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.2008年4月25日；30(2):214-26.
doi:10.1016/j.molcel.2008.03.003。

猛禽AMPK磷酸化介导代谢检查点

达纳·M·格温 1, 大卫·B·沙克尔福德, 丹尼尔·F·伊根, 玛丽亚·米哈伊洛娃, 安娜贝拉·梅里, 黛比·S·巴斯克斯, 本杰明·特克, 鲁本·J·肖
附属公司

猛禽AMPK磷酸化介导代谢检查点

达纳·M·格温等。 分子电池. .

摘要

AMPK是一种高度保守的细胞能量状态传感器，在低细胞内ATP条件下被激活。AMPK通过抑制细胞生长和生物合成过程，部分通过抑制雷帕霉素敏感性mTOR（mTORC1）通路，对能量应激作出反应。TSC2肿瘤抑制因子的AMPK磷酸化有助于mTORC1的抑制；然而，TSC2-deficient细胞对能量应激仍有反应。使用蛋白质组学和生物信息学方法，我们试图识别AMPK的其他底物，以调节其对生长控制的影响。我们在这里报道，AMPK直接磷酸化两个保守的丝氨酸残基上的mTOR结合伙伴猛禽，这种磷酸化诱导14-3-3与猛禽结合。AMPK对猛禽的磷酸化是抑制mTORC1和能量应激诱导的细胞周期阻滞所必需的。这些发现揭示了AMPK的一个保守效应器，该效应器调节其作为代谢检查点的作用，协调细胞生长与能量状态。

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数字

图1
图1。肽库分析AMPK的最佳底物基序并与已知和候选体内磷酸化位点进行比较
A.用活性AMPKα1和放射性标记ATP对空间排列的PSPL进行体外磷酸化。每个肽包含一个残基，固定在相对于中心固定的磷酸受体（丝氨酸和苏氨酸的等量混合物）的九个位置之一。每种反应的等分样品被发现在亲和素膜上，该膜被清洗、干燥并暴露在磷光体存储屏幕上，形成如图所示的斑点阵列。AMPK在−5、−4、−3、−2、+3和+4位置显示出强选择性。B.显示了从A中的三份分析中进行的最优和二次选择。AMPK体内最佳底物中的AMPK磷酸化位点符合肽库数据中的底物基序。所有显示的底物都是在生物信息学搜索中分离出来的，以寻找包含保守AMPK磷酸化基序的蛋白质。这些相同的搜索得到了猛禽中两个新的预测AMPK位点。C.猛禽体内预测的AMPK位点在整个进化过程中是高度保守的。
图2
图2。AMPK在体内外磷酸化猛禽
A.TSC2缺陷细胞中的mTORC1信号传导仍然对能量应激有反应。TSC2+/+或TSC2−/−匹配的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）隔夜无血清（-ser），并用含有10%胎牛血清（+FBS）的新鲜培养基或含有2mM AICAR或5mM苯甲酸的血清培养基替换。更换培养基后1小时，细胞被裂解。对p70 S6K1中mTORC1依赖的Thr389磷酸化和S6K1总蛋白的裂解液进行免疫印迹。B.过度表达的猛禽在HEK293细胞中以LKB1和AMPK依赖的方式磷酸化。左图：myc标记的mTOR和myc标记猛禽在HEK293细胞中与空载体、野生型LKB1、激酶缺失LKB1或组成活性AMPKα1等位基因（1–312截断）共表达。使用磷酸化-14-3-3基序抗体检测猛禽磷酸化。右图：表达mTOR和猛禽的HEK293细胞用50μM白藜芦醇处理30分钟，并用磷酸14-3-3基序抗体检测猛禽的磷酸化。C.经过白藜芦醇处理后，猛禽在丝氨酸792上被高水平磷酸化。对从经白藜芦醇处理的HEK293纯化的猛禽蛋白进行质谱分析，如图B所示。从SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离出经Commassie染色的猛禽蛋白质，并在LC-MS/MS分析之前进行化学加密消化。此处显示了人类猛禽的氨基酸761-800。每个回收的肽用一条绿线表示。磷酸化残留物以洋红色显示。D.一种针对猛禽丝氨酸792的磷酸特异性抗体可识别在HEK293细胞中用50μM白藜芦醇或5mM苯丙氨酸处理后，AMPK（左）和野生型但非S792A突变体猛禽（右）体外磷酸化的猛禽。
图3
图3。在培养的MEF和小鼠肝脏中，猛禽Ser722和Ser792被AMPK以AMPK和LKB1依赖的方式磷酸化
A.在HEK293细胞中，Ser722和Ser792均以AMPK依赖性方式磷酸化。用野生型、S722A、S792A或双突变S722A/S792A猛禽等位基因转染HEK293细胞，并按指示处理。对猛禽进行免疫沉淀，并用磷酸化-Ser792、磷酸化-14-3-3基序或抗myc表位标签抗体进行免疫印迹。从总细胞提取物中进行磷蛋白-ACC免疫印迹，以说明细胞中AMPK的激活程度。B.野生型中内源性猛禽在Ser792处磷酸化，但不存在AMPK-缺乏型（AMPKα1−/−，α2−/–）永生化MEF。MEF用2mM AICAR治疗1h（AICAR）或不治疗（NT），并用所示抗体对总细胞提取物进行免疫印迹。C.禁食和二甲双胍治疗后，野生型但非LKB1缺乏小鼠肝脏中内源性猛禽在Ser792处磷酸化。8周龄小鼠随意喂食（即席）或禁食18小时，并用250mg/kg的二甲双胍盐溶液（Met）或单用盐溶液（Sal）治疗1小时。从收获的肝脏中提取的总细胞提取物用所示抗体进行免疫印迹。
图4
图4。丝氨酸722和792的磷酸化需要在各种细胞类型的能量应激后抑制mTORC1
A.将内源性猛禽被击倒的C2C12细胞与人类野生型或AA猛禽稳定重组（见图S3），并用1mM AICAR或1mM二甲双胍处理1小时，如图所示。用指示的抗体对总细胞提取物进行免疫印迹，以检查mTORC1信号。B.用2mM AICAR处理与野生型或AA猛禽稳定重组的TSC2−/−、p53−/–、猛禽击倒MEF，并用指示的抗体进行免疫印迹，以检测mTORC1信号。C.如图所示，用2mM AICAR处理与野生型或AA猛禽稳定重组的TSC2−/−、p53−/–、猛禽击倒MEF。如前所述，在CHAPS缓冲液中免疫沉淀猛禽，并使用纯化的S6K1作为底物检测mTORC1激酶活性（Sancak等人，2007）。顶部：使用磷酸-Thr389 S6K1抗体对纯化的S6K1底物的磷酸化以及免疫沉淀的猛禽、mTOR和PRAS40的水平进行免疫印迹IP激酶测定。底部：猛禽免疫沉淀的总细胞提取物中，有5%用指示的抗体进行了免疫印迹。
图5
图5。猛禽AMPK磷酸化诱导14-3-3缔合
A.野生型但非AA突变猛禽复合体，仅在能量胁迫条件下与14-3-3结合。将pEBG或pEBG-14-3-3与野生型或AA突变猛禽共同转染HEK293细胞，然后在谷胱甘肽珠上沉淀复合物。用所示抗体对珠或总细胞提取物进行免疫印迹。用V，载体（DMEM）或P，5mM二甲双胍处理细胞1h。B.野生型而非AA突变型猛禽在能量应激处理的TSC2−/−MEF提取物中沉淀重组GST-14-3-3蛋白，该提取物稳定地与人类猛禽等位基因重组。用所示抗体对GST蛋白下拉物或总细胞提取物进行免疫印迹。C.内源性猛禽与固定化重组GST-14-3-3蛋白结合，但不与重组GST蛋白结合，后者来自以LKB1-依赖方式处理的能量应激提取物细胞。用所示抗体对GST蛋白下拉物或总细胞提取物进行免疫印迹。D.使用Myc肽洗脱来自苯福明（Ph）或载体（v）处理细胞的Myc标记的猛禽免疫沉淀物，并免疫印迹内源性14-3-3亚型，如图所示。
图6
图6。猛禽在S722和S792的磷酸化决定了一个代谢检查点，控制生长停滞和细胞凋亡，以应对能量应激
A.表达野生型猛禽的TSC2−/−、p53−/–MEF在AICAR治疗后发生G1/S阻滞，而表达AA突变体猛禽的MEF则没有。细胞未经处理（NT）或用2mM AICAR处理，或用2mm AICAR治疗，3小时后暴露于诺康唑（+nocod）以阻止G2/M中的任何循环细胞。AICAR后24小时，固定所有细胞，并用碘化丙啶和FACS分析其DNA含量。每个群体中处于细胞周期G2/M期的细胞百分比突出显示。B.将与A组相似的细胞贴在盖玻片上，第二天不处理（NT）或用2mM AICAR处理，18小时后固定。对细胞进行磷酸化H3 Ser10免疫细胞化学处理，以观察细胞在固定时积极进行有丝分裂。DAPI被用作核染色。直方图量化了用5mM二甲双胍或2mM AICAR处理18小时的指示细胞的磷酸组蛋白H3免疫细胞化学。每种情况下至少对300个细胞进行评分。C.对平行板和A组中分析的细胞提取液进行免疫印迹，以检测磷酸氢istone H3 Ser10，作为有丝分裂细胞百分比的标记。D.能量应激处理后，表达AA突变体猛禽的TSC2+/+、p53−/−MEF或TSC2−/–、p53–/−ME在后期的凋亡程度高于表达WT猛禽的。用5mM二甲双胍处理所示基因型的细胞群，并在48小时时用AnnexinV染色和FACS分析定量细胞凋亡的百分比。在最右侧的面板中覆盖了表达野生型猛禽（红色痕迹）和AA猛禽（蓝色痕迹）的细胞直方图。在每个直方图的右上角用红色表示膜联蛋白V阳性人群中凋亡细胞的百分比。E.来自LKB1的上游AMPK信号需要用于WT猛禽对能量应激后细胞凋亡的保护作用。用表达逆转录病毒的野生型LKB1（WT）或突变激酶死亡的K78I（KD）LKB1稳定地重组LKB1缺失的A549人肺腺癌细胞。这些细胞随后被表达野生型或AA猛禽的逆转录病毒稳定感染。四个结果群体中的每一个都用5mM二甲双胍治疗，并如上所述进行细胞凋亡分析。
图7
图7。营养素和生长因子通过共同（TSC2）和独特（猛禽，PRAS40）下游靶点控制mTORC1活性
引人注目的是，AMPK介导的对猛禽的抑制和Akt介导的对PRAS40的抑制都涉及与14-3-3结合的每个蛋白质中的磷酸化位点，导致这些靶标失活。LKB1、TSC1的遗传突变。TSC2和PTEN均导致人类错构瘤综合征，表明mTORC1的过度激活是这些遗传疾病的常见生化机制。
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    1. Apfeld J、O’Connor G、McDonagh T、DiStefano PS、Curtis R。AMP活化蛋白激酶AAK-2将能量水平和胰岛素样信号与秀丽线虫的寿命联系起来。基因发展2004；18:3004–3009.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Baena-Gonzalez E、Rolland F、Thevelein JM、Sheen J.植物胁迫和能量信号转导中转录网络的中央集成商。自然。2007;448:938–942.-公共医学
    1. Baugh LR，Sternberg PW.DAF-16/FOXO在秀丽线虫L1期阻滞期间调节cki-1/Cip/Kip的转录和lin-4的抑制。当前生物量。2006;16:780–785。-公共医学
    1. Bokko PB、Francione L、Bandala-Sanchez E、Ahmed AU、Annesley SJ、Huang X、Khurana T、Kimmel AR、Fisher PR。线粒体疾病中的多种细胞病变是由AMP激活的蛋白激酶信号引起的。分子生物学细胞。2007;18:1874–1886。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bridges D、Moorhead GB。14-3-3蛋白质：编号蛋白质的许多功能。科学STKE。2005;2005年：修订10。-公共医学

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