自噬。2011年12月1日；7(12): 1424–1433.
Atg13和FIP200在自噬诱导中独立于Ulk1和Ulk2
,1 ,1,† ,1,‡ ,1 ,1 ,2 ,三 ,4 ,4 ,1,†和1,†*
塞巴斯蒂安·阿列尔斯
1内科一科；杜宾根大学诊所；德国图宾根
安捷·洛夫勒
1内科一科；杜宾根大学诊所；德国图宾根
弗洛里安·帕什
1内科一科；杜宾根大学诊所；德国图宾根
亚历山德拉·M·迪特勒
1第一内科；杜宾根大学诊所；德国图宾根
Hildegard Keppeler公司
1内科一科；杜宾根大学诊所；德国图宾根
克里斯汀·劳伯
2分子肿瘤学；放射肿瘤学系；路德维希·马克西米利安大学；德国慕尼黑
大卫·G·坎贝尔
三MRC蛋白磷酸化单元；生命科学学院；邓迪大学；英国苏格兰邓迪
塞巴斯蒂安·韦塞尔堡
1内科一科；杜宾根大学诊所；德国图宾根
1内科一科；图宾根大学诊所；德国图宾根
2分子肿瘤学；放射肿瘤学系；路德维希·马克西米利安大学；德国慕尼黑
三MRC蛋白磷酸化单元；生命科学学院；邓迪大学；英国苏格兰邓迪
4皮肤科；杜宾根大学；德国图宾根
†现隶属于：分子医学研究所；海因里希-海因大学；德国杜塞尔多夫
‡分子细胞生物学系；马克斯·普朗克生物化学研究所；德国马丁斯里德
- 补充资料
其他材料：作者提供的补充PDF文件。
指南：9EB1C276-9C1F-461A-BF33-DA14E74A5DA6
摘要
在正常生长条件下，哺乳动物雷帕霉素复合物1靶点（mTORC1）负性调节由Unc-51样激酶1/2（Ulk1/2）、200 kDa的黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）和Atg13组成的中央自噬调节复合物。饥饿时，mTORC1介导的对该复合物的抑制被释放，从而导致Ulk1/2激活。在这种情况下，Atg13被认为是调节Ulk1/2和FIP200之间相互作用并增强Ulk1/2激酶活性的适配器。利用Atg13缺陷细胞，我们证明Atg13对自噬诱导是必不可少的。我们进一步表明，Atg13函数严格依赖于FIP200绑定。相反，Ulk1和Ulk2的同时敲除对自噬诱导没有类似的作用。因此，我们在Atg13中确定的Ulk1依赖性磷酸化位点在这个过程中是可消耗的。这表明Atg13具有独立于Ulk1/2的额外功能，并且Atg13和FIP200在自噬诱导过程中协同作用。
关键词：Atg13，自噬，FIP200，Ulk1，Ulk 2
介绍
大自噬（以下简称自噬）是一种重要且高度保守的溶酶体降解过程，通过细胞质物质的结构性转换帮助维持细胞内环境稳定。细胞成分，如长寿命蛋白质和整个细胞器，被一种称为隔离膜或吞噬体的双层膜隔离。封闭后，产生的自噬体随后与溶酶体融合，导致其内容物降解。所提供的氨基酸可重复用于蛋白质合成以及ATP生产的能量来源。通过这种方式，自噬代表了一种细胞对饥饿的适应机制，因此在营养剥夺后会强烈增强。尽管自噬对细胞生长、生存和发育具有重要作用，但其诱导自噬的分子细节及其潜在的信号级联机制仍知之甚少。
在酵母中，两种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶可被确定为调节自噬诱导的必要先决条件。雷帕霉素的营养敏感激酶靶点（TOR）通过对另一种丝氨酸/苏氨酸激酶Atg1的负调控，在富含营养的条件下抑制自噬诱导。在酵母中，Atg1与调节蛋白Atg13和Atg17发生差异性相互作用，这两种蛋白对Atg1激酶活性都很重要。1,2在正常生长条件下，Atg13以TOR依赖的方式进行过磷酸化。饥饿或雷帕霉素处理后，它立即去磷酸化，导致Atg1-Atg13-Atg17复合物的形成和自噬诱导。
脊椎动物至少有两种Atg1同源物，即Unc-51样激酶1（Ulk1）和Ulk2，三-6似乎实现了部分冗余功能。7-9虽然没有Atg17同源物，但200 kDa的黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）被认为是Atg17的功能对等物。8此外，通过序列同源性预测了Atg13的脊椎动物同源物10并且已经被证明与自噬诱导有关。7Ulk1/2、Atg13和FIP200形成一个大于3 MDa的大型稳定复合物，与酵母Atg1-Atg13-Atg17复合物相比，该复合物对细胞营养状态不敏感。最近，几个小组同时表征了这个Ulk-Atg13-FIP200复合物的分子细节，更重要的是，它由mTOR复合物1（mTORC1）直接调控。11-15在营养丰富的条件下，mTORC1通过猛禽和Ulk1/2之间的相互作用，加入Ulk-Atg13-FIP200复合物，14mTOR直接磷酸化Atg13和Ulk1/213-15可能位于抑制位点，以抑制Ulk1/2的激酶活性。在饥饿条件下或mTORC1活性被抑制时，Ulk1/2在未知位点磷酸化FIP200和Atg13，整个复合物转移到吞噬细胞组装位点。11,14,15因此，可以合理假设，Ulk1/2对FIP200或Atg13的磷酸化是这种易位的先决条件，反过来也是自噬诱导的先决前提。
使用新生成的Atg13缺陷细胞系，我们表明，在正常生长条件下，Atg13对饥饿诱导的自噬和基础自噬是必不可少的，并且与FIP200的直接相互作用对这一功能是必不可少的。有趣的是，Ulk1和Ulk2的双重敲除对LC3脂质化和自噬体的形成没有显著影响。因此，我们在人类Atg13中确定的Ulk1依赖性磷酸化位点对Atg13的功能不是必需的。由于mTOR抑制并不完全类似于饥饿诱导的自噬，我们得出结论，Atg13和FIP200在自噬诱导过程中协同作用，但这种功能并不一定依赖于mTOR介导的Ulk1或Ulk2激酶活性的调节。
结果
Atg13敲除细胞系的建立
Atg13在TOR介导的自噬诱导中的重要作用最初已在酿酒酵母自噬缺陷突变体。2,16Atg13的必要性在高等后生动物中似乎是保守的，因为它们各自具有完全的自噬缺陷表型黑腹果蝇基因敲除突变体。12到目前为止，Atg13在高等脊椎动物自噬中的重要性已被siRNA-介导的敲除证实。然而，观察到的效果取决于各自的细胞系、Atg13敲除效率和使用的读数。11,13-15
为了分析Atg13的作用及其由Ulk1和Ulk2在遗传定义的背景下的调节，我们首先通过破坏第13天基因(图S1A和S1B). DT40细胞系统已成功用于分析自噬过程。17-19值得注意的是，Atg13的一级结构在智人和五倍子显示92%的氨基酸身份(图S1C). 四个独立纯合子第13天−/−克隆可以通过基因组聚合酶链式反应进行鉴定，这两种克隆都失去了野生型等位基因(图S1B). 内源性Atg13蛋白的免疫印迹证实完全缺乏蛋白质表达().
生成Atg13缺陷的DT40细胞。（A） Atg13缺陷型DT40 B细胞系(第13天−/−)都是由两者的定向破坏产生的第13天等位基因。使用野生型、hisD-或bsr-靶向等位基因特异性引物的基因组PCR证实了靶向成功（参见图S1详细信息）。来自任意一种野生型（wt）细胞的清除细胞裂解物的等量蛋白质（第1道），第13天+/−克隆（车道2–3）和第13天−/−通过免疫印迹法分析克隆（4–7道）的Atg13和GAPDH。星号表示未指定的背景带。（B） 野生型和第13天−/−用10 nM巴非霉素A处理逆转录病毒转染了编码mCitrine-LC3B的cDNA的DT40细胞1（BafA1）或DMSO（对照）6小时，并通过共焦激光扫描显微镜直接观察（棒材：10µm）。（C） 对（B）中描述的细胞的清除细胞裂解物进行抗Atg13和抗LC3免疫印迹。LC3-II/LC3-I比率表示为三个独立实验的平均值±SEM（D）第13天−/−用HA标记的全长鸡Atg13亚型A（9–12道）重组的细胞在正常生长培养基（RPMI）或饥饿培养基（EBSS）中培养1h，有或无10nM（BafA1）。通过免疫印迹法分析清除的细胞裂解液中的等蛋白量的Atg13、GAPDH和LC3。作为对照，野生型细胞（1-4车道）和第13天−/−用空载体（5-8道）重组的细胞进行平行分析。LC3-II/GAPDH比值表示为三个独立实验±SEM的平均值。
Atg13缺乏阻断自噬诱导
为了分析它们的自噬能力，我们首先使用荧光标记的鸡LC3B（mCitrine-LC3B）在野生型和第13天−/−巴非霉素A存在和不存在下的细胞1.LC3是一种细胞溶质蛋白，在自噬体形成（LC3-II）过程中被自噬机制脂化，因此被招募到自噬体内。20液泡H+-ATP酶抑制剂巴非霉素A1防止自噬体的溶酶体降解21因此经常用于分析自噬通量。
令人惊讶的是，巴非霉素A1野生型DT40细胞中自噬体的数量和大小显著增加，在第13天−/−单元格(). 接下来，我们通过免疫印迹法研究了Atg13敲除对LC3脂质氧化的影响。在野生型细胞中，用巴非霉素A培养1在正常生长条件下，导致内源性和荧光标记的LC3-II显著积累(，车道1和2），同时第13天−/−细胞几乎没有检测到脂质LC3的蓄积(，车道3和4）。令人惊讶的是，在野生型细胞中，EBSS中的饥饿可能会进一步增强内源性LC3脂质氧化(，车道1-4）。相反，第13天−/−饥饿后，细胞没有显示出任何明显的LC3脂质积聚(，车道5-8）。值得注意的是第13天−/−带有HA标记全长鸡Atg13的细胞能够部分挽救自噬缺陷表型(，9–12车道）。为了验证LC3脂质化与自噬体形成相关，我们通过透射电镜进一步研究了自噬小体的存在。而野生型DT40细胞在饥饿后每个细胞显示出大量的双膜自噬体()中几乎没有检测到自噬体第13天−/−单元格(). 值得注意的是，相比之下，Atg13缺陷细胞在饥饿条件下表现出线粒体增大和肿胀(). 此外，我们使用串联mRFP-EGFP-rLC3构建物研究了自溶体的形成。22同样，当野生型DT40细胞在EBSS中饥饿2小时后显示大量自噬体和自溶体()mRFP-EGFP-rLC3主要分布于第13天−/−这些细胞中几乎没有检测到自溶体().
Atg13对自噬体的生成至关重要（A）DT40野生型和（B）第13天−/−细胞在正常生长培养基（对照）或EBSS中孵育2小时。细胞固定并通过透射电子显微镜进行分析。每个条件下的代表性单元格以两种不同的放大倍数显示。放大后的图像中，自噬体用黑色箭头表示，线粒体肿胀用星号表示（条形：500 nm）。（C） 野生型和（D）第13天−/−用编码mRFP-EGFP-rLC3的cDNA逆转录转染的细胞在EBSS中孵育2h，并用激光共聚焦扫描显微镜进行分析。在合并图像中，mRFP信号以红色显示，EGFP信号以绿色显示。自体溶酶体用白色箭头表示（条：10µm）。含有自体溶酶体的细胞百分比（>200个细胞/实验）表示为两个独立实验的平均值±范围。
总之，这些结果表明，在DT40细胞中，Atg13对自噬诱导和饥饿条件下自噬体的生成以及基础自噬至关重要。
Ulk1和Ulk2缺乏与Atg13基因敲除的表型不相似
根据之前的观察，12-15对于饥饿诱导的自噬，已经提出了以下有吸引力的工作模型：11在营养丰富的生长条件下，mTORC1与Ulk-Atg13-FIP200复合物结合，磷酸化Ulk1和Atg13，从而抑制Ulkl激酶活性。饥饿后，Ulk1磷酸化Atg13和FIP200，最终导致自噬诱导。11
据报道，Ulk2是为了弥补Ulk1的不足，9,23我们生成了Ulk1和Ulk2缺失的DT40细胞（有关靶向策略，请参见图S2A和S2B). 从开始ulk1号机组−/−细胞（克隆16-10），两个纯合ulk1号机组−/−ulk2号机组−/−细胞株（2-6和17-16）可通过基因组PCR鉴定(图S2C). RT-PCR证实了转录本的完全缺失()和定量实时PCR(图S6B).
Ulk1和Ulk2对于DT40细胞的自噬诱导是不可或缺的。（A） Ulk1缺失的DT40细胞(ulk1号机组−/−)，Ulk2(ulk2号机组−/−)或Ulk1和Ulk2(ulk1/2−/−)通过基因靶向产生，野生型等位基因的丢失通过基因组PCR得到确认（有关详细信息，请参阅图S2). 缺少ulk1号机组和ulk2号机组转录本经RT-PCR验证。（B） 野生型细胞和两个独立的双缺陷细胞ulk1/2−/−克隆（2-6和17-16）在全培养基（RPMI）或EBSS中，在有或无10 nM BafA1的条件下培养1小时。通过免疫印迹法分析清除细胞裂解液中等量的蛋白质，以检测Atg13、GAPDH和LC3。LC3-II/GAPDH比值表示为三个独立实验的平均值±SEM（C）ulk1/2−/−细胞（克隆2-6）在正常生长培养基（对照）或EBSS中孵育2h，固定细胞并进行透射电镜分析。对于饥饿条件，代表性细胞显示在两种不同的放大倍数中。在放大倍率较高的图像中，自噬体由黑色箭头指示（条形：500 nm）。（D）ulk1/2−/−用编码mRFP-EGFP-rLC3的cDNA逆转录转染的细胞（克隆2-6）在EBSS中孵育2h，并用共焦激光扫描显微镜进行分析。在合并图像中，mRFP信号显示为红色，EGFP信号显示为绿色。自体溶酶体用白色箭头表示（条：10µm）。具有自溶体的细胞百分比（>100个细胞/实验）表示为三个独立实验的平均值±SD。n.s.表示野生型和ulk1/2−/−细胞（学生t检验）。
有趣的是，无论是单一缺陷ulk1号机组−/−和ulk2号机组−/−单元格(图S3A)也不是双重缺陷ulk1号机组−/−ulk2号机组−/−细胞系类似于第13天−/−由于缺乏Ulk1和Ulk2，细胞对饥饿诱导的自噬没有明显影响。在有和无巴非霉素A的情况下，通过内源性LC3脂质氧化来评估自噬诱导1()电子显微镜下自噬体的生成(,S3B和S3C)并使用mRFP-EGFP-rLC3串联结构形成自溶体().
我们还发现，我们可以在人类Atg13中识别的五个依赖于Ulk1的体外磷酸化位点对DT40细胞中的Atg13功能是不必要的(图S4
和
第5章). 虽然人们普遍认为只有高度相关的Ulk1和Ulk2才能通过其独特的C端域与Atg13交互(图S6A)因此可以相互补充，但可以想象，其他Ulk同源物之一（Ulk3、Ulk4和STK36/Fused）可能在没有Ulk1和Ulk2的情况下调节饥饿诱导的自噬。为了解决这个问题，我们通过定量实时PCR分析了野生型DT40细胞中所有已知Ulk同源物（Ulk1、Ulk2、Ulk3、Ulk 4和STK36/Fused）的丰度，ulk1号机组−/−,ulk2号机组−/−都是双重缺陷ulk1号机组−/−ulk2号机组−/−细胞系(图S6B). Ulk2似乎是野生型DT40细胞中最丰富的Ulk同源物。值得注意的是，其他Ulk同源物在ulk1号机组−/−ulk2型−/−细胞。自从Ulk3在过度表达后参与自噬诱导以来24和ulk3号机组在DT40细胞中发现mRNA处于中等水平(图S6B)，我们分析了瞬时siRNA介导的Ulk3敲除后自噬诱导ulk1型−/−ulk2号机组−/−细胞。然而，饥饿诱导的自噬不受额外的Ulk3下调的影响(图S6C).
这些结果强烈表明，在DT40细胞中，Atg13在自噬诱导中的关键功能是独立于Ulk1和Ulk2的。这一令人惊讶的发现可能进一步解释为，在我们的细胞中，mTOR似乎在自噬诱导中起着次要作用。虽然EBSS中的饥饿在1小时后已经导致显著的LC3-II积累，但雷帕霉素或Torin1对mTOR的直接抑制并没有显示出类似的效果，尽管mTOR活性几乎立即被抑制(图S7A–C). 有趣的是，在饥饿或mTOR抑制后，Atg13在SDS-PAGE中没有显示出改变的迁移行为(图S7D). 因此，我们得出结论，Atg13在饥饿诱导的自噬中具有额外的功能，独立于mTORC1调节的Ulk1/2激酶活性。
Atg13功能依赖于FIP200绑定
由于Ulk1和Ulk2似乎对该细胞系的自噬诱导是不必要的，我们接下来研究了FIP200结合是否对Atg13功能至关重要，或者Atg13是否具有完全独立于Ulk1/2-Atg13-FIP200复合物的附加功能。
有趣的是，在克隆鸡Atg13的过程中，我们发现第13天mRNA在DT40细胞中交替剪接()这与之前在其他物种中的发现一致。15我们使用剪接变异体特异性引物组合通过定量实时PCR测定了这些亚型（命名为A-G）的绝对丰度(图S8A)并发现与人类亚型2相对应的全长剪接变异体A15，被高度表达(). 虽然在人类亚型1中发现的额外外显子存在于基因组水平，但它不是DT40细胞中成熟mRNA的一部分（数据未显示）。值得注意的是，这种多样的剪接变异体暗示着一种相当复杂的调控机制，因此可能解释第13天−/−具有单一亚型的细胞().
Atg13中的FIP200结合位点由外显子12编码。（A） 从DT40细胞扩增的Atg13剪接变异体（命名为A-G）的示意图。（B） 使用剪接变异体特异性引物组合通过qRT-PCR分析这些剪接变种的相对丰度（参见补充材料和方法
图S8A). （C）第13天−/−用HA标记的剪接变异体A-G重组细胞，裂解产物进行抗HA免疫沉淀，并通过免疫印迹分析Atg13和FIP200。星号表示不特定的背景带。
为了分析它们与FIP200相互作用的能力，我们转染了第13天−/−单元格和ulk1型−/−ulk2号机组−/−具有编码这些剪接变异体的HA标记版本的cDNA的细胞，以及使用抗HA琼脂糖进行免疫纯化的Atg13。亚型C的cDNA是通过分子克隆产生的，未在可检测水平上表达(). 有趣的是，FIP200只能与含有外显子12的亚型在存在的情况下成功地联合免疫纯化()以及Ulk1和Ulk2的缺失(图S8B). 这表明Atg13内的FIP200结合位点先前被Jung等人缩小到C末端区域。，15由外显子12独家编码，Atg13和FIP200之间的相互作用不依赖于Ulk1和Ulk2。因此，只有能够与FIP200相互作用的亚型（B和E）能够重建自噬缺陷表型第13天−/−与全长亚型A相同程度的细胞(). 此外，只有全长亚型A而非亚型C（Δ外显子12）能够有效地恢复自噬体的生成第13天−/−单元格(). 这些结果清楚地表明，在DT40细胞中，Atg13对基础自噬和饥饿诱导的自噬具有重要功能。似乎该功能需要Atg13的FIP200结合能力，但似乎完全独立于Ulk1和Ulk2及其mTOR的调节。
FIP200结合位点对Atg13功能至关重要。（A）第13天−/−用HA标记的剪接变异体A-G重组细胞，并在有或无10 nM BafA1的全培养基（RPMI）或EBSS中培养1小时。通过免疫印迹法分析清除的细胞裂解液中的等蛋白量的Atg13、HSP90和LC3。来自三个独立实验的LC3-II/HSP90比率表示为平均值±SEM（B）第13天−/−用编码HA-Atg13亚型A（全长）或HA-Atg13-亚型C（？外显子12）的cDNA逆转录病毒转染或用pmRFP-EGFP-rLC3稳定转染空载体。细胞在EBSS中孵育2h，并通过共焦激光扫描显微镜进行分析。在合并图像中，mRFP信号显示为红色，EGFP信号显示为绿色。三个独立实验中含有自体溶酶体的细胞百分比（>100个细胞/实验）表示为平均值±SD*p<0.05，Student t检验。
讨论
mTORC1调节的Ulk-Atg13-FIP200复合物在自噬诱导中起着关键作用。特别是，mTORC1底物Ulk1和Ulk2被认为是自噬体形成起始的主要参与者。在本报告中，我们通过靶向性破坏Ulk-Atg13-FIP200复合物在高等脊椎动物中的作用atg13，ulk1和ulk2号机组同一细胞系统中的基因座。使用这种方法，我们想提出Atg13存在一个完全独立于Ulk1/2的附加功能，原因如下：首先，Atg13的敲除清楚地证实了它对自噬诱导的必要性，因此也证实了我们系统的适用性。其次，Atg13的功能强烈依赖于它与FIP200的相互作用，强调了它们在自噬调节中的相互依赖性。第三，Ulk1和Ulk2的同时敲除与Atg13敲除细胞的表型不相似。因此，我们得出结论，Atg13和FIP200的联合作用是诱导自噬的先决条件，而Ulk1和Ulk2激酶活性的mTOR依赖性调节似乎可用于此模型系统中饥饿诱导的自噬。
酵母中自噬相关基因的鉴定以及TOR对其产物的直接调控，一度开创了自噬研究的分子时代。同时，在高等真核生物中已鉴定出这些基因的大多数同源序列。25然而，越来越明显的是，分子机制的调控比最初想象的更加异质。而酵母，秀丽线虫而果蝇只有一个Atg1基因，高等脊椎动物至少有五种与Atg1高度相关的不同激酶（Ulk1-Ulk4和STK36）。Ulk1和Ulk2是秀丽线虫未协调-51（Unc-51）。虽然Ulk1的敲除足以抑制某些细胞系中的自噬三,26相应的敲除小鼠只有轻度表型，9表明最密切相关的Ulk1和Ulk2至少具有部分冗余功能，并且可以相互补偿。Ulk1和Ulk2都可以与Atg13和FIP200相互作用，尽管具有不同的亲和力，这一观察结果进一步支持了这一点。15值得注意的是，介导这种相互作用的Ulk1和Ulk2中的C末端结构域在Ulk3、Ulk4和STK36中并不保守。27因此，在含有Atg13、FIP200和Atg101的复合体中仅发现了Ulk1和Ulk2。28
根据先前的研究结果，有人提出Atg13主要作为一种适配器分子，介导Ulk1/2与其底物FIP200之间的相互作用，并增强Ulk1/2激酶的活性。29令人惊讶的是，Ulk1和Ulk2似乎对DT40细胞的自噬诱导是不必要的。相反，第13天−/−细胞确实类似于FIP200型−/−MEF公司8并且显示出自噬流量的完全阻断。此外，Atg13的功能必然依赖于FIP200结合，因为只有那些与FIP200相互作用的亚型才能重建自噬缺陷表型第13天−/−细胞。发现Atg13中的FIP200结合位点仅由外显子12编码。因此，除了介导Ulk1/2依赖性FIP200磷酸化之外，Atg13似乎还有其他作用。
营养剥夺是自噬最有力、最快速的诱导因素之一。在酵母中，Atg13中依赖于TOR的磷酸化位点的去磷酸化是初始步骤，足以在饥饿条件下诱导自噬。30在这方面，mTOR被认为是高等脊椎动物营养状态依赖信号的主要连接点。事实上，营养缺乏后，mTOR活性立即显著降低(图S7D). 然而，尽管mTOR抑制剂治疗后立即抑制mTOR活性，但雷帕霉素和Torin1不能诱导自噬，其程度与饥饿相似(图S7A–C). 此外，饥饿或mTOR抑制后，Atg13蛋白在SDS-PAGE中没有显示任何显著的下降(图S7D). 如果Ulk-Atg13-FIP200复合物上mTOR介导的抑制释放可以完全解释饥饿后的即时自噬反应，那么人们可以预期雷帕霉素或Torin1抑制mTOR后的自噬诱导动力学反应是相同的。然而，最近发现的AMPK对Ulk1激酶活性的直接调节可能为这种差异提供了解释。31,32
不同的表型第13天−/−和ulk1/2−/−DT40细胞让我们假设Atg13在这些细胞中具有更基本的功能，与FIP200密切相关，但不一定受Ulk1或Ulk2的调节。有趣的是，因为FIP200型−/−MEF对氯化锂诱导的自噬有抵抗力8有人认为FIP200还参与mTOR依赖性通路。虽然DT40野生型细胞对LiCl没有反应（数据未显示），但这可能为观察到的DT40细胞自噬诱导独立于mTOR、Ulk1和Ulk2提供了解释。此外，在修订这份手稿期间，Cheong等人为哺乳动物细胞中Ulk1/2独立的自噬诱导途径提供了进一步证据。33虽然ulk1/2−/−MEF对氨基酸饥饿有抵抗力，它们确实对葡萄糖摄入引起的生物能量应激有反应。33因此，尽管我们不能排除细胞类型特异性特征，但可以想象，DT40细胞在饥饿时优先使用这种非常规自噬诱导途径（示意图模型见).
不同Atg13依赖性自噬诱导途径的模型。根据先前的研究结果，有人提出mTORC1在富含营养的条件下与Ulk-Atg13-FIP200复合物结合，在抑制位点磷酸化Ulk1/2和Atg13，并抑制Ulk1/2激酶活性。饥饿或直接mTORC1抑制后，这种负调控被释放，Ulk1/2在激活位点自我磷酸化，随后磷酸化Atg13和FIP200。这反过来导致自噬诱导（mTORC1-Ulk1/2轴）。在通过自噬诱导对mTORC1抑制做出反应并依赖Ulk1和Ulk2的细胞中，这种途径最有可能受到青睐。然而第13天−/−和ulk1/2−/−DT40细胞让我们假设Atg13具有更基本的功能，不一定受Ulk1或Ulk2调节，但一定需要FIP200结合能力。因此，令人惊讶的是，Atg13除了作为连接Ulk1/2及其底物FIP200的适配器分子的拟议功能外，还有一个额外的作用。可以想象有几种作用模式：（A）Atg13以激酶依赖的方式发挥作用，例如通过稳定或招募FIP200，（B）Atg13-FIP200复合物以激酶依赖方式调节，或（C）Atg17-FIP200由Ulk1/2以外的其他激酶调节。
由于Atg13-FIP200显然可以由上游信号事件触发，而不是已知的主要mTOR-Ulk1/2轴，可以想象Atg13构成了一个集成不同上游路径的中央信号节点。在酵母中，除了TOR外，已知PKA还通过直接磷酸化Atg13来调节自噬诱导。34然而，这些PKA磷酸化位点在高等脊椎动物的Atg13直系同源基因中都不保守。因此，有理由假设其他激酶对Atg13和FIP200进行额外调节以应对饥饿。然而，在最近的一份出版物中，作者未能确定Atg13中营养调节的磷酸化位点。35因此，未来的研究必须更详细地揭示这些替代诱导途径的相关性。
有关补充信息，请访问自噬的网站。
材料和方法
细胞培养
鸡DT40细胞在添加10%FCS、1%鸡血清、3 mM L-谷氨酰胺、50µMβ-巯基乙醇、50 U/ml青霉素和50µg/ml链霉素（全培养基）的RPMI 1640（BE12-702F，Lonza）中培养。为了饥饿，DT40细胞被清洗两次，并在EBSS（14155-048，Gibco）中培养指定的时间。Flp-In公司TM（TM）T-REx公司TM（TM）293细胞（R780-07，Invitrogen）稳定表达FLAG-Ulk1 wt或FLAG-Ulc1激酶死亡（D165A）和Plat-E细胞（由日本东京北村俊雄善意提供）36在补充有10%FCS、50 U/ml青霉素和50µg/ml链霉素的DMEM（4.5 g/l D-葡萄糖，E15-810，PAA）中培养。所有细胞系均保持在37°C的5%CO中2孵化器。
抗体和试剂
从Cell Signaling Technology购买了抗p70S6K（9202）、抗磷酸化p70S6K（p-Thr389）（9206）和抗LC3B抗体（2775），从Abcam购买了抗GAPDH（6C5，ab8245），从BD Transduction laboratories购买了抗HSP90（610418），从Boehringer Mannheim购买了GFP（1814460）。单克隆抗HA琼脂糖（A2095）购自Sigma。抗-Atg13抗体由Do-Hyung Kim（美国明尼阿波利斯明尼苏达大学生物化学和生物物理系）善意提供。15抗-FIP200抗体由Noboru Mizushima（日本东京医学和牙科大学生理和细胞生物学系）善意提供。8IRDye公司®800和IRDye®从LI-COR Biosciences（926-32210/11和926-68020/21）购买了680个共轭二级抗体。Torin1由Nathanel Gray（美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院达纳-法伯癌症研究所）和David Sabatini（美国麻萨诸塞州剑桥怀特黑德生物医学研究所）提供，37雷帕霉素（553210）和博莱霉素®（203408）购自Calbiochem；来自Biochrom（A2912）的G418，巴非霉素A1（B1793）、组氨酸（H6647）和麦考酚酸（M3536）。Blastidin（ant-bl-1）和puromycin（ant-pr-1）购自InvivoGen。
表达结构与逆转录病毒感染
鸡肉第13天用RT-PCR从DT40 RNA中扩增出亚型A、B、D、E、F和G的cDNA，并克隆到PCR中®-II地形®载体（Invitrogen，10351-021）。通过PCR在5′端引入HA标签的编码序列。异构体C是通过分子克隆从异构体A和D生成的英国广播公司I位点位于外显子9。Atg13中的氨基酸替换是通过定点突变产生的第13天cDNA，并通过测序进行验证。为了进行转染，将Atg13 cDNA亚克隆到逆转录病毒表达载体pMSCVpuro（Clontech，PT3303-5）中，通过生态意大利。pMSCV-mRFP-EGFP-rLC3表达载体是通过克隆来自pmRFP-EGFP-rLC3（由日本大阪遗传系Tamotsu Yoshimori善意提供）的mRFP-EGFP-rLC 3 cDNA，通过Nhe公司我/生态RI进入血红蛋白pMSCVpuro的I站点。或者，将细胞转染德拉III通过电穿孔将pmRFP-EGFP-rLC3线性化，并在含有2 mg/ml G418的培养基中选择。先前已经描述了pMSCV-mCitrine-chLC3B表达载体。17为了生产重组逆转录病毒，使用FuGENE转染试剂用基于pMSCV的载体转染Plat-E细胞（Roche，11988387001）。MMLV用VSV-G 1×10进行假型6用含有3µg/ml Polybrene（Sigma，H9268）的逆转录病毒上清液培养DT40细胞，并在含有0.5µg/ml嘌呤霉素的培养基中选择。
DT40敲除细胞系的建立
对于Atg13靶向载体，从DT40基因组DNA中扩增出一个6kb片段，并克隆到pBluescript II SK（-）载体中。外显子1中的起始密码子发生突变，并将组氨酸（hisD）或短杆菌素（bsr）抗性盒插入新生成的盒中巴姆HI站点。通过在250 V和975µF下电穿孔，用线性化靶向载体转染DT40细胞，并在1 mg/ml组氨酸和50µg/ml速溶素中进行筛选。附件13-通过基因组PCR和免疫印迹技术筛选缺陷克隆。有关更多详细信息和生成乌尔克1和Ulk2公司靶向载体见补充材料和方法。
免疫印迹和免疫纯化
DT40细胞在含有10 nM巴非霉素A的全培养基或EBSS中培养1或DMSO作为对照，密度为1×106细胞/ml，持续指定的时间。在溶解缓冲液中溶解细胞[10 mM TRIS-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 mM EDTA，1%Triton X-100，10 mM NaF，2.5 mM NaPP，10µM Na2哞4，1 mM钠三VO（旁白）4和蛋白酶抑制剂（P2714，Sigma）]，并通过16000 g离心20 min进行澄清。Bradford测定的总蛋白量相等，在8–15%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到PVDF膜（Millipore）。使用指定的主要抗体和适当的IRDye进行免疫印迹分析®800或IRDye®680结合二级抗体（LI-COR Biosciences）。奥德赛侦测到信号®红外成像系统（LI-COR Biosciences）并使用ImageJ 1.41进行量化(http://rsb.info.nih.gov/ij/). 对于免疫净化，细胞在IP缓冲液中溶解[40 mM HEPES pH 7.5，2 mM EGTA，0.3%CHAPS，10 mM NaPP，1 mM Na三VO（旁白）4和蛋白酶抑制剂（P2714，Sigma）]以及等量的总蛋白与单克隆抗HA-糖（A2095，Sigma]）孵育过夜。用裂解缓冲液（不含蛋白酶抑制剂）洗涤珠子四次，在样品缓冲液中煮沸，上清液进行SDS-PAGE。
定量实时PCR
使用ABI Prism 7000序列检测系统（Applied Biosystems）和含有SYBR Green的qPCR Mastermix Plus（Fermentas，K0222）进行定量实时RT-PCR分析。1×10的总RNA6使用NucleoSpin分离细胞TM（TM）RNA II试剂盒（Macherey&Nagel，740955.50）。cDNA由1µg总RNA和200 U RevertAid H Minus生成TM（TM）逆转录酶（酵母菌，EP0452）、50µM随机六聚体（酵母酶，SO142）、400µM dNTP（酵母杆菌，R0192）和1.6 U/µl RiboLockTM（TM）RNase抑制剂（发酵剂，EO0381）符合制造商的建议。将80/8/0.8 ng的cDNA（重复）应用于qRT-PCR分析，并在300 nM引物的存在下扩增（序列见补充资料)标准温度曲线（2分钟50°C，10分钟95°C，40次循环15秒95°C和1分钟60°C）。对于剪接变体的绝对定量，每个变体的cDNA标准由生态RI消化相应质粒，从琼脂糖凝胶中分离并通过分光光度法定量。使用以下公式计算标准DNA分子的拷贝数：X（g/µl）DNA/[DNA片段长度（bp）×660（g/摩尔）]×6.022×1023=Y（份数/µl）。标准曲线（C图T型值/与拷贝数对数的交叉点）是从1×10的连续10倍稀释中生成的10至1×100每个点的副本数。检测限为Ulk1、Ulk2、Ulk3、Ulk 4每反应10个拷贝，STK36和18S rRNA每反应100个拷贝。样品中检测到的绝对拷贝数结果归一化为18S rRNA的绝对拷贝数量，以解释RT-PCR效率，并显示为每1×10个拷贝数9复制18S rRNA。给出三种稀释液（每反应80/8/0.8 ng cDNA）的平均值±SD。
共焦激光扫描显微镜
在饥饿条件下，细胞用EBSS清洗一次，再悬浮在EBSS中，然后接种到装有隔间的盖玻片上（Nunc）。2h后，在徕卡TCS SP II共焦激光扫描显微镜上分析细胞。作为对照，将细胞重新悬浮在Krebs Ringer溶液中[10 mM HEPES（pH 7.0），140 mM NaCl，4 mM KCl，1 mM MgCl2，1 mM氯化钙2和10 mM葡萄糖]。EGFP和mCitrine在488nm处被激发，mRFP在543nm处被激发。
透射电子显微镜
如前所述进行透射电子显微镜检查。38,39简而言之，DT40细胞在1×10密度的正常生长培养基或EBSS中培养637°C下每毫升细胞数2小时。收集细胞，用预热的PBS清洗，用温热的Karnovsky溶液在37°C下固定10分钟，并在4°C下保存。为了进行电子显微镜分析，将细胞在37°C下包埋在3.5%琼脂糖中，在室温下凝固，并再次固定在Karnovsky溶液中。后固定基于1.0%四氧化锇（含1.5%K-亚铁氰化物）在0.1M二甲氨基甲酸盐缓冲液中放置2h。按照以下标准方法，将块体嵌入到缩水甘油醚中，并使用超微切片机（Ultracut）切割。将超薄切片（30 nm）安装在铜网格上，并使用蔡司LIBRA 120透射电子显微镜（卡尔蔡司）在120 kV下进行分析。
鸣谢
我们感谢北村俊雄提供Plat-E细胞，Do-Hyung Kim提供Atg13抗体，Nathanel Gray和David Sabatini提供Torin1，Tamotsu Yoshimori提供pmRFP-EGFP-rLC3构建，Noboru Mizushima提供FIP200抗体和有益的讨论。我们感谢Maria Deak（英国邓迪大学MRC蛋白质和磷酸化单元）和信号转导治疗部（邓迪大学）的蛋白质纯化团队提供GST-Atg13。我们感谢Dario Alessi仔细阅读了手稿并提出了有益的建议。我们还感谢塔苏拉·普罗卡斯·塞尚的有益讨论。这项工作得到了德国联邦医学研究院SFB 773（授予S.W.、B.S.和M.S.）、GRK 1302（授予S.W和B.S.）以及图宾根医学院临床研究跨学科中心（授予B.S.，Nachwuchsgruppe 1866-0-0）和英国医学研究理事会（授予D.G.C.）的资助。信号转导治疗部（邓迪大学）得到了以下制药公司的支持：阿斯利康、勃林格殷格翰、葛兰素史克、默克-塞罗诺和辉瑞。
工具书类
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