自噬。2011年10月；7(10): 1212–1221.
ULK1抑制mTORC1激酶活性和细胞增殖
生物化学系；分子生物学和生物物理学；明尼苏达大学；美国明尼阿波利斯
通讯作者。†现任地址：功能食品技术研究组；韩国食品研究所；大韩民国
2011年4月5日收到；2011年6月30日修订；2011年7月12日接受。
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补充材料
GUID:C2023BFD-B33C-45C3-8CA2-5899416805BC
摘要
ULK1（Unc51-like kinase，hATG1）是一种Ser/Thr激酶，在饥饿诱导自噬反应中起关键作用。ULK1被雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点磷酸化并负调控。先前的研究表明，ULK1不仅是mTORC1的下游效应器，而且是mTORC 1信号的负调节器。1–三在这里，我们研究了ULK1如何调节mTORC1信号传导，并发现ULK1抑制mTORC2的激酶活性和细胞增殖。ULK1或其同源物ULK2的缺失或敲除增强了mTORC1信号传导、细胞增殖率和细胞质量积累，而ULK1的过度表达则具有相反的作用。敲除ULK1和ULK2的结合伙伴Atg13，模拟了ULK1或ULK2缺陷或敲除的影响。当ULK1或ULK2缺失或被敲除时，胰岛素和亮氨酸都在更大程度上刺激了mTORC1信号。相反，Atg5缺乏对mTORC1信号传导和细胞增殖没有显著影响。ULK1敲除对mTORC1信号的刺激作用即使在没有结节性硬化复合物2（TSC2）的情况下也会发生，TSC2是mTORC2信号的负调控因子。此外，发现ULK1可以结合猛禽，诱导其磷酸化，并抑制mTORC1的激酶活性。这些结果表明，ULK1以独立于Atg5和TSC2的方式负调控mTORC1的激酶活性和细胞增殖。ULK1对mTORC1的抑制可能对通过优化细胞能量利用来协调调节细胞生长和自噬很重要。
关键词：ULK1、ULK2、Atg5、猛禽、mTOR
介绍
营养素缺乏、细胞应激和生长因子的有限可利用性等不利的生长条件会诱导真核细胞发生大规模自噬（以下简称自噬）。通过细胞成分的降解，自噬为细胞存活或分化过程中的细胞重构提供能量。4–8自噬受调节细胞生长的mTORC1途径控制。9–11在有利的生长条件下，mTORC1刺激蛋白质合成和细胞生长，并抑制自噬。在不利的生长条件下，mTORC1被抑制，导致细胞生长抑制和自噬诱导。三,11–15尽管自噬依赖于mTORC1意味着自噬和细胞生长之间存在密切的串扰，但串扰的确切机制和功能意义仍不清楚。定义这种机制对于理解自噬在细胞生长和癌症中的作用非常重要，这将有助于制定更好的预防或治疗癌症的策略。
mTORC1通过ULK1磷酸化抑制自噬。三,12–14,16ULK1及其同源物ULK2是诱导自噬的关键分子。三,13,14,16–20尽管ULK在自噬诱导中的确切功能尚不清楚，但已有研究表明，ULK1参与磷脂酰肌醇-3-激酶III类（PI3KC3）的上游，PI3KC是自噬诱发的另一个关键介质，调节吞噬细胞的形成，吞噬细胞是自噬体的前体形式。三,12–14,19–21因此，ULK1被认为是介导mTORC1信号传导至PI3KC3自噬机制的关键分子。ULK1与Atg13、FIP200和Atg101相互作用形成蛋白质复合物。三,12–14,19,20,22,23ULK2还与相同的蛋白质结合，形成不同的蛋白质复合物。最近的研究表明，mTORC1和5′AMP活化蛋白激酶（AMPK）结合并磷酸化ULK1。16,18,24mTORC1和AMPK对ULK1活性有相反的影响。ULK1的AMPK磷酸化刺激ULK1和自噬诱导，而ULK1 mTORC1磷酸化阻止AMPK与ULK1结合，从而抑制自噬的诱导。16
尽管ULK1在很大程度上可以调节自噬诱导，但最近的研究表明，ULK1及其同源物Atg1在黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫能负性调节mTORC1信号。1–三哺乳动物细胞中的ULK1缺乏或ULK2敲低以及苍蝇中Atg1基因的缺失显示增加了mTORC1的关键下游靶点S6激酶（S6K1）的磷酸化。1,三果蝇脂肪体中Atg1的过度表达显著降低了S6K1磷酸化和细胞大小。2Atg1和其他自噬元件对细胞生长的调节也在秀丽线虫.25这些结果表明，ULK1/Atg1通过一种可能在秀丽线虫果蝇和哺乳动物。
在本研究中，我们试图确定ULK1调节mTORC1的机制。我们发现，ULK1、ULK2或Atg13的缺失或敲除，而不是Atg5的缺失，增强了mTORC1信号传导、细胞增殖率和细胞质量的积累。我们发现ULK1结合猛禽，诱导其磷酸化并抑制mTORC1的激酶活性。这些发现表明ULK1和mTORC1之间存在相互关系。这种调节可能依赖于ULK1和mTORC1之间的直接相互作用，并且独立于Atg5介导的自噬。mTORC1和ULK1之间的相互调节对于协调细胞生长和自噬对细胞能量和应激条件的反应可能很重要。
结果
ULK负调节mTORC1。
先前的研究表明，ULK1、ULK2及其果蝇同源物对哺乳动物细胞和果蝇中的mTORC1信号有负面影响。1–三我们通过显示S6K1在Thr389（mTORC1磷酸化的位点）的磷酸化在ULK1中高度增加来证实上述结果−/−与ULK1阳性对照细胞相关的MEF和ULK1-silenced 293T细胞(). 我们还发现，293T细胞中Atg13或ULK2的敲除增强了S6K1的磷酸化(). 这一结果表明，ULK1和ULK2负性调节mTORC1信号传导，其负效应可能通过与Atg13的相互作用来介导。与ULK1对S6K1磷酸化的负面影响一致，293T细胞中ULK1的过度表达降低了S6K1的磷酸化(). Atg5缺乏的MEF未观察到S6K1磷酸化的增加(). 这一结果表明，ULK以独立于Atg5介导的自噬的方式负调控mTORC1信号。
ULK1、ULK2和Atg13，而不是Atg5，负调节mTORC1信号。（A） 敲除ULK1、ULK2和Atg13，但不敲除Atg5，增加了mTORC1信号。293T细胞通过Atg13、ULK1、ULK2或干扰shRNA（对照）转导。通过蛋白质凝胶印迹分析s6K1（p-Thr389）的磷酸化和蛋白质的表达水平。β-actin为负荷对照。（B） ULK1的过度表达抑制了S6K1的磷酸化。细胞裂解物是从293T过度表达myc标记ULK1的细胞或通过模拟载体转导的细胞中获得的。通过蛋白质凝胶印迹分析内源性S6K1（p-Thr389）的磷酸化状态。（C） ULK1缺乏增加了亮氨酸刺激的S6K1磷酸化。将ULK1 MEF在不含亮氨酸的RPMI培养基中培养40分钟，然后用亮氨酸（52µg/ml）补充细胞不同时间。通过蛋白凝胶印迹分析S6K1的磷酸化状态（p-Thr389）和表达水平。3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）是一种负荷控制。（D） ULK1缺乏增加了胰岛素刺激的S6K1磷酸化。在不含血清的DMEM中培养ULK1 MEF过夜，并用胰岛素（10 nM）处理不同的培养时间。通过蛋白凝胶印迹分析S6K1（p-Thr389）和Akt（p-Ser473）的磷酸化状态及其表达水平。β-肌动蛋白作为负载对照进行监测。（E） ULK1敲除增加293T细胞中S6K1的磷酸化。如（D）中所述，用胰岛素（100nM）处理由ULK1 shRNA或扰乱的shRNA转导的293T细胞（对照）。通过蛋白质凝胶印迹分析蛋白质的磷酸化状态和表达水平。（F） ULK2敲除增加了293T细胞中S6K1的磷酸化。用胰岛素处理ULK2 shRNA或打乱shRNA（对照）转导的细胞，并按所述（D）分析S6K1的磷酸化状态。（G） Atg5缺乏不会增加S6K1磷酸化。如（D）所述，用胰岛素治疗Atg5 MEF。
为了进一步了解ULK如何调节mTORC1信号，我们分析了ULK缺乏或敲除对S6K1磷酸化对亮氨酸和胰岛素反应的影响。补充亮氨酸在更大程度上增加了ULK1中S6K1的磷酸化−/−MEF超过ULK1+/+MEF公司(). 补充亮氨酸10分钟后，S6K1磷酸化降低，表明S6K1介导的负反馈环26–28在ULK1-缺陷MEF中可能完好无损。胰岛素也在更大程度上刺激了ULK1中S6K1的磷酸化−/−MEF超过ULK1+/+MEF公司(). ULK1中的S6K1磷酸化−/−在胰岛素刺激的60分钟内，MEF保持高水平，然后下降到基础水平。另一方面，ULK1中的S6K1磷酸化+/+MEF在较短的时间内降至基础水平(). 这一结果表明，ULK1在某种程度上参与了胰岛素对S6K1磷酸化的负反馈抑制。值得注意的是，在缺乏亮氨酸或胰岛素的情况下，ULK1缺陷MEF或ULK2-silenced 293T细胞中S6K1磷酸化的基础水平较高(和图S1)表明在饥饿条件下，ULK是完全抑制mTORC1所必需的。综上所述，这些结果表明，ULK不仅在饥饿状态下，而且在良好的生长条件下（例如高水平的氨基酸和胰岛素）抑制mTORC1信号。
ULK1以独立于Akt和Atg5的方式负调控mTORC1信号。
我们想知道，ULK1缺陷细胞中S6K1磷酸化的增加是否是由于Akt上调，Akt正向调节mTORC1。我们发现，胰岛素刺激了Akt在Ser473的磷酸化，这反映了在ULK1中Akt的活化程度较低−/−MEF超过ULK1+/+MEF公司(). 尽管Akt磷酸化较低，S6K1磷酸化较高，但胰岛素受体底物-1（IRS-1）的水平，即S6K1针对磷酸化和降解的蛋白质，26–28在ULK1中增加−/−与ULK1相比的MEF+/+MEF公司(图S1). 尽管尚不清楚ULK1缺乏是如何抑制Akt激活并增加IRS-1水平的，但该结果表明ULK1缺乏以独立于Akt的方式诱导mTORC1激活。
与对照细胞相比，胰岛素在ULK1-silenced 293T细胞中刺激S6K1磷酸化的程度更大(). 与MEF相比，293T细胞对胰岛素的S6K1磷酸化反应持续时间更长。在293T细胞中敲低ULK2也获得了类似的结果(). 与使用ULK1 MEF的结果一致，293T细胞中的ULK1敲除降低了Ser473胰岛素刺激的Akt磷酸化(). 相反，Atg5敲除对胰岛素刺激的S6K1和Akt磷酸化没有显著影响(). 综上所述，这些结果表明，ULK对mTORC1信号传导的负面影响独立于Akt活性和Atg5介导的自噬。
ULK负调节细胞增殖和细胞质量积累。
由于mTORC1是细胞生长和增殖的关键调节因子，29,30我们研究了ULK对这些过程的影响。敲除HeLa细胞中的ULK1可显著提高细胞增殖率1.5-2倍(). 同样，HeLa细胞中Atg13或ULK2的敲除与ULK1的敲除促进细胞增殖的程度相似(). 在293T细胞中敲除ULK1也显著增加了1.3倍的细胞增殖率(). 我们还观察到ULK1的细胞增殖率增加了2倍−/−与ULK1相比的MEF+/+MEF公司(). 与ULK1对细胞增殖的负面影响一致，ULK1在293T细胞中的过度表达显著降低了细胞增殖率(). 相比之下，我们无法检测到Atg5之间的细胞增殖率有显著差异−/−和附件5+/+MEF公司(). 综上所述，这些结果表明ULK1、ULK2及其相关蛋白Atg13以独立于Atg5介导的自噬的方式负调控细胞增殖。
ULK1、ULK2和Atg13，而不是Atg5，负调节细胞增殖和细胞质量积累。（A） 敲除HeLa细胞中的ULK1、ULK2或Atg13可提高细胞增殖率。使用慢病毒载体，通过shRNA稳定地转导ULK1、ULK2、Atg13或扰乱序列（对照）的HeLa细胞。在第1天、第2天和第3天计算细胞数（有关详细信息，请参阅材料和方法）。值为对照细胞和每个shRNA转导细胞之间的平均值±标准值*p<0.01。（B） 敲除293T细胞中的ULK1可提高细胞增殖率。（c） MEF中ULK1缺乏可促进细胞增殖。（D） 293T细胞中ULK1过度表达降低了细胞增殖率。293T细胞由编码myc标记ULK1的质粒或空载体转导。（e） MEF中Atg5缺乏对细胞增殖没有显著影响。（F） 敲除HeLa细胞中的ULK1或Atg13可减小细胞大小。分析shRNA-转导的HeLa细胞的细胞大小（详见材料和方法）。打乱、ULK1-和Atg13-shRNA转导的细胞的平均直径分别为16.23±0.11、15.02±0.07和14.99±0.04µm。（G） 293T细胞中ULK1、ULK2和Atg13的敲除降低了细胞大小。打乱、ULK1、Atg13和ULK2 shRNA转导细胞的平均直径分别为14.72±0.08、14.35±0.11、14.25±0.09和14.10±0.13µm。（H） MEF中ULK1缺乏导致细胞尺寸减小。ULK1的细胞平均直径分别为17.42±0.14和17.17±0.09µm+/+和ULK1−/−分别为MEF。（I） 在MEFs中缺乏Atg5使细胞大小略有增加。Atg5的细胞平均直径分别为17.55±0.12和17.86±0.10µm+/+和Atg5−/−分别为MEF。（J） 敲除HeLa细胞中的ULK1、ULK2或Atg13增加了总细胞质量。总细胞质量是使用第3天的细胞数量和细胞体积计算的。将总细胞质量的平均值±标准差转换为相对于对照组细胞质量的百分比值*对照细胞和每个shRNA-转导细胞之间p<0.05。（K） 293T细胞中ULK1的敲除增加了总细胞质量。数据分析如（J）所述。（五十） MEF中ULK1的缺失增加了总细胞质量。（M）MEF中Atg5的缺失略微增加了细胞总质量。
细胞增殖率的增加伴随着细胞尺寸的急剧减小。当ULK1、ULK2或Atg13被敲除时，所使用的所有三种细胞类型（HeLa、293T和MEF）都显示出细胞尺寸减小(). 该结果与之前的报告一致，即Unc-51基因敲除秀丽线虫蠕虫细胞尺寸减小。25尽管ULK1、ULK2或Atg13缺乏或敲除导致细胞尺寸减小，但由于细胞数量增加，细胞总质量显著增加(). 敲除或缺乏ULK1、ULK2或Atg13会使细胞总质量增加20-45%。相比之下，MEF中Atg5缺乏对细胞大小和总细胞质量没有显著影响(和M). 这些结果与ULK1/2-Atg13复合物在mTORC1信号负调控和细胞质量积累中的作用一致。
ULK1独立于TSC2调节mTORC1信号。
为了了解ULK1负性调节mTORC1信号和细胞增殖的机制，我们询问结节性硬化综合征2（TSC2）是否参与其中。TSC2是Akt的底物，也是mTORC1的负调控因子。31–33如果ULK1通过TSC2抑制mTORC1，则在TSC2-null细胞中不会看到ULK1对mTORC1-信号传导的负面影响。然而，情况并非如此，因为TSC2中ULK1被击倒−/−MEF仍能增强S6K1磷酸化(). 在TSC2-null MEF中，观察到胰岛素刺激和非刺激条件下，ULK1敲除导致S6K1磷酸化增加。如果S6K1介导的负反馈回路完好无损，那么TSC2-缺陷MEF中Ser473的Akt磷酸化显著降低。26–28综上所述，这些结果表明ULK1对mTORC1信号的负作用与TSC2无关。
ULK1独立于TSC2抑制mTORC1信号。TSC2系统+/+和TSC2−/−使用慢病毒载体，通过ULK1或超临界shRNA稳定地转导MEF。shRNA转导的细胞在无血清条件下培养过夜，并用胰岛素（10 nM）处理30分钟。通过蛋白凝胶印迹分析磷酸化状态和S6K1和Akt的表达水平。
ULK1和ULK2与猛禽结合。
知道ULK1独立于Akt和TSC2影响mTORC1信号，我们试图确定ULK1是否可以直接影响mTORC 1。先前的研究表明，ULK1与mTORC1以营养依赖的方式相互作用。14使用重组蛋白，我们证实猛禽与ULK1、ULK2和Atg13相互作用(和B). 我们通过检测猛禽免疫沉淀物中的内源性ULK1，而不是用免疫前血清获得的猛禽免疫沉淀或免疫复合物中的ULK1来确认内源性水平的相互作用(和D). 在这里，rictor被用作阴性对照，因为它形成mTORC2，一种不同于mTORC1的mTOR复合物。我们还能够在ULK1免疫沉淀中检测到内源性猛禽(图S2).
ULK1和ULK2绑定到猛禽。（A） ULK1、ULK2和Atg13绑定到猛禽。用HA标记的猛禽在293T细胞中表达Myc-tagged结构。转染后48小时，用抗myc抗体免疫沉淀法分离的HA-受体的数量通过蛋白凝胶印迹法进行分析。使用HA标记的S6K1作为阴性对照。（B） HA-标记的ULK1与293T细胞中myc标记的猛禽共同免疫沉淀。采用Myc-tagged tubulin和S6K1作为阴性对照。（C） 在内源性水平确认ULK1-受体相互作用。分别使用抗猛禽和抗猛禽抗体从293T细胞中获得猛禽和猛禽免疫沉淀物。用蛋白凝胶印迹法测定免疫复合物中ULK1的含量。星号（*）表示150 kDa附近的非特定带。（D） 293T细胞内源性水平raptor-ULK1相互作用的确认。免疫前血清用作阴性对照。（E） 猛禽和ULK1之间的相互作用不需要Atg13。对shRNA转导的293T细胞进行猛禽免疫沉淀。用蛋白凝胶印迹法分析猛禽免疫沉淀物中ULK1、Atg13和猛禽的数量。（F） 猛禽需要全长才能绑定到ULK1。来自猛禽的全长（aas 1–1335）或片段在293T细胞和myc标记的ULK1中表达为HA标记版本。用蛋白凝胶印迹法分析HA免疫沉淀物中myc-ULK1的含量。
为了更好地定义ULK1和mTORC1之间的相互作用，我们研究了Atg13对相互作用是否必要。Atg13基因敲除不影响293T细胞中猛禽与ULK1的相互作用(). 另一方面，ULK1击倒几乎完全抑制了Atg13与猛禽的结合(). 虽然我们不能排除其他成分参与相互作用，但这一结果表明，ULK1-捕捉器相互作用不需要Atg13，并且ULK1可能是猛禽的直接结合物。该结果与之前参考报告一致14在本实验中，Atg13敲除并没有降低ULK1的表达水平，这表明Atg13可能并不总是ULK1稳定性所必需的。三,13,14,23细川等人。14已确定猛禽与ULK1中部的Pro/Ser-rich（PS）域结合。我们确定ULK2也利用其PS域结合猛禽(图S3). 通过划界实验，我们确定猛禽需要全尺寸才能与ULK1相互作用(). 这与猛禽与mTOR和PRAS40相互作用的观察结果相似。34,35
ULK1调节mTOR-受体相互作用以响应胰岛素。
了解到ULK1与猛禽结合，我们想知道ULK1是否会影响mTORC1的完整性，从而抑制mTORC2的活性。此前，研究表明，细胞培养基中的亮氨酸或胰岛素，相对于它们的剥夺，使mTOR与猛禽的相互作用对裂解缓冲液中两性离子洗涤剂CHAPS的破坏敏感。34,35尽管这种敏化的分子基础尚不清楚，但洗涤剂破坏的mTORC1的构象状态与mTORC2的较高激酶活性相关。34,35如前参考所示35，胰岛素降低了含有CHAPS的裂解缓冲液中mTOR受体相互作用的亲和力(). 当ULK1缺乏MEF且与S6K1磷酸化增加相关时，降低幅度更大(). 当细胞与胰岛素孵育10分钟时，相互作用发生了最剧烈的变化。293T细胞中的ULK2敲除也获得了类似的结果(). 由于ULK1和ULK2可能具有冗余功能，我们询问ULK1与ULK2的击倒或缺陷是否会加剧差异。我们发现ULK1-null MEF中的ULK2敲除进一步降低了raptor-mTOR相互作用的亲和力(图S4). 特别是，与胰岛素孵育120分钟后，相互作用的亲和力没有恢复，而对照细胞显示相互作用恢复。这一结果支持ULK1和ULK2参与调节mTORC1完整性以响应胰岛素。
ULK1调节mTOR-受体相互作用以响应胰岛素并诱导猛禽磷酸化。（A） ULK1缺乏会破坏体外对胰岛素的mTOR-受体相互作用，这种破坏与S6K1磷酸化水平较高有关。使用胰岛素治疗ULK1 MEF，如在含有0.3%CHAPS的细胞裂解缓冲液中，用抗mTOR抗体获得.mTOR免疫沉淀，并用蛋白凝胶印迹法分析猛禽数量。（B） 293T细胞中的ULK2敲除破坏了胰岛素反应中mTOR受体的相互作用。用胰岛素处理shRNA-转导的293T细胞，如用免疫共沉淀法和蛋白质凝胶印迹法分析mTOR免疫沉淀中猛禽的数量。（C） ULK1基因敲除抑制了猛禽在SDS-PAGE上的迁移。用SDS-PAGE对shRNA-转导的293T细胞中的猛禽进行分析，这些细胞用胰岛素处理30分钟。（D） ULK1缺乏抑制了猛禽的机动性转移。对使用胰岛素治疗30分钟的ULK1 MEF中的猛禽进行分析。（E） ULK1诱导猛禽的磷酸化。用myc标记的ULK1野生型（wt）或M92A激酶死亡突变体（kd）在293T细胞中表达HA标记的猛禽。用抗myc抗体免疫沉淀法分离HA-raptor和myc-ULK1。将myc免疫沉淀物用或不用lambda磷酸酶处理后，用蛋白凝胶印迹法分析猛禽和ULK1在SDS-PAGE上的迁移模式。
先前的研究表明，氨基酸调节mTORC1和ULK1之间的相互作用。14我们想知道胰岛素是否也调节mTORC1-ULK1相互作用。胰岛素对猛禽与ULK1的相互作用没有显著影响(图S5). 虽然我们不能排除一种可能性，即我们的检测条件可能不够敏感，无法监测raptor-ULK1相互作用亲和力的显著变化，但我们赞成这样的解释，即胰岛素介导的mTORC1完整性调节似乎不是由于mTORC1-ULK1相互作用力亲和力的变化所致(图S5). 这种调节也不太可能是由于ULK1激酶活性的改变，因为胰岛素对ULK1的激酶活性没有显示出显著影响(图S5). 综上所述，这些结果表明，ULK1对胰岛素起反应，诱导mTORC1的合成状态在体外对CHAPS更具抵抗力，催化活性更低。
ULK1诱导猛禽磷酸化。
知道ULK1与猛禽结合并影响mTOR和猛禽对胰岛素的反应，我们询问ULK1是否会磷酸化mTORC1。ULK1的胰岛素治疗+/+在SDS-PAGE上MEF诱导猛禽向上移动(). 这种变化并不显著，但足够清晰，可以通过胰岛素刺激检测到，尤其是30分钟(). 在没有ULK1的情况下，这种转变在很大程度上被抑制了。当比较来自ULK1缺失或缺失细胞的猛禽和用胰岛素刺激30分钟的对照细胞时，迁移率变化对ULK1的依赖性变得更清楚(和D). 猛禽的迁移也依赖于293T细胞中的ULK2().
为了确定迁移率变化是否是由于磷酸化引起的，我们在293T细胞中与ULK1野生型或激酶死亡突变体（M92A）共表达了猛禽。ULK1野生型支持ULK1在猛禽磷酸化中的作用，相对于ULK1激酶死亡突变体（M92A），诱导猛禽急剧向上移动(). 用lambda磷酸酶处理猛禽时，其活动性变化受到抑制(). 虽然我们不能排除迁移率变化是由于非磷酸化修饰引起的可能性，但鉴于猛禽电泳迁移率依赖于ULK1的可复制变化，我们赞成我们的解释，即迁移率变化归因于磷酸化()ULK1激酶活性负责猛禽的磷酸化(). 综上所述，这些结果表明ULK1诱导猛禽磷酸化。
ULK1抑制mTORC1激酶活性。
了解到ULK1结合猛禽并促进猛禽磷酸化，我们考虑了ULK1可能抑制mTORC1激酶活性的可能性。我们使用来自ULK1 MEF的抗mTOR抗体分离mTOR，并分析mTOR对S6K1和4E-BP1磷酸化的激酶活性，这两种是mTORC1的两种著名底物。我们发现ULK1的mTOR−/−与来自ULK1的mTOR相比，MEF显示S6K1和4EBP1磷酸化的激酶活性大约高1.6–2.2倍+/+MEF公司(和B). 为了证实ULK1特异性抑制mTORC1，我们通过使用抗猛禽抗体分离mTORC2来进行体外激酶分析。正如预期的那样，从ULK1中分离出的mTORC1的激酶活性较高−/−与ULK1相比的MEF+/+MEF公司(). 我们使用从293T细胞分离的mTORC1获得了类似的结果(). 另一方面，使用抗利肌抗体免疫沉淀分离的mTORC2的激酶活性没有因ULK1缺乏而改变(). 这一结果表明，ULK1缺陷导致Akt磷酸化减少不太可能是由于mTORC2的抑制。
ULK1抑制mTORC1的激酶活性。（A） ULK1对mTORC1的激酶活性有负面影响。mTOR从ULK1 MEF中分离出来。以S6K1为底物分析mTOR的激酶活性。通过蛋白质凝胶印迹分析S6K1在Thr389的磷酸化状态。磷酸化水平在右侧的条形图中进行了定量分析。数值为三个独立实验的平均值±标准偏差*p<0.05。（B） 以4E-BP1为底物，在体外评估ULK1对mTORC1激酶活性的抑制作用。条形图表示对Thr37/46处4E-BP1磷酸化状态的定量评估。数值为两个独立实验的平均值±标准偏差*p<0.05。由于我们在SDS-PAGE中使用了大量丙烯酰胺来分析4E-BP1，所以猛禽的迁移率变化尚不清楚。（C） 分析从ULK1 MEFs分离的猛禽免疫沉淀物对4E-BP1磷酸化的激酶活性。（D） 分析从打乱（sc）或ULK1 shRNA-转导的293T细胞中分离的猛禽免疫沉淀物对4E-BP1磷酸化的激酶活性。（E） 分析从ULK1 MEFs中分离的Rictor免疫沉淀物对Ser473处Akt磷酸化的激酶活性。（F） ULK1复合物和mTORC1之间相互调节的模型。
虽然我们不能排除ULK1通过未知中间分子抑制mTORC1的可能性，但这些结果支持我们的假设，即ULK1负调控mTORCl的激酶活性，并且负调控是通过ULK1与猛禽的结合和猛禽的磷酸化介导的。
讨论
在这项研究中，我们证明了ULK1结合猛禽，诱导猛禽磷酸化并抑制mTORC1的激酶活性。虽然ULK1主要被理解为在饥饿条件下触发自噬，但我们发现ULK1具有负调节mTORC1的功能。ULK1对mTORC1的负调控意味着细胞生长途径和自噬机制之间存在密切的串扰。通过这种串扰，mTORC1和ULK1可以根据细胞营养或能量状态协调自噬和细胞生长(). 即使在氨基酸或胰岛素水平较高的情况下，ULK1也会对mTORC1产生负调控(). 在有利的生长条件下，ULK1可能通过抑制mTORC1而有助于抑制细胞过度生长。在良好的生长条件下，ULK1也可能调节S6K1-IRS1负反馈回路，因为ULK1敲除或缺陷改变了IRS-1水平和磷酸化S6K1下调动力学，以响应胰岛素(和图S1). ULK1对mTORC1信号的负调控对细胞生存也很重要。16,18
在不知道猛禽ULK1磷酸化位点的情况下，我们无法确定猛禽磷酸化是否是抑制mTORC1激酶活性所必需的。猛禽体内20多个丝氨酸和苏氨酸残基被称为磷酸化位点。AMPK、mTOR、RSK、Erk和Cdc2已被证明磷酸化猛禽。36–40最近，Dunlop等人报道说，ULK1在多个位点促进猛禽磷酸化，并抑制猛禽与诸如S6K1和4EBP1等mTORC1底物的结合。41这项研究与我们的发现一致。然而，这两项研究都未能确定ULK1是否直接磷酸化猛禽，以及ULK1对mTORC1的抑制是否依赖于猛禽的磷酸化。需要进一步表征猛禽的磷酸化，以确定ULK1在mTORC1负调控中的确切功能。
与ULK1抑制mTORC1一致，我们发现ULK1对细胞增殖和细胞质量积累具有负面影响。ULK1的细胞增殖负调控可能归因于其抑制mTORC 1，尽管我们不能排除一种独立于mTORC的机制。我们发现ULK缺乏或敲除会降低细胞大小(). ULK敲除或缺陷导致的细胞尺寸减小与最近的一份报告一致，即Unc-51的突变失活秀丽线虫减小单元尺寸。25ULK1敲除可能通过缩短G2期，细胞快速生长的时期。与ULK1敲除类似，Atg13或ULK2敲除也会减小细胞大小并增加细胞增殖(). ULK/Atg13对细胞大小和细胞增殖的影响是否取决于mTORC1，需要进一步研究。
根据我们的模型，ULK1对mTORC1的抑制作用可能仅在ULK1与mTORCl相关时发生。如果是这样的话，胰岛素对mTORC1-ULK1相互作用的影响可能会出现问题。胰岛素仅略微抑制mTORC1ULK1相互作用的亲和力(图S5). 此外，胰岛素对ULK1的激酶活性没有显著影响(图S5). 这一结果与我们的观察一致，即ULK1不仅在饥饿条件下，而且在胰岛素刺激条件下抑制mTORC1。虽然我们看到在胰岛素刺激条件下，mTOR受体相互作用的亲和力降低，其方式依赖于ULK1()，这可能并不反映蛋白质的离解，而是mTORC1的构象状态，其活性高于对洗涤剂CHAPS的抗性状态。这种构象状态可能与在高营养条件下看到的状态类似，这种状态对洗涤剂在体外的失稳作用抵抗力较小。34,35
考虑到ULK1对mTORC1的负面影响，很容易推测ULK1可能在癌症和其他人类疾病中失调，例如错构瘤综合征，与过度活跃的mTORCl相关。ULK1/2-Atg13复合物可能是治疗或预防疾病状态的重要靶点。可能通过增加ULK的表达水平或通过促进猛禽与ULK的相互作用来抑制mTORC1信号传导。需要进一步的研究来揭示ULK调节mTORC1的机制以及调节人类疾病的重要性。
材料和方法
化学品和抗体。
初级抗体来自以下来源：抗-ULK1（Santa Cruz Biotech，sc-10900和sc-33182）；抗mTOR（Santa Cruz Biotech，sc-1549用于人类蛋白质；Cell Signaling Technologies，9272用于小鼠蛋白质）；抗TSC2（Santa Cruz Biotech，sc-893）；抗GAPDH（Santa Cruz Biotech，sc-25778）；抗ULK2（Abcam，ab56736）；抗S6K1（Cell Signaling Technologies，9202）、抗磷酸-S6K1（细胞信号技术，9205）；anti-Akt（细胞信号技术，9272）；抗磷酸化Akt（细胞信号技术，9271）；抗磷酸-4E-BP1（细胞信号技术，9459）；抗4E-BP1（细胞信号技术，9452）；抗HA（Covance，MMS-101R-1000）；抗Myc（EMD Biosciences，OP10-200UG）。次级抗体来自圣克鲁斯生物技术公司。抗-Atg13、抗猛禽和抗猛禽抗体在我们之前的参考文献中进行了描述三,34和42.ULK1免疫沉淀的抗-ULK1抗体在我们之前的报告中进行了描述三雷帕霉素来自EMD Biosciences（553210-1MG）。牛胰岛素来自Sigma（I6634）。
细胞培养和转染。
HEK293T、HeLa细胞和MEF在补充有10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM（Invitrogen，11995-065）中在37°C和5%CO中培养2对于瞬时表达，按照制造商的方案，使用FuGENE™6（Roche，11988387001）将重组DNA或shRNA构建物转染细胞。转染后2天收集细胞进行联合免疫沉淀分析。
协同免疫沉淀和蛋白质凝胶印迹。
对于联合免疫激发研究，在含有40 mM Hepes、pH 7.4、120 mM NaCl、1 mM EDTA、50 mM NaF、1.5 mM Na的缓冲液中制备全细胞提取物三VO（旁白）4、10 mMβ-甘油磷酸和0.3%CHAPS，辅以无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，05056489001）。使用裂解缓冲液清洗免疫沉淀蛋白四次，将其装入8%的三甘氨酸凝胶（Invitrogen，EC60185），转移到免疫印迹聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（Bio-Rad，1620177），并用化学发光试剂检测（Perkin-Elmer，NEL105001）。
慢病毒制剂、病毒感染和稳定细胞系生成。
利用慢病毒包装载体pHR’8.2ΔR和pCMV-VSV-G，利用FuGENE 6将编码靶向ULK1、ULK2或Atg13的shRNA或加扰序列的shRNA的慢病毒载体pLKO.1导入HEK293T。转染后60小时收集病毒，并在聚溴乙烯存在下用收集的病毒感染靶细胞。在嘌呤霉素作用下选择稳定的转导细胞。ULK1和Atg13 shRNA的靶序列以及加扰的shRNA序列在我们之前的参考报告中进行了描述三小鼠ULK2 shRNA的靶序列为CCA AAG ACT CTG CGA GTA ATA。通过RT-PCR证实了ULK2的敲除。
体外激酶测定。
mTOR免疫沉淀物是使用抗mTOR抗体、猛禽抗体或蓖麻抗体从MEF中获得的。作为底物，从雷帕霉素处理的表达GST-S6K1的293T细胞中纯化重组S6K1。4E-BP1来自Stratagene（206160）。非活性Akt1是从Millipore（14-279）获得的。mTORC1的激酶反应在含有25 mM HEPES、pH 7.4、50 mM KCl、10 mM MgCl的缓冲液中进行2，500µM ATP和500 ng S6K1或4EBP1，在30°C的指定时间段内。mTORC2的激酶反应在含有25mM HEPES、pH 7.5、100mM乙酸钾、1mM MgCl的缓冲液中进行2500µM ATP和250 ng Akt1。通过加入SDS样品加载缓冲液来停止所有激酶反应。分别使用p-Thr389、p-Thr37/46和p-Ser473特异性抗体通过蛋白凝胶印迹分析S6K1、4E-BP1和Akt1的磷酸化。对于ULK1激酶检测，我们从293T细胞中获得ULK1免疫沉淀物，并遵循我们在参考文献中先前报告中描述的方案三.
细胞尺寸测量。
感染慢病毒的细胞在30%的汇合处分裂到6孔板上，第二天对细胞进行胰蛋白酶处理并用DMEM收获。在用同位素II稀释剂（Beckman Coulter Inc.，BCC-8546719-20L）稀释10倍后，将细胞加载到Z2 Coulter细胞大小分析仪（Beckman-Coulter Inc.）上。
细胞增殖试验。
感染慢病毒的细胞在DMEM中生长，并在第1、2和3天分析细胞数量。细胞计数时，汇合处细胞密度低于30%。每天对细胞进行胰蛋白酶处理并用DMEM收获。用同位素II稀释剂将细胞稀释10倍，并加载到Z2犁上。定量分析了三个独立测量值（平均值±标准差）。p值通过使用Kaleida的Student t检验获得图形软件（Synergy软件）。
致谢
我们感谢M.Kundu、N.Mizushima和D.Kwiatkowski提供ULK1、Atg5和TSC2 MEF；A.Lange、T.Neufeld和Kim实验室成员征求对手稿的意见。本研究由明尼苏达州医学基金会、助学金、明尼苏苏达肥胖中心（3P30DK050456）、美国糖尿病协会（7-07-CD-08）和NIH（T32AG029796、DK072004和DK083474）支持。
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