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.2010年2月；30(4):1049-58.
doi:10.1128/MCB.01344-09。 Epub 2009年12月7日。

Tor直接控制Atg1激酶复合物来调节自噬

神田佳彦（Yoshiaki Kamada） 1, 吉野贤治, Chika Kondo公司, 川端智子, 诺里科·大弘（Noriko Oshiro）, 川端康成（Kazuyoshi Yonezawa）, Ohsumi吉诺里
附属公司

Tor直接控制Atg1激酶复合物来调节自噬

神田佳彦（Yoshiaki Kamada）等人。 分子细胞生物学. 2010年2月.

摘要

自噬是细胞在饥饿状态下生存所必需的大量蛋白水解过程。自噬是通过灭活雷帕霉素敏感的Tor复合物1（TORC1）（一种蛋白激酶复合物，调节细胞对营养条件的生长），通过营养剥夺诱导的。然而，TORC1控制自噬的机制和TORC1活性的直接靶点尚不清楚。Atg13是Atg1激酶复合物上游自噬的一个重要调节成分，这里我们证明酵母TORC1在多个Ser残基处直接磷酸化Atg13。此外，不可磷酸化的Atg13突变体的表达绕过了TORC1途径，通过激活在营养丰富条件下生长的细胞中的Atg1诱导自噬。我们的研究结果表明，TORC1对Atg1复合物的直接控制可诱导自噬。

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图1。
图1。
Atg13磷酸化位点的测定和预测。（A和B）磷酸肽426-YSSSFGNIRRHpSpSVK-440（A）和643-SSIpSPRpSIDSSSFIK-659（B）的产物离子质谱，从His6-标记的Atg13蛋白。在这些光谱中，多电荷离子峰[M+n个【H】n个+，ESI质谱转换为单电荷离子峰，[M+H]+（质子化分子）。仅显示了单同位素离子峰。同位素离子峰未显示。（C） 用质谱法绘制Atg13的磷酸化位点。显示了通过MS/MS分析确定的四个Ser残基（顶部）和与确定的Ser位点类似的假定磷酸化位点（底部）。（D） Atg13的免疫印迹。用雷帕霉素（Rapa）（0.2μg/ml）处理表达所示Atg13蛋白的YEPD生长细胞（OND88）1h。通过免疫印迹法评估Atg13的磷酸化状态。
图2。
图2。
TORC1直接磷酸化Atg13在体外.（A）检测免疫沉淀TORC1。标志Kog1是免疫沉淀的野生型哈检测免疫复合物中包含的Tor1（WT）和激酶缺失D2294E突变体（KD）。使用未标记Kog1的控制实验结果显示在车道1中。α、 反。（B）体外TORC1激酶分析。与面板A一样隔离的TORC1用于在体外以4μg重组触发因子（TF）融合的Atg13（野生型[第1至3道]或Atg13-8SA[第4至6道]）或TF（第7道）为底物进行激酶分析。示出了放射自显影（激酶测定）和考马斯蓝染色（CBB）的结果。（C） 使用各种Atg13结构体进行TORC1激酶分析。使用指定的TF-Atg13蛋白进行TORC1分析。TF-Atg13-4SAb和TF-Atg17-7SAb迁移速度比野生型快，可能是因为它们在大肠杆菌细胞。
图3。
图3。
Atg13-8SA促进Atg1复合物形成、Atg1激活和PAS组织。（A） Atg1复合物的形成。含有所示p416的细胞（YYK412）镀锌1[ATG13公司]在SCRaf中生长的质粒在SCRafGal中孵育2小时以诱导Atg13蛋白。Atg13和Atg17与in共免疫沉淀哈免疫印迹法检测Atg1。以髓磷脂碱性蛋白（MBP）为底物检测Atg1激酶的催化活性。星号表示抗-HA腹水识别的总细胞裂解物中的非特异性带。α、 反。（B） Atg蛋白的PAS组装。电池（TMK625，第11天将生长在SCRaf中的Δ）转移到SCRafGal中1 h以诱导Atg13。通过荧光显微镜观察GFP-Atg17和mCherry-Atg8。
图4。
图4。
Atg13-8SA在正常生长的细胞中诱导自噬。（A） 表达Pho8Δ60（OND88）和YYK757(atg2Δ）含有所示p416的细胞镀锌1[ATG13公司]质粒在SCRaf中生长并转移到SCRafGal。碱性磷酸酶（ALP）活性（U，实线）和细胞生长（OD600，虚线）进行监测。（B） 含有p306的Pho8Δ60表达细胞镀锌1[ATG13公司-8SA公司]质粒在用SCRafGal孵育4小时或用缺氮培养基[SRaf（−N）]孵育4h之前或之后进行ALP分析。显示了每个样本的ALP活性。误差条表示三个独立实验的标准偏差[SD]。（C） 自噬体的积累。用于A组的细胞在含有1 mM PMSF（抑制自噬体降解）的SCRafGal中培养6 h。自噬小体通过相控显微镜观察。（D） 用于面板B.Bar的细胞的电子显微镜，1μm。
图5：。
图5：。
Atg13-8SA的表达模拟TORC1失活以诱导自噬。（A） 用0.2μg/ml雷帕霉素（Rapa）处理SCRaf中生长的细胞4小时，在SCRafGal中培养4小时，或在SCRaf Gal中孵育2小时，然后用0.2μg/ml雷帕霉素处理2小时。如图3A所示，检测了Atg1复合物的形成和Atg1激酶的活性。α、 反。（B） 表达Pho8Δ60的细胞携带指定的p306镀锌1[ATG13公司]质粒按A组处理，并进行ALP分析。误差条表示三个独立实验的SD。
图6。
图6。
Atg13构建物诱导自噬。（A） 表达Pho8Δ60的细胞含有指示的p416镀锌1[ATG13公司]质粒在与SCRafGal孵育4小时之前或之后进行ALP分析。误差条表示至少三个独立实验的SD。（B） 免疫印迹法检测Atg13蛋白。（C） 的摘要在体外使用各种Atg13构建物的TORC1分析和ALP分析。阴影框表示Atg1-绑定站点。
图7。
图7。
Atg13-8SA对其他Atg蛋白的影响。（A） Atg13-8SA表达对Atg蛋白表达无显著影响。通过免疫印迹法评估A组所用细胞中的Atg蛋白水平。星号表示Atg8的磷脂酰乙醇胺结合形式。（B） 对的要求自动液位计Atg13-8SA表达诱导的自噬基因。携带p416的突变细胞镀锌1[ATG13公司-8SA公司]质粒在与SCRafGal孵育4小时之前或之后进行ALP分析，以诱导Atg13-8SA表达。误差条表示三个独立实验的SD。
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