（未显示）。在这组组织中，Arf的表达量也出现了与小鼠相似的增加第21页运费、保险费付至指定目的地（图A） ●●●●。因此，小鼠和大鼠的年龄与墨水4a/Arf表达。
热量限制和GHR缺乏对基因表达和衰老的影响。(一个)相对表达率（老/年轻，对数2年龄（28个月）和年轻（3个月）的AL或CR F344大鼠的7种组织中细胞周期抑制剂的比例。相对比率用±SEM表示。每个估计值代表4只大鼠的独立RNA样品上8-16个定量RT-PCR反应的平均值。(B类)用抗p16抗体对年轻、老年AL和老年CR F344大鼠石蜡包埋肾切片进行免疫过氧化物酶染色INK4a公司抗体。G、 皮质切片可见肾小球。(C类)AL和CR小鼠和大鼠肾脏SA-β-gal染色。C、 肾皮质；M、 肾髓质。对小鼠进行薄组织切片染色，而对大鼠进行小组织楔形染色。SA-β-gal的活性主要局限于肾皮质。(D类)相对表达率（老/年轻，对数2刻度），共等-1在AL和CR大鼠和小鼠的肾脏中。还显示了来自患有和不患有GHR缺乏症的AL和CR小鼠的肾脏的结果。每个估计值代表8只小鼠或4只大鼠的独立RNA样本上8-32个定量RT-PCR反应的平均值。
与AL动物的组织相比，CR动物的一些组织（但不是全部）在年龄诱导的墨水4a/Arf表达式。年龄诱导的第16页INK4a公司见于肾上腺、心脏、肾脏、卵巢和睾丸；但CR没有减弱墨水4a/Arf在肺、淋巴结、脾脏和肝脏中的表达（图A） ●●●●。出乎意料的是，在子宫中，CR似乎诱导了显著的增加在里面墨水4a/Arf随着年龄增长而表达。与之前的报告一致(34)，我们注意到，与AL动物相比，老年CR雄性Leydig细胞增生显著减少（补充图1C）。相应地，肿瘤负担的减少与年龄诱导的第16页INK4a公司表达（AL大鼠为135倍，CR大鼠为58倍）。因此第16页INK4a公司CR在老年大鼠睾丸中的表达可能是由于CR的抗肿瘤作用第16页INK4a公司肾皮质小管中的表达（图B） CR动物与肾炎减少（未显示）相关，肾炎是一种慢性疾病，在F344大鼠中几乎完全外显，是该菌株寿命的主要限制(34). 因此，在这两种组织中墨水4a/Arf表达与CR-诱导的疾病状态减少相一致，表明增加墨水4a/Arf在某些情况下，这种表达可能会导致器官病理改变，预示着器官衰竭和死亡。这些观察结果还预测组织特异性增加墨水4a/Arf随着年龄增长，哺乳动物（甚至是近交系啮齿动物）的表达可能会发生变化，以反映非共享遗传和/或环境暴露导致疾病的特定倾向。
我们还测试了墨水4a/Arf表达与其他老化模型。一些降低IGF-1的单基因突变延长了寿命（参考文献。35)通过与CR至少部分不同的机制(36). 我们测试了墨水4a/Arf老年和青年生长激素受体在肺和肾中的表达+/+(GHR公司+/+)和GHR公司–/–老鼠(37)随意喂食或CR饮食。年龄诱导的墨水4a/Arf与近交F344大鼠或C57BL/6小鼠队列相比，该队列中混合遗传背景的小鼠的异质性更强（补充图2）。然而，根据我们对大鼠的观察，CR显著降低第16页INK4a公司和阿尔夫小鼠肾脏中的表达（补充图2）。然而，GHR缺乏对第16页INK4a公司或阿尔夫肾脏中的表达，尽管在第16页INK4a公司和阿尔夫GHR缺乏动物的肺中有表达（补充图2）。这些结果证实了CR对另一物种的影响墨水4a/Arf如其他方法所建议的那样，GHR缺乏和CR通过不同组织中不同的分子机制提高寿命(36，38).
此外，我们试图确定墨水4a/Arf在衰老哺乳动物中的表达。我们使用了一种描述良好的体内衰老标记物，即衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）表达，这是一种在衰老细胞和组织中检测到的高H半乳糖甙酶活性(39). 由于本底活性高，该分析仅限于大多数组织（如肝脏和脾脏），但可在小鼠和大鼠肾脏中解释（图C） ，与之前的报告一致(15). 在AL小鼠和大鼠的衰老肾脏中检测到SA-β-gal活性显著增加（图C） 主要局限于肾皮质，这种表达模式与p16重叠INK4a公司表达式。SA-β-gal活性的增加与p16的增加一样INK4a公司表达，被CR废除，这表明墨水4a/Arf–由于新陈代谢增加，在肾皮质中诱导衰老。
Ets-1和通用Ink4a/Arf调节器调节p16INK4a公司随着年龄增长而表达。
为了确定导致墨水4a/Arf随着年龄的增长，我们接下来确定了3种主要调节因子的表达墨水4a/Arf表达式：Ets-1，激活第16页INK4a公司(40，41); Id1，一种第16页INK4a公司(40，42); 和Bmi-1，一种墨水4a/Arf轨迹(43)（补充图3）。这些基因的表达是在年轻和年老小鼠和/或大鼠的多个组织中测定的，有无CR。我们计算了所有基因在所分析的组织类型中的对数转换老/年轻比率的皮尔逊相关系数。正如所料，我们发现第16页INK4a公司和阿尔夫表达式(对= 0.75,P（P）<0.0001）和阿尔夫和第21页运费、保险费付至指定目的地(对= 0.37,P（P）=0.03），但两者之间没有显著相关性第16页INK4a公司和第21页运费、保险费付至指定目的地这些结果与这些基因的已知转录关系一致；特别是几种蛋白质(43–47)已经确定协调调节两者的表达墨水4a/ArfArf调节p53活性，p53活性反过来诱导p21运费、保险费付至指定目的地表达式。出乎意料的是，我们发现第18页INK4c（墨水4c）和第19页墨水4d(对= 0.68,P（P）=0.002），这表明这些基因受共同或相关转录因子调节。尽管这些同源INK4在许多组织中同时表达(18)，我们不知道以前的数据显示体内协调表达。
的表达式墨水4a/Arf接下来考虑监管机构（补充图3）。在表达标识1和的第16页INK4a公司(对= –0.40,P（P）=0.07），与Id1作为p16转录抑制因子的已知作用一致INK4a公司(40，42). 未发现两者之间存在显著相关性B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1表达式和其中一个的表达式第16页INK4a公司或阿尔夫（未显示）。然而，值得注意的是，p16之间有很强的相关性INK4a公司和等-1(对= 0.62,P（P）< 0.001; 图A） ，但不是介于阿尔夫和等-1(对= 0.15,P（P）= 0.40). 该观察结果与Ets-1诱导第16页INK4a公司，但不是阿尔夫，在培养细胞中(40，41)并表明第16页INK4a公司随年龄增长的表情(对2=0.38）Ets-1转录激活的结果（图B） ●●●●。此外其他-1CR大鼠和小鼠肾脏中均有表达（图D） 这表明代谢增加是衰老肾脏中Ets-1激活的上游。同样第16页INK4a公司和阿尔夫还表明第16页INK4a公司和阿尔夫发挥了强大的作用(对2=0.49）关于两者的表达式墨水4a/Arf老化产品，并且该共调节剂必须独立于Ets-1（如阿尔夫和等-1不相关）。因此第16页INK4a公司老龄化似乎反映了几乎同样的第16页INK4a公司-与相关的特定效果等-1表达式和独立，墨水4a/Arf协同调节作用。
第16页INK4a公司表达与衰老密切相关阿尔夫和等-1表达式。(一个)散点图（对数2比例，双轴）第16页INK4a公司表达与表达比率（老/年轻）阿尔夫，等-1、和标识1在相应组织中可见(n个=小鼠和大鼠多达15个组织中每个基因22–70个数据对）。每个比率表示方法中描述的每个组织的多次测量的平均值。每个数据系列都显示了一条由线性回归确定的最佳拟合线，带有皮尔逊相关系数和双尾P（P）值。未发现两者之间存在显著相关性阿尔夫和等-1，或介于阿尔夫或第16页INK4a公司和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1（未显示）。(B类)箭头表示已知或推断的转录关系，数字表示协方差(对2)对于在中确定的链接元素一个.作为第16页INK4a公司和阿尔夫不相互调节，似乎有理由假设一个未知的协同调节因子（X）随着年龄的增长调节两种转录物的表达，解释了它们之间的强烈相关性(对2= 48%). 此外，作为阿尔夫和等-1不共价，X和Ets-1必须是独立的。X不需要代表单个转录因子：它可能代表几个基因（例如PcG家族成员）或影响其他转录特性的基因的组合活性，例如信息稳定性。该模型表明第16页INK4a公司分析组织中随年龄增长的表达可归因于X和Ets-1的活性。
讨论
这项工作增加了越来越多的证据表明，体内衰老是由墨水4a/Arf表达，在某些组织类型的衰老中起着因果作用。首先，如本工作所示，墨水4a/Arf表达不仅与衰老密切相关，而且受CR影响，并与SA-β-gal表达相关。墨水4a/Arf在小鼠早衰模型中，一些组织中的表达也增加(48)，和的表达式第16页INK4a公司或墨水4a/Arf体内与造血干细胞增殖受损和衰竭相关(20，21，23，24). 虽然墨水4a/Arf衰老组织中的表达是一个积极的研究领域，第16页INK4a公司研究表明，这种缺陷可以改善T细胞对CD3和CD28反应性的年龄相关性下降(49)是小鼠免疫系统衰老的标志(50). 类似地，神经干细胞B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1–缺陷动物表现出增加墨水4a/Arf表达和再生潜能受损；这种表型可以通过第16页INK4a公司不足(22). 总的来说，这些结果表明第16页INK4a公司和/或阿尔夫表达不仅是一种生物标记物，也是一种效应器，衰老，可能是通过限制不同组织的自我更新能力，至少包括淋巴器官、骨髓和大脑。进一步确定墨水4a/Arf其他老化组织中的基因座以及p16的相对贡献INK4a公司与Arf相比，需要对p16基因的生殖系和组织特异性缺失小鼠进行进一步研究INK4a公司和/或Arf。
我们检测到年龄诱导的墨水4a/ArfCR在一些组织中表达，但尤其是在肾脏中，其作用几乎完全。减少墨水4a/Arf表达与老年F344大鼠肾炎减少相关，这是该菌株寿命的主要限制(34). 因此，很容易推测墨水4a/Arf表达限制了老年肾脏的自我修复能力，导致器官衰竭和死亡。我们对GHR缺乏动物组织的分析过于有限，无法在组织水平上确定GHR缺乏对墨水4a/Arf表达；但与CR相比，GHR缺失并未影响p16INK4a公司在衰老肾脏中的表达（补充图2）。IGF-1的减少可能同样延缓了墨水4a/Arf在其他组织中表达；这可以解释CR延长IGF-1缺乏动物寿命的能力(36). 或者，IGF-1缺乏可能通过一种独特的，墨水4a/Arf–独立的延缓老化机制。
因为啮齿类动物的端粒较大，并且杂乱地表达端粒酶(51，52)，感应的信号墨水4a/Arf肾脏和其他器官中由–介导的衰老不太可能基于端粒。然而，我们能够证明等-1表达和第16页INK4a公司在两个物种的27个不同组织中随着年龄增长而表达，有无CR。考虑到Ets-1是第16页INK4a公司在体外(40，41)，这些数据表明Ets-1是第16页INK4a公司体内随着衰老而表达。反过来，Ets-1又受到各种应激相关信号的调节，尤其是MAPK活性。Ets-1激活与两个ERK相关(53，54)和p38MAPK公司(55)信号传递，而最近的遗传证据表明p38MAPK公司激活与增加墨水4a/Arf体内表达(56). 这些观察结果与模型一致（图B） 目前尚未确定的应激通过MAPK途径激活Ets-1，诱导p16INK4a公司-介导衰老的生物体。
通过统计方法，我们还推断出一种未知的协同调节因子的存在，该因子不同于Ets-1，并调节两者的表达第16页INK4a公司和阿尔夫随着年龄增长。一个明显的候选者是Polycomb组（PcG）蛋白Bmi-1，它被证明可以调节第16页INK4a公司和阿尔夫干细胞在体内的表达(20–22，57). 然而，我们没有发现B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1表达式和其中之一第16页INK4a公司或阿尔夫在大多数衰老组织中。因此，转录B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1不太可能成为墨水4a/Arf在多种组织类型中的体内表达，但该分析并不排除Bmi-1在特定组织中的特定作用。沿着这些路线，我们发现B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1脾脏和骨髓中随着衰老的表达（补充图3），这表明可能含有Bmi-1的PcG复合物在抑制墨水4a/Arf造血组织中的表达(20，21，43). 同样，可能与墨水4a/Arf–抑制PcG家族成员，如Cbx7(58)或梅尔18(59)包含Bmi-1在其他组织中的功能；PcG复合物活性在转录后受到调节；或者未经鉴定的非PcG分子是墨水4a/Arf在这方面，确定两者之间的联系（如果有的话）也将是未来的兴趣所在墨水4a/Arf表达和已知的衰老调节因子，如Foxo蛋白和SirT1(60，61).
临床医学需要一种生理学的分子生物标志物，而不是年代，年龄。虽然已经提出了其他衰老的分子标记，但我们相信INK4a/ARF公司在这方面，表达可能会证明特别富有成效，原因如下。首先第16页INK4a公司随着年龄增长，其表达量很大（在许多组织中超过10倍），并且通过免疫组织化学方法或定量实时PCR分析来测量相对简单。例如，有一种经临床验证的商用试剂盒（DakoCytomation Inc.）用于检测p16INK4a公司许多解剖病理学家已经对p16的解释感到满意INK4a公司国际卫生理事会。此外，我们的结果表明墨水4a/Arf可以在许多细胞类型中表达，以应对年龄诱导的压力墨水4a/Arf随着年龄的增长，大多数哺乳动物器官中至少有一个亚室的表达发生变化。因此，p16INK4a公司或ARF表达可能是衰老的一个特别有力的标志，对研究不同器官中的多种细胞类型很有用。最后，考虑到p16的可能因果作用INK4a公司和/或ARF在衰老中的表达INK4a/ARF公司与其他基因的表达相比，它与衰老的相关性更强，而这些基因的表达仅仅是副现象。
有人预计，一个明确的衰老分子标记物可用于至少4个临床目的：（a）有助于预测疾病前期综合征（如肾功能不全和心肌病）的疾病进展；（b） 为抗衰老药物的疗效提供替代标记物；（c） 预测化学或放射治疗以及需要组织再生和修复的手术等有害疗法的未来毒性；以及（d）确定骨髓、实体器官和组织异体移植的供者适宜性。的效用INK4a/ARF公司预测或确定组织未来再生潜能的表达，即上述适应症（c）和（d），是一个积极的、正在进行的研究课题。然而，这项工作确实作为使用墨水4a/Arf适应症（a）和（b）的表达：我们证明墨水4a/Arf表达与啮齿类动物肾脏和睾丸的组织老化和疾病进展变化相关，该位点表达减少与抗衰老治疗（热量限制）的反应相关。因此，我们的数据表明INK4a/ARF公司在确定人类生理年龄时，表达同样具有临床益处。
方法
动物。
所有动物均按照北卡罗来纳大学动物研究机构护理和使用委员会批准的协议进行饲养和治疗。除非另有说明，否则所有小鼠分析均在C57BL/6小鼠中进行。对于细胞分选实验，分析了22至25个月大的混合遗传背景小鼠（C57BL/6×NIH Black Swiss；来自北卡罗来纳大学Yue Xiong）。分析了具有混合遗传背景（来自Ola-BALB/c、C57BL/6和C3H；由美国俄亥俄州雅典俄亥俄大学John Kopchick提供）的老年（21个月）和年轻（5个月）GHR KO和WT（CR和AL）小鼠。如前所述，对该鼠群进行CR(38). 老龄啮齿动物是从美国国家老龄研究所的老龄啮齿类动物群落中获得的（参考。33; 另请参见http://www.nia.nih.gov/research/ratot.htm)并在我们的设施中实施安乐死，器官的采集如下所述。对于小鼠研究，分析了年龄（25-26个月）和年轻（2.5-3.5个月）的C57BL/6小鼠（3只雄性和3只雌性）。在CR实验中，获得了大鼠（28个月）和幼鼠（3个月）F344 AL大鼠（2只雄性大鼠和2只雄性小鼠，2只雌性大鼠和两只雌性小鼠），以及大鼠（28-个月）CR同窝鼠（2雄性和2雌性）。
动物被一氧化碳安乐死2吸入，并采集器官。对器官进行大体解剖，去除污染组织（例如脂肪），然后进行snap冷冻。在所有情况下，从器官的匹配部分（例如肾脏的上半部分）获取RNA，以确保结果不会因器官组成而有所不同。为了进行RNA分析，在心脏灌注RNA后收集组织后来（Ambion Inc.）或在液氮中速冻后。对于IHC和H&E染色，按照如下所述采集器官并固定，然后将其保存在70%乙醇中，直到石蜡包埋。
定量实时PCR。
根据制造商的说明，从组织、连续传代的小鼠胚胎成纤维细胞（每个传代相当于体外3天）或使用QIAGEN RNeasy RNA分离试剂盒分选的细胞样本中提取总RNA。使用oligo-dT在20μl体积内转录到cDNA(12–18)或随机六聚体和ImProm-II逆转录酶（Promega Corp.）。所有PCR反应均在20μl的最终体积中进行，并根据制造商的方案在ABI PRISM 7700序列检测系统（Applied Biosystems）中对每个cDNA样品重复进行。所有实验均在每组至少2只不同动物的器官上进行（老年与年轻、CR与AL）。
使用Primer Express（Applied Biosystems）为指定基因设计序列特异性引物和探针（补充表1）。寡核苷酸引物和探针由MWG Biotech合成。所有引物都设计成跨越一个内含子。从Applied Biosystems购买预先开发的检测方法，用于额外列出的小鼠和大鼠基因（补充表1）。反应混合物包括Universal Master mix No-AmpErase UNG（Applied Biosystems）、0.25μM荧光探针、0.9μM每种特定正向和反向引物以及9μl稀释cDNA（相当于～90 ng总RNA）。扩增是在标准条件下进行的。对每个cDNA重复测定达到荧光阈值所需的PCR周期数，取平均值，然后将其归一化为至少1个参考基因（18S、GAPDH或TATA-结合蛋白[TBP]；更多详细信息请参见补充图4），以得出达到荧光阈值的周期数(C类t吨). 老年组织与年轻组织（老年/年轻）中的表达比率确定为2[Ct（老）–Ct（年轻）]; 因此，log2（老/年轻）=C类t吨（旧）-C类t吨（年轻）。使用Prism软件（GraphPad software Inc.）计算SE和Pearson相关系数时，对数转换比率。用于p16转录副本数量的绝对量化INK4a公司，第15页墨水4b，第19页自动射频，第21页运费、保险费付至指定目的地，第18页INK4c（墨水4c）和第19页墨水4d，克隆感兴趣的片段，并用连续4倍稀释生成标准曲线（补充图5）。对于所有测试的分析，PCR反应在研究范围内呈线性（19-40个扩增周期；补充图5）。如果C类t吨40个周期未达到，表达被认为低于检测极限。凝胶电泳分析时，所有RT-PCR反应均为单一条带，所有反应均使用荧光标记的内部探针，以提高灵敏度和特异性。
骨髓、淋巴结、胸腺和脾脏的细胞分类。
5月龄和22月龄小鼠的组织(n个=2/年龄）进行分类和排序。对于骨髓，根据制造商的方案，使用带有自动MACS分离器（Miltenyi Biotec Inc.）的谱系细胞去除试剂盒收集谱系阴性和谱系阳性组分。淋巴结、胸腺和脾脏的基质和细胞成分是通过在磨砂玻璃片之间按压，然后用含有10%FCS的PBS清洗来制备的。红细胞溶解后，用抗B220（Caltag Laboratories Inc.）和抗CD11b（Mac1；Caltag Laboratories Inc）单克隆抗体在冰上染色30分钟，然后清洗，进一步分析脾细胞。细胞由MoFlo（Cytomation Inc.）分类至B220+，Mac1+和B220–Mac1电脑–北卡罗来纳大学FACS核心设施的种群（纯度>94%）。
IHC和SA-β-gal染色。
确定p16的最佳IHC染色条件INK4a公司，组织取自与年龄匹配的同窝伙伴第16页INK4a公司+/+和第16页INK4a–/–小鼠和分析。对之前描述的几种固定剂进行经验性测试后(62)，Fekete的酸性醇溶液（61%的ETOH、4.3%的冰醋酸和3.5%的福尔马林）被确定为p16的最佳溶液INK4a公司使用商用抗体和试剂盒在小鼠和大鼠组织中进行IHC染色（带有F-12抗体的ImmunoCruz HRP试剂盒，sc-1661；Santa Cruz Biotechnology Inc.）。切割五微米石蜡切片，并按照制造商的方案进行柠檬酸盐抗原提取、杂交和苏木精复染。切片由一名对动物年龄、饮食和基因型不知情的观察者进行检查。如前所述进行SA-β-gal染色(15，39，43). 简而言之，将收获器官的薄片（<2mm）在室温下固定在0.5%戊二醛/PBS（pH 6.0）中15分钟。固定后，器官切片在PBS（pH 6.0）中清洗两次，在37°C的SA-β-gal缓冲液（1 mg/ml X-gal、5 mM铁氰化钾、5 mM-亚铁氰化钠钾和1 mM MgCl）中染色过夜2在PBS中，pH值为6.0），并使用高分辨率CCD相机拍摄（LighTools Research）。
致谢
我们要感谢约翰·科普奇克、南希·纳登、伊戈尔·米凯利安、理查德·福尔沃、斯科特·阿尔森、鲍尔福·萨托和岳雄提供的建议和试剂；以及Andrzej Bartke、Diego Castrillon和Ron DePinho对手稿的评论。这项工作得到了Sidney Kimmel癌症研究基金会、Paul Beeson医师学者计划和NIH（AG19899和CA090679）的资助。
脚注
参见第页开头的相关评论1237.
使用的非标准缩写：AL，自由裁量——联邦；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKI；CR，热量限制，热量限制；F344，Fischer 344；生长激素受体；IHC、免疫组织化学；老组织/年轻组织中的RNA表达；PcG、Polycomb组；SA-β-gal，衰老相关β-半乳糖苷酶。
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
工具书类
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