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.2009年3月20日；284(12):8023-32.
doi:10.1074/jbc。M900301200。 Epub 2009年1月15日。

雷帕霉素抑制剂的ATP竞争哺乳动物靶点揭示了mTORC1的雷帕霉素耐药功能

卡森·C·托林 1, 承安康, 张在元, 刘庆松, 张建明, 易高, 劳丽·J·赖克林, 泰博·西姆, 大卫·M·萨巴蒂尼, 纳撒尼尔·S·格雷
附属公司

雷帕霉素抑制剂的ATP竞争哺乳动物靶点揭示了mTORC1的雷帕霉素耐药功能

卡森·C·托林等。 生物化学杂志. .

勘误表in

摘要

雷帕霉素（mTOR）激酶的哺乳动物靶点是两种功能不同的复合物mTORC1和mTORC2的催化亚单位，它们协同促进细胞生长、增殖和存活。雷帕霉素是一种有效的变构mTORC1抑制剂，作为免疫抑制剂和抗癌药物在临床上得到应用。在这里，我们发现Torin1是一种高效和选择性的ATP-竞争性mTOR抑制剂，直接抑制这两种复合物，其对细胞生长和增殖的损伤程度远大于雷帕霉素。令人惊讶的是，这些效应与mTORC2抑制无关，而是因为抑制了mTORC1的雷帕霉素耐药功能，而这些功能是cap依赖性翻译和抑制自噬所必需的。这些作用至少部分由4E-BP1的mTORC1依赖性和雷帕霉素抗性磷酸化介导。我们的发现对雷帕霉素完全抑制mTORC1的假设提出了质疑，并表明mTORC1-激酶活性的直接抑制剂可能比雷帕霉素更成功地抑制依赖于mTORC-1的肿瘤。

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数字

图1。
图1。
Torin1是一种有效且选择性的mTOR抑制剂。 A、，托林1抑制mTORC1和mTORC2在体外.纯化了mTORC1和mTORC2来自稳定表达FLAG-Raptor的HEK-293T和表达分别为FLAG-Protor-1。在FLAG纯化后，每个复合物受到在体外使用S6K1作为底物进行激酶分析mTORC1和Akt1作为mTORC2的底物。分析结果由所示蛋白质和磷酸化状态的免疫印迹。B中，Torin1是一种ATP竞争性抑制剂。这个在体外纯化的mTORC1对S6K1的激酶活性在20牛顿米Torin1和ATP浓度增加，如图所示。然后通过免疫印迹分析所示蛋白质和磷酸化状态。C、，Torin1是一种强效mTORC1和mTORC2细胞中的抑制剂。MEF（p53-/-)接受了越来越多的治疗Torin1或双mTOR/PI3K抑制剂PI-103和BEZ-235的浓度1h，然后通过免疫印迹分析指示的蛋白质和磷酸化状态。D、，Torin1对PI3K几乎没有影响mTOR被完全抑制的浓度。实验是按中的方式执行C类使用mLST8-null MEF和Akt磷酸化用免疫印迹法测定Thr-308。在mLST8-null MEF中，mTORC2为无活性，Akt Ser-473被组成性去磷酸化，因此PDK1介导的Thr-308磷酸化仅反映PI3K活性。E、，Torin1对相关激酶的mTOR具有选择性。集成电路50Torin1的值由以下公式确定在体外激酶分析mTOR（3 n米)，hVps34（3μ米)，PI3K-α（1.8μ米)，DNA-PK（1.0μ米)和ATM（0.6μ米). 集成电路50mTOR的PI-103值（120n个米)，PI3K-α（100 n米)，DNA-PK（40 n米)通过相同的分析测定。集成电路50PI-103的值hVps34（10μM）和ATM（1.0μ米)之前已确定(21).F、，Torin1是相对于其他PI3K亚型，mTOR具有选择性。电子计算机50值为使用Invitrogen Adapt测定指示的PI3K亚型平台。欧盟委员会50mTOR使用基于细胞的LanthaScreen平台。
图2。
图2。
mTOR抑制通过mTORC2-依赖机制。 A、，Torin1抑制mTOR，但雷帕霉素不能阻止野生型MEF的增殖。MEF公司（第53页-/-)细胞在载体存在下生长(蓝色)，50牛顿米雷帕霉素(橙色)，或250n个米托林1(绿色)持续4天。细胞增殖使用CellTiterGlo在指定的时间点测量三次活性测定。B中，Torin1导致G1/S细胞周期阻滞在野生型MEF中。MEF（p53-/-)细胞用载体处理（二甲基亚砜），50 n米雷帕霉素(拉帕)，或250 n米Torin1持续48小时。然后收集细胞，用碘化丙啶染色，并流式细胞仪分析。C、，标准化细胞大小分布Torin1和雷帕霉素治疗的野生型MEF。MEF（p53-/-)单元格用车辆进行治疗(蓝色，平均17.81μm），50 n米雷帕霉素(橙色，平均值17.58），或250 n米托林1(绿色，平均16.46μm）24小时。使用粒子计数器和显示为直方图。D、，实验是按中的方式执行A类使用Rictor-/-，p53-/-MEF公司。E、，实验按照B类使用里克托-/-，p53-/-MEF公司。F、，实验是按中的方式执行C类使用Rictor-/-，p53-/-MEF公司。用载体处理细胞(蓝色，平均直径17.85μm），50n个米雷帕霉素(橙色，平均直径17.33μm），或250n个米托林1(绿色，平均直径16.24μm）。
图3。
图3。
Torin1抑制耐雷帕霉素。 A、，Torin1但不是雷帕霉素(拉帕)导致LC3从细胞质重新定位到自噬体。野生型（第53页-/-)或Rictor-null（p53-/-)MEF是暂时的转染GFP-LC3并用载体处理(车辆)（二甲基亚砜），50n个米雷帕霉素，或250n米Torin1 3小时后已修复并处理。细胞也用Hoechst染色以显示细胞核并在×63处成像。B中，氨基酸饥饿和Torin1，但不是雷帕霉素会导致LC3降解。野生型（p53-/-)和Rictor无效（p53-/-)MEF用载体（DMSO）治疗，50n个米雷帕霉素，250 n米Torin1或生长在氨基酸中(AA公司)-自由条件下0、1、3或6小时。细胞在指示时间点并进行免疫印迹分析。自噬的诱导导致本机LC3B降级(LC3B-I型)蛋白质和快速运行的lipidated版本的瞬态累积(LC3B-II型).C、，Torin1抑制全局蛋白质合成通过雷帕霉素耐药和mTORC2依赖性过程。野生型（第53页-/-)和Rictor无效（p53-/-)MEF用车辆（DMSO），50 n米雷帕霉素(说唱)，250牛顿米Torin1或10μg/ml环己酰亚胺(Chx公司)2.5小时，然后脉冲具有35S-标记蛋氨酸和半胱氨酸30分钟35S掺入量通过闪烁计数测定。测量一式三份误差线表明标准偏差。
图4。
图4。
mTORC1调节4E-BP1磷酸化并与eIF-4E结合揭示了雷帕霉素耐药功能。 A、，磷酸化Thr-37/46和Ser-65的4E-BP1依赖于mTORC1，但对雷帕霉素。野生型（p53-/-)和Rictor-null（p53-/-)用指定浓度的Torin1或雷帕霉素处理MEF1小时，然后裂解。细胞裂解物通过抗体免疫印迹分析特定于指示的蛋白质或磷酸化状态。B中，Torin1将4E-BP1与eIF-4E的结合量增加到如此程度超过雷帕霉素的作用。野生型（p53-/-)和Rictor无效（p53-/-)MEF用载体（DMSO）治疗，50n个米雷帕霉素，或250n米Torin1在裂解前1小时。使用7-甲基-GTP-Sepharose从裂解物中纯化eIF-4E，并通过所示蛋白质的免疫印迹。C、，磷酸化4E-BP1上的Thr-36/47需要猛禽，但不需要Rictor。MEF（p53-/-)感染慢病毒，表达对照、猛禽特异性或蓖麻毒素特异性shRNAs。细胞生长4天，然后用车辆（DMSO），50 n米雷帕霉素，或250n米Torin1代表1h.然后使用特异性抗体通过免疫印迹分析细胞裂解产物指示的蛋白质或磷酸化状态。D、，延长mTOR抑制改变关键细胞周期调节因子的表达。野生型（第53页-/-)和Rictor-null（p53-/-)MEF用车辆（DMSO），50 n米雷帕霉素，或250n米Torin1代表48h.然后使用特异性抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物用于指示的蛋白质。E、，Torin1阻止人类肿瘤细胞系中的雷帕霉素耐药位点。MCF7、HCT116、HeLa和用载体处理HEK-293T细胞系(车辆)，雷帕霉素(说唱)（50或250牛顿米)，或Torin1（50或250 n米)1小时，然后通过免疫印迹分析指示的蛋白质和磷酸化状态。F、，Torin1增加4E-BP1的量在人类癌细胞系中与eIF-4E结合。处理MCF7和HCT116细胞带车辆（DMSO），50 n米雷帕霉素，50 n米Torin1，或250牛顿米Torin1在裂解前48小时。eIF-4E纯化自使用7-甲基-GTP-脑葡萄糖裂解产物并通过免疫印迹分析指示的蛋白质。
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