介绍
在饥饿条件下，真核细胞通过自噬（一种溶酶体介导的大量细胞质降解过程）恢复营养。通过自噬，长寿命的蛋白质、细胞器和细胞质的其他成分被非选择性地吞噬在被称为自噬体的特殊双层膜囊泡中。随后，外自噬体膜与溶酶体融合，形成一种称为自溶体的结构，其中内膜及其细胞质物质被降解。自溶酶体释放的分解产物为细胞提供了营养物质的内部来源，可以支持饥饿期间的基本代谢过程[1]. 大约20自动液位计自噬所需的（自噬相关）基因在酵母菌属 酿酒[2-4]，其中许多基因在后生动物中具有功能同源性[1,5].
除了饥饿生存外，自噬还与健康和发展的许多方面有关，包括衰老、程序性细胞死亡、致病性感染、应激反应、神经变性和肌肉疾病、细胞重塑、癌症和细胞生长[1,6]. 在许多这些过程中，自噬在细胞生长控制中的作用的证据在很大程度上是相关的。自噬由PTEN、TSC1&2和beclin 1等多种抑癌基因促进，并被I型PI3K和雷帕霉素（TOR）靶信号转导等促生长途径抑制[5,7-10]. 各种刺激细胞生长的条件，如添加生长因子、部分肝切除和饥饿后再喂养，也会抑制自噬，而生长抑制信号，如接触抑制和底物脱落，则会诱导自噬[11]. 总之，这些相关的发现与一个模型是一致的，在这个模型中，自噬的分解代谢效应在发育过程中起到了阻止细胞生长的作用。然而，调节自噬的信号通路的多效性使这个问题变得复杂。例如，除了抑制自噬外，TOR途径还通过促进核糖体生物生成、蛋白质合成和营养吸收来控制细胞代谢和生物合成[12]. 这些下游效应器途径对净细胞生长的相关贡献尚不清楚。
自噬也与程序性细胞死亡有关，并将II型（自噬）细胞死亡与I型（凋亡）细胞死亡区分开来。自噬细胞死亡的特征是死亡细胞中有大量的自噬体和自溶体，与凋亡细胞死亡的不同之处在于死亡细胞被自身的溶酶体酶降解，而不是被吞噬作用降解[13]. 然而，很难确定自噬是否在II型细胞死亡中起到因果作用，或者是否代表经历程序性细胞死亡的细胞中细胞存活的失败尝试。死亡信号通常会诱导细胞凋亡和自噬，而破坏自噬的突变在某些情况下会抑制细胞死亡[14-16]在其他人身上加速[2,17]. 因此，与细胞生长一样，自噬在细胞死亡中直接作用的支持在很大程度上依赖于相关证据。
解决自噬在细胞死亡和生长等功能中潜在作用的一种方法是直接诱导自噬，而不依赖于通常控制自噬的信号通路。在酵母中，包括TOR、AMPK和Ras/PKA在内的多种信号通路汇聚在Ser-Thr激酶Atg1上调节自噬[18-20]. 此外，Atg1通过直接关联、磷酸化和/或通过对细胞内定位的影响与自噬机制的多个成分相互作用[18,21,22]. 因此，Atg1可能代表一个节点，用于控制自噬过程中的多个步骤，以响应各种诱导线索。
有趣的是，Atg1激酶活性在酵母中的作用是一些争论的主题，来自不同群体的使用ATP类似物敏感和激酶缺陷的Atg1突变体的研究得出了相互矛盾的结论。一项研究报告称，Atg1激酶活性是自噬相关的生物合成细胞质到液泡靶向（CVT）途径所必需的，而不是自噬所必需的[23]. 然而，其他使用类似试剂的研究发现，在CVT和自噬中都需要Atg1激酶活性[18,24].
我们之前已经表明果蝇属 黑腹食肉动物Atg1的同源物是幼虫脂肪体自噬所必需的，脂肪体是一种类似于脊椎动物肝脏的器官，具有储存和动员营养物质的作用[5]. 在这里，我们研究了果蝇Atg1功能丧失和过度表达对自噬诱导、细胞生长控制和细胞死亡的影响。我们的研究结果表明，Atg1的表达足以影响完全的自噬反应，从而显著抑制细胞生长并快速诱导凋亡细胞死亡。
结果
Atg1过度表达诱导自噬
的空突变附件1导致饥饿诱导的自噬严重受阻，并导致蛹晚期完全渗透致死[5]. 为了测试Atg1过度表达的影响，我们在GAL4/UAS控制下生成了多个表达野生型Atg1的转基因株系。我们还使用了一个独立生成的序列（GS10797），其中UAS调控序列被插入内源性附件1基因。在对照实验中，UAS-Atg1的弱表达足以部分挽救附件1根据Lysotracker Red染色法（脂肪体组织中自溶体的有效标记）的测量，无突变的成虫存活率（预期后代的34%；补充图S1A），部分修复了这些突变的自噬缺陷[5,25]. 与野生型幼虫相似，附件1UAS-Atg1拯救的突变体在正常喂养时没有显示Lysotracker染色（补充图S1B&G），但在饥饿条件下恢复了诱导自噬的能力（补充图S1C&G）。
为了研究Atg1过度表达是否足以诱导喂食动物的自噬，我们使用热休克诱导的Hsp70-GAL4驱动因子表达了高水平的转基因Atg1。超微结构分析表明，单纯的热休克并不能增加正常喂养幼虫脂肪体细胞中自噬结构的丰度()。相反，热休克诱导的Atg1过度表达导致自噬体和自溶体在喂食动物的脂肪体细胞中形成()。这些自噬结构与饥饿产生的结构无法区分[5]在不同的降解阶段具有易于识别的细胞质成分。使用Lysotracker染色法，在喂食幼虫的活脂肪体组织中，对热休克诱导的Atg1过度表达作出反应，也可以明显地诱导自噬（比较图&;)。还观察到点状Lysotracker染色对脂肪体中Atg1的组成性表达作出反应（参见)脂肪体细胞克隆（补充图S1E），以及眼和翼想象盘细胞（数据未显示）。此外，我们偶尔通过TEM和Lysotracker染色观察到自溶体在核周区域的定位（补充图S1E和S3G以及未显示的数据）。这与最近的观察一致，即哺乳动物Atg9是自噬体膜源的一个潜在标记，它是从核周跨高尔基网络中招募来的，以依赖于Atg1的方式应对饥饿[26]. 因此，Atg1诱导的自溶体在核周区的积聚可能是自溶体形成的早期位点。
Atg1过度表达诱导自噬。
（A-G）通过热休克诱导的Atg1过度表达诱导自噬。TEM显示仅通过热休克（A）不会在正常喂养的动物的脂肪体中诱导自噬，而热休克诱导的Atg1（B）过度表达会导致自溶体（箭头）和自噬体（箭头所示）的积聚。仅热休克不显示Lysotracker染色（C），而热休克诱导的Atg1过度表达导致点状Lysotrack染色（红色）（D）。诱导Atg1过度表达导致GFP-Atg8b（绿色）从均匀染色（E）重新分布到点状模式（F）。许多GFP-Atg8阳性点状物要么与（小箭头）相邻，要么与（大箭头）Lysotracker标记的结构（G）重叠。N表示（A）中的细胞核；L表示（a和B）中有脂滴。
（H） 的突变附件8a破坏Atg1诱导的Lysotracker染色。
（一） Lysotracker染色定量。*表示与野生型有显著差异：p<0.0001；**表明与单独Atg1过度表达有显著差异：p=0.0001。误差条表示标准偏差（SD）。
比例尺表示1μm in（A-B）和10μm in.（C-H）。面板中的Nuclei标记为蓝色（C-H）。基因型：（A，C）热休克蛋白70-GAL4/+. （B、D）热休克蛋白70-GAL4/UAS附件19.（E）Hsp70-GFP-Atg8b6亿/Hsp70-GFP-Atg8b6亿;热休克蛋白70-GAL4/TM6B（TM6B）（F-G）Hsp70-GFP-Atg8b6亿/Hsp70-GFP-Atg8b6亿;热休克蛋白70-GAL4/UAS第1类6亿.（H）附件8aKG07569公司/Y（Y）;热休克蛋白70-GAL4/UAS附件16亿（I）如面板C、D和H所示。
通过TOR信号调节Atg1。
（A-D）Atg1诱导的自噬被TOR通路激活所抑制。热休克诱导的Atg1（A）过度表达可诱导自噬，如Lysotracker染色所示（红色），但TSC2突变可抑制这种诱导（B）。Rheb的过度表达拯救了Atg1的过度表达表型。Atg1在整个脂肪体（C）的过度表达导致细胞大小的可变减少和自噬的诱导。Rheb（D）的同时过度表达挽救了这些效应。
（E） Lysotracker染色定量。**表明与仅Atg1过度表达有显著差异：p=0.0051。
（F） Rheb的共表达延迟了Atg1过度表达细胞的消除。GFP阳性细胞的平均数量表示为占总细胞的百分比。**表明与单独Atg1过度表达有显著差异：p<0.002。
比例尺代表10μm。细胞核用蓝色标记。错误条指示SD。
基因型：（A）热休克蛋白70-GAL4/UAS附件16亿.（B）Hsp70-GAL4千兆192/UAS附件16亿 演出109.（C）Cg-GAL4/+;UAS附件1GS10797标准/+. （D）Cg-GAL4/+;UAS附件1GS10797标准/UAS-Rheb公司EP50.084-loxP.（E）与面板A和B相同。（F）附件1：高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>镀锌4/UAS附件16亿.附件1 Rheb：高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>镀锌4/无人机-Atg16亿 无人机RhebAV4（平均值4）.
为了确定Atg1过度表达诱导的自噬是否利用了与饥饿诱导的自吞噬相同的分子成分，我们首先检测了GFP-Atg8a和GFP-Attg8b的定位，这是自噬体膜的特异标记物[5,27,28]. 如前所述，GFP-Atg8b在喂食动物的对照脂肪体细胞中均匀分布()。相反，热休克诱导的Atg1过度表达导致GFP-Atg8b重新分布到点状模式()类似于饥饿的影响[5]. 在协同训练实验中，GFP-Atg8标记的点状突起常与Lysotracker阳性点相邻或重叠()正如之前在饥饿的野生动物中观察到的那样[5]. 与沟前的对照细胞相比，在正常喂养的动物中，使用GMR-GAL4的眼睛视盘形态发生沟后发育中的视网膜细胞中Atg1的表达也导致GFP-Atg8a的点状定位（补充图S2C）。有趣的是，Atg1的过度表达也导致眼睛和翅膀影像盘中GFP-Atg8a和GFP-Attg8b的丰度显著增加。在这些实验中，Atg1分别在带有GMR-GAL4或en-GAL4的眼或翼椎间盘后部过度表达，导致hsp70驱动的GFP-Atg8相对于这些椎间盘前部水平升高（对比补充图S2A和S2B，数据未显示）。通过免疫印迹分析，在Atg1过度表达的眼和翼盘中也观察到GFP-Atg8b水平的增加（补充图S2E和未显示的数据）。在这些细胞系中，GFP-Atg8的表达受异源启动子和UTR序列的调节[5]并且Atg1过度表达不会单独影响GFP的丰度，也不会影响对照GFP融合的丰度（数据未显示），我们得出结论，Atg1可能通过稳定GFP-Atg8蛋白对GFP-Atg 8水平产生翻译后影响。因此，在自噬诱导条件下，Atg8水平增加，两者都是转录的[27,29,30]以及转录后。
为了进一步探索自噬机制对已知成分的需求，我们测试了其他Atg基因的突变是否影响Atg1过度表达诱导自噬的能力。我们在编码区发现了一个P元素插入附件8a，并在中生成删除附件3之前通过RNAi分析显示果蝇自噬所需的基因座[31]. 每个突变都导致饥饿诱导的自噬显著减少（对比补充图S3A和S3B&S3E；补充图S3K），这可以通过转基因表达相应的野生型基因（补充图S3C、F和K），以及通过从附件8a（补充图S3D&K）。重要的是，每一种突变都会显著抑制Atg1诱导的自噬(&我；补充图S3G、H和K）。总之，这些结果表明，Atg1对诱导完全自噬反应既必要又充分，并且Atg1诱导的自噬至少涉及一些与饥饿诱导的自吞噬相同的分子机制。
依赖Atg1的自噬限制细胞生长
抑制自噬与TOR/PI3K信号的细胞生长效应密切相关，表明自噬作为一个分解代谢过程可能抑制生长。为了确定TOR/PI3K通路突变体中自噬水平的增加是否导致其细胞生长速度的降低，我们首先检查了翼想象盘中有丝分裂克隆的生长特性。我们发现，在预测值k1是TOR通路的正调控因子[12]与野生型双星相比，其大小减少了78%(&E）。克隆双突变体预测值k1和附件1在尺寸上与Pdk1型突变克隆(&E），表明当损失预测值k1诱导自噬[5]，这不会显著降低预测值k1使突变细胞无效。这一结果与我们之前的发现一致，即RNAi介导的自噬抑制并不能缓解细胞的生长缺陷托尔无效突变细胞[5].
Atg1表达导致细胞尺寸减小。
（A-D）增长效应附件1翼盘克隆体功能丧失。预测值k1突变克隆（GFP丢失）显示出相对于野生型双斑点（GFP增加），克隆大小减小（A）。同时损失附件1（B） 无法挽救这种规模缩减。附件1突变克隆在正常培养基（C）上生长时不显示生长表型，但在含有2μM雷帕霉素的培养基上生长使Atg1突变克隆相对于野生型（D）具有相对生长优势。
（E） 翼盘中相对克隆大小的定量。在同一图像中，平均克隆大小归一化为野生型双斑点。虚线表示1:1的比率（无生长表型）。††表示与预测值k1突变克隆：p=0.44；†表示与野生型双斑点无显著差异：p=0.28；*表明与野生型双斑点有显著差异：p=0.016。n表示克隆号。
（F-H）脂肪体中Atg1的细胞大小效应。克隆损失附件1功能（GFP、箭头的丢失）对正常喂养的动物（F）的脂肪体细胞大小没有影响，但在饥饿45小时（G）的动物中，导致相对生长优势。Atg1（GFP阳性细胞，箭头）（H）的克隆过度表达导致细胞尺寸显著减小。肌动蛋白细胞骨架（红色）用指骨肽（F-G）或α谱抗体（H）标记，细胞核用蓝色标记。（H）中的DNA通道显示了两个具有代表性的共焦截面。插图显示了相应图像的类阴茎肽（或字母谱）通道。
（一） 脂肪体中相对细胞大小的定量。将同一图像中的平均细胞大小归一化为野生型（纯合子和杂合子）细胞。野生型栏包括喂食和饥饿动物的细胞。†表明与野生型无显著差异：p=0.54；*表明与野生型有显著差异：p＜0.0001。n表示单元编号。
比例尺代表10μm。错误条指示SD。
基因型：（A）高速飞行计划/+;预测值k15 FRT80B型/Ubi-GFP FRT80B型.（B）高速飞行计划/+;预测值k15 附件1Δ三维 FRT80B型/Ubi-GFP FRT80B型.（C-D）高速飞行计划/+;附件1Δ三维 FRT80B型/Ubi-GFP FRT80B型（E）如面板A-D（F-G）高速飞行计划/+;Cg-GAL4/+;附件1Δ三维 FRT80B/UAS-2x eGFP FRT80B.（H）高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4 UAS-GFP/UAS-Atg16亿（I）与面板F-H相同。
我们推断TOR/PI3K信号的严重阻滞预测值k1和托尔零突变可能导致代谢变化，掩盖自噬的潜在生长效应。例如托尔空突变细胞[32]可能会对自噬产生的营养物质产生需求，因此在这些严重条件下，自噬的潜在生长抑制作用可能被其代谢益处所抵消或抵消。为了测试在更适度降低TOR信号的条件下自噬的潜在生长效应，我们用雷帕霉素浓度处理幼虫，该浓度会导致幼虫发育的两倍延迟。在正常喂养的动物中附件1空突变克隆与它们的双点对照没有显著差异(&E）。相反，在培养基中添加雷帕霉素会附件1与野生型细胞相比，突变体克隆具有显著的生长优势，与野生型双斑细胞相比，其平均克隆大小增加了59%(&E）。
为了测试自噬在更多生理条件下的生长功能，我们研究了饥饿对野生型和附件1幼虫脂肪体中的突变细胞。我们发现，就像翼盘一样，附件1在正常饲养的动物中，突变细胞与邻近野生型细胞相比，大小没有显著差异(&I），与在这些条件下观察到的低自噬率一致。然而，长期的饥饿附件1突变细胞比野生型相邻细胞增长2.3倍(&I）。在表达靶向Atg5的RNAi构建物的细胞中也观察到类似结果（数据未显示）。我们得出结论，在降低TOR信号的生理条件下，诱导自噬是观察到的细胞生长速度降低的部分原因。这些结果与最近的研究结果一致，即利用四环素调节的Atg5表达系统，自噬是饥饿诱导小鼠胚胎成纤维细胞尺寸缩小所必需的[33].
作为对这些基因功能丧失研究的补充，我们测试了UAS-Atg1表达诱导的自噬的生长效应。Atg1的克隆过度表达导致脂肪体细胞生长受到显著抑制，导致细胞面积减少94%(&I）。在Atg1表达细胞中也观察到细胞核大小和DNA含量相应减少(; 另请参见&E），表明高水平的自噬抑制这些细胞的内复制细胞周期。Atg1在整个脂肪体、眼睛或翅膀想象盘中的组成性表达也导致这些器官的尺寸显著减小(，补充图S2G，未显示数据）。总之，这些结果表明，自噬对于正常生长抑制是必要的，以响应TOR信号的减少，并且足以抑制独立于上游信号的细胞生长。
Atg1过度表达诱导细胞凋亡。
（A） 20%（±15%，p=0.007）过度表达Atg1（GFP阳性细胞）的细胞中，翼盘显示活性caspase 3染色（箭头）。
（B） TUNEL染色（箭头）显示，22%（±6%，p=0.0002）的Atg1过度表达细胞（GFP阳性细胞）的翼盘DNA片段。
（C） p35的共表达减少了Atg1过度表达细胞的消除。GFP阳性细胞的平均数量表示为占总细胞的百分比。**表明与单独Atg1过度表达有显著差异：p<0.020；†表明与野生型对照无显著差异：p=0.63。
（D-G）过度表达Atg1的脂肪体细胞因凋亡而死亡。（D） 活性半胱天冬酶3的Atg1过度表达细胞（箭头）染色。（E） Atg1过度表达细胞（箭头）TUNEL染色阳性。TUNEL和DNA通道显示两个具有代表性的共焦截面。（F） 肌动蛋白染色异常的Atg1过度表达细胞（大箭头）或碎片化并被邻近细胞吸收的细胞（小箭头）。（G） 一个过度表达Atg1（箭头）的细胞失去了大部分外周肌动蛋白染色，并被邻近的脂肪体细胞完全吞噬。比例尺表示10μm。细胞核用蓝色标记。错误条指示SD。
基因型：（A-B，D-G）高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/UAS附件16亿（C）控制：高速飞行计划/+；法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/+. 附件1：高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/UAS附件16亿.见第15页第1页：高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/UAS附件16亿 UAS第35页.
高水平的自噬导致凋亡细胞死亡
自噬和细胞死亡在许多情况下是相关的，但因果关系尚不清楚。为了测试自噬在促进细胞死亡中的潜在作用，我们诱导了GFP标记的过度表达Atg1的翼状椎间盘细胞的克隆，并在诱导后的连续时间间隔内测定了GFP阳性细胞的百分比。尽管这种方法不能实时监测单个细胞，但它允许我们通过分析多个时间点的大量细胞来对其存活率做出有力的推断。我们发现，与单独表达GFP的对照细胞相比，大多数过度表达Atg1的细胞在诱导36小时内被消除()。诱导后12小时，即我们可以确定GFP表达的最早时间点，细胞数量明显减少。Atg1过度表达细胞的消除在附件8a突变背景()这表明细胞死亡直接由自噬增加引起。
Atg1的过度表达导致细胞消除。
（A-C）消除翼盘中Atg1过度表达克隆。野生型对照组在热休克诱导后12、24、36、48和60小时显示GFP阳性细胞数量一致（A）。热休克后12小时，过度表达Atg1（GFP阳性细胞）的细胞大量存在，但随着时间的推移会消失（B）。GFP阳性细胞的平均数，以总细胞的百分比表示（C）。*与野生型对照相比，差异显著：p<0.0001。
（D） 的突变附件8a延迟Atg1过表达细胞的消除。GFP阳性细胞的平均数量以总细胞的百分比表示。**表明与仅Atg1过度表达有显著差异：p<0.03。
比例尺代表10μm。细胞核用蓝色标记。错误条指示SD。
基因型：（A）高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/+. （B）高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/UAS第1类6亿.（C）与面板A和B相同。（D）附件1：高速飞行计划/Y（Y）;桶>CD2（CD2）>镀锌4/+;UAS附件16亿/+. 附件1附件8a-：hsflp附件8aKG07569公司/Y（Y）;桶>CD2（CD2）>镀锌4/+;UAS附件16亿/+.
观察到自噬细胞死亡的细胞显示凋亡迹象[34,35]. 因此，我们检测了Atg1过表达细胞的caspase活性和DNA片段，这是凋亡细胞的特征。我们发现，如活性caspase-3抗体染色所示，20%的翼膜细胞克隆性过度表达Atg1，显示caspase激活()。同样，末端尿苷缺口末端标记（TUNEL）显示22%的Atg1过度表达细胞中存在DNA片段()。与这些观察结果一致，caspase抑制剂p35的共同表达足以延迟Atg1过度表达细胞的死亡，尽管这些细胞最终也被清除()。在克隆性过度表达Atg1的脂肪体细胞中观察到对Caspase-3激活和TUNEL染色的类似作用(&E）。我们还观察到，Atg1过度表达导致这些细胞外围丝状肌动蛋白染色减少或缺失，并且它们经常变得支离破碎和/或被邻近的野生型细胞吞噬(&G）。
脂肪体中Atg1的组成性表达（参见)也导致大量细胞凋亡（caspase激活阳性13%，TUNEL阳性17%；补充图S3I），并且这种细胞死亡在附件3突变体（p<0.0001；补充图S3J）。由于克隆Atg1过度表达，TUNEL和活性Caspase-3染色也分别减少了33%和35%附件8a突变体，与Atg1诱导的Lysotracker染色的部分减少一致（参见)和消除（参见)。这些结果表明，在Atg1过表达细胞中观察到的凋亡是由于高水平的自噬。
Atg1过度表达导致的眼睛尺寸减小（与补充图S2F和S2G相比）似乎也部分归因于凋亡，因为caspase抑制剂DIAP1或p35的共同表达导致了该表型的部分抑制（补充图S2H和数据未显示）。最后，我们发现，由GMR-GAL4介导的Atg1过度表达导致成人生存能力下降，并且这被p35或DIAP1的共同表达所抑制（补充图S2D）。
总之，这些结果表明，Atg1的结构性过表达导致一种细胞死亡形式，这种死亡形式既依赖于半胱天冬酶又依赖于自噬，具有典型的凋亡特征，如DNA和细胞骨架断裂。因此，我们得出结论，除了促进细胞存活外，自噬在诱导到高水平时还具有促进细胞死亡的能力。
Atg1依赖性表型受TOR/PI3K途径调控
在酵母中，TOR信号对自噬的抑制部分通过调节含有Atg1、Atg13和Atg17的多蛋白复合物的组装和活性转导到核心Atg机制。在生长促进条件下，Atg13的TOR依赖性过度磷酸化降低了其对Atg1的亲和力，导致Atg13从复合物中解离，并降低了Atg1的激酶活性。TOR失活后，Atg13的去磷酸化增加了其对Atg1的亲和力，导致Atg1激酶活性增加和自噬诱导[18]. 由于尚未在动物中鉴定出Atg13或Atg17的同源物，因此在高等真核生物中，TOR信号调节Atg1的这些方面是否保守尚不清楚。
为了研究果蝇TOR和Atg1之间的联系，我们测试了TOR活性的增加是否影响了Atg1过度表达诱导自噬的能力。如上所述，热休克驱动的Atg1过度表达导致正常喂养的幼虫脂肪体内诱导自噬(&E）。然而，我们发现在动物中Tsc2型作为TOR的负调控因子，热休克诱导的Atg1过度表达诱导的自噬明显减少(&E）。同样，通过脂肪体中Atg1的组成性表达诱导自噬和抑制细胞生长()被小GTPase Rheb（TOR信号上游激活物）的共同表达强烈抑制()。Rheb的过度表达也显著延迟了Atg1过度表达引起的翼盘细胞的消除()。这些结果与果蝇中的TOR信号可能像在酵母中一样抑制Atg1活性的想法一致，尽管它们不排除Atg1和TOR对自噬的平行相反输入。
Atg1对TOR信号进行负面反馈
虽然对酵母的研究表明，Atg1与自噬机制的多种成分直接相关，但Atg1过度表达对果蝇细胞生长和自噬的影响原则上可能是间接的，例如通过调节调节自噬信号通路，如PI3K和TOR。为了解决这种可能性，我们检测了Atg1过度表达对PI3K和TOR活性的细胞和生化标记物的影响。转录因子FOXO的细胞内定位是体内PI3K活性的读出，因为它在PI3K低活性的条件下存在于细胞核中，并在Akt依赖PI3K的磷酸化作用下重新定位到细胞质[36]. FOXO本身也被证明能诱导自噬[29]. 然而，我们发现脂肪体细胞中Atg1的过度表达没有改变FOXO定位()表明Atg1的过度表达不会通过影响Akt上游的TOR/PI3K信号传导而诱导自噬。
Atg1对TOR的反馈。
（A） Atg1过度表达（GFP阳性细胞）不会导致FOXO（红色）定位于细胞核（箭头）。插图显示FOXO频道。
（B）托尔空细胞（GFP、箭头的丢失）比周围野生型细胞小70%；p<0.0001。插图显示了卵磷脂通道。
（C-D）Atg1在托尔突变背景。在托尔无效动物，过表达Atg1的细胞（GFP阳性细胞）显示Lysotracker染色增加（C）和大小减少58%（D）；p=0.0003。（D）中的DNA通道显示了三个具有代表性的共焦截面。（C）中的插图显示Lysotracker通道，克隆边界轮廓为黄色。插图（D）显示了阴茎肽通道；箭头表示Atg1过度表达的细胞。
（E） Western blot显示，过度表达Atg1的幼虫脂肪体中S6K磷酸化降低，而过度表达Atg 1和Rheb的动物脂肪体中则没有。
（F） Atg1的抑制性反馈。
比例尺代表10μm。细胞核用蓝色标记。
基因型：（A）高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/UAS附件16亿.（B）高速飞行计划;托尔Δ对 FRT40A型/UAS-2x eGFP FRT40A fb-GAL4型.（C）高速飞行计划;托尔Δ对/托尔Δ对;法案>CD2（CD2）>GAL4 UAS-GFP UAS-Atg1GS10797标准/+. （D）高速飞行计划;托尔Δ对/托尔Δ对;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/UAS附件16亿（E）控制：热休克蛋白70-GAL4/+. 附件1：热休克蛋白70-GAL4/UAS附件16亿.Rheb：热休克蛋白70-GAL4/UAS-Rheb公司EP50.084-loxP.附件1 Rheb：热休克蛋白70-GAL4/UAS附件16亿UAS-Rheb公司EP50.084-loxP型.
作为TOR活性的测量，我们检测了Atg1过表达对S6K磷酸化的影响。TOR在Thr398特异性磷酸化果蝇S6K，与哺乳动物S6K1的Thr389同源[12]. Western blot分析表明，虽然过度表达Atg1的幼虫脂肪体中S6K的总水平略有增加，但在Thr398处S6K的磷酸化显著降低()。Rheb过表达如预期增加了S6K磷酸化水平，并在与Atg1共表达时恢复了S6K的磷酸化。这些结果表明，Atg1过度表达导致TOR活性下调。虽然理论上，仅此效应就可以解释Atg1过度表达对自噬和细胞大小的影响，但一些观察结果表明情况并非如此。托尔突变脂肪体细胞显示结构性自噬[5]并且尺寸减小()。然而，我们发现Atg1在托尔无效突变动物导致自噬进一步增加()细胞尺寸进一步减小()表明这些影响在很大程度上独立于TOR。此外，Atg1过度表达细胞的生长减少比托尔无突变细胞（94%对70%；p<0.0001；比较图&)进一步表明Atg1表达细胞的尺寸缩小至少部分依赖于TOR。因此，通过Atg1过度表达下调TOR活性并不能完全解释其对自噬和细胞大小的影响。相反，这些数据最好用一个模型来描述，根据该模型，Atg1过度表达会对TOR产生负面反馈()导致自噬的进一步激活和细胞生长的减少。
Atg1的激酶结构域对诱导自噬至关重要
如上所述，目前尚不清楚Atg1的激酶活性是否是正确诱导酵母自噬所必需的。为了解决这个问题，我们产生了果蝇Atg1（Atg1）的激酶阴性突变体K38Q公司)通过在激酶结构域的ATP结合位点对赖氨酸38进行定点突变。该残基与酵母Atg1的赖氨酸54同源，这已被证明是正常激酶活性所必需的[18].
我们发现Atg1的表达K38Q公司不会导致正常喂养的动物脂肪体自噬增加()也无法挽救自噬缺陷附件1空突变体（补充图S1D&G）。与这些结果一致，Atg1的克隆表达K38Q公司在翼想象盘中没有导致细胞消除、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活或DNA断裂(和未显示的数据），与野生型Atg1不同。有趣的是，我们发现Atg1的表达K38Q公司当在克隆中表达时，足以抑制饥饿或雷帕霉素诱导的自噬(和补充图S1F）或整个脂肪体（对比图&;)这表明激酶缺陷型Atg1干扰野生型Atgl的功能，充当显性阴性突变体。类似地，Atg1的表达K38Q公司在眼睛中，部分挽救了因Atg1过度表达导致的致死率和成人眼睛尺寸减小，但单独表达时对眼睛形态没有影响（补充图S2D、I和J）。
诱导自噬需要Atg1激酶活性。
（A-D）激酶缺陷型Atg1的表达抑制自噬。附件1K38Q公司表达对喂食动物的自噬没有影响（A），但细胞会自动抑制饥饿动物脂肪体内自噬的诱导（B）。通过饥饿（C）诱导的全组织自噬被激酶失活的Atg1（D）的表达所抑制。插图显示了各个图像的Lysotracker通道，克隆边界用黄色勾勒出来。
（E） Lysotracker染色定量。*表明与野生型有显著差异：p<0.0001。
（F） 翼盘细胞过度表达激酶缺陷型Atg1并没有被消除。GFP阳性细胞的平均数量表示为占总细胞的百分比。†与野生型对照无显著差异：p>0.1。
（G） 激酶缺陷型Atg1导致TOR信号的适度减少。非连续车道由相同的Western blot显示。
比例尺代表10μm。细胞核用蓝色标记。错误条指示SD。
基因型：（A-B）高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/UAS附件1KQ13A公司.（C）Cg-GAL4/+. （D）Cg-GAL4/+;UAS附件1KQ13A公司/+. （E） 如面板C和D（F）控制：高速飞行计划/+；法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/+。附件1K38Q公司:高速飞行计划/+;法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/UAS附件1KQ13A公司（G）控制：Hsp70-GAL4型/+. 附件1：热休克蛋白70-GAL4/UAS附件16亿.附件1K38Q公司:热休克蛋白70-GAL4/UAS附件1KQ13A公司.
Atg1的表达K38Q公司然而，并非完全没有影响，因为我们观察到它导致TOR活性的部分降低()以及单元格大小的适度减小（请参见&B）。这些发现暗示了Atg1的一种不依赖其激酶活性的as-y未定功能。事实上，Atg1K38Q公司能够营救的比例很低附件1突变体飞至成年（补充图S1A）表明Atg1在自噬调节之外具有激酶依赖性功能。因此，我们得出结论，虽然Atg1似乎具有不确定的激酶依赖性功能，但Atg1的激酶活性对其促进果蝇自噬的能力至关重要。
讨论
Atg1对自噬的调节
通过自噬将细胞质成分传递到溶酶体涉及多个不同的步骤，包括自噬体的成核、扩张和闭合，以及随后与溶酶体的融合。这些膜转运事件需要大量自噬特异性Atg蛋白的招募和随后的检索，以及与囊泡转运有关的一般因素。鉴于这种复杂性，一个Atg蛋白的过度表达足以完成这一过程中的所有关键步骤的发现是引人注目的。在大多数真核细胞中，自噬以基本速率发生[6]，通过过度表达Atg1加速单个速率限制步骤可能足以增加自噬的总体速率。或者，Atg1与多个Atg蛋白的相互作用表明Atg1可能在自噬过程中的多个步骤发挥作用。相关的标识体内Atg1的底物将有助于澄清这一问题。最近的一项酵母蛋白质组微阵列研究发现在体外Atg1的底物，包括Atg8和Atg18，分别在自噬体扩张和自噬机制成分的恢复中起作用，以及与小泡运输和空泡功能有关的一般因素[21].
酵母Atg1激酶活性在调节自噬中的作用存在一些争议，因为不同群体得出了相互矛盾的结论。然而，共识可能是自噬和CVT途径需要不同水平的Atg1激酶活性，或者Atg1在不同营养条件下具有不同的底物。在高等真核生物中，Atg1激酶活性的作用可能与酵母中不同，因为后生动物细胞中没有观察到CVT途径。与Ohsumi及其同事的发现一致[18,24]然而，我们的结果表明，果蝇Atg1的激酶结构域是自噬所必需的，作为激酶活性的Atg1k38克突变体未能恢复饥饿诱导的自噬附件1突变体，并且在过度表达时无法诱导自噬。然而，在Atg1表达后观察到细胞大小和TOR活性的部分减少K38Q公司以及对附件1突变体，表明Atg1可能具有除调节自噬外的其他激酶依赖性功能。
上游信号通路调节Atg1的机制也可能在酵母和多细胞生物之间有所不同，因为TOR调节的Atg1复合体（如Atg13和Atg17）的基本成分在动物基因组中不易识别。尽管如此，我们的结果与TOR对Atg1的类似负调控一致，如Rheb过度表达或Tsc2型突变抑制了Atg1诱导自噬的能力。随着TOR信号的丢失，Atg1活性的增加可能对细胞内环境稳定和生存至关重要，因为动物对附件1和托尔显示合成胚胎致死表型[5]. 此外，我们的结果显示了一种从Atg1到TOR的意外信号模式，其中Atg1水平的增加导致TOR激酶活性的下调。目前尚不清楚这是否反映了Atg1对TOR或上游调节因子活性的直接影响，或这些细胞中高水平自噬的间接后果，可能是通过增加TOR信号成分的周转。发现TOR蛋白池存在于细胞内小泡[32,37]并且TOR信号在胞内突变体中减少[32]提示TOR活性可能会对囊泡贩运的速率作出反应，例如自噬。无论机制如何，这些结果表明存在自我增强反馈回路，由此增加的Atg1水平导致TOR活性下调，导致Atg1进一步激活。相反，我们之前已经证明，对TOR信号丢失的诱导自噬被S6K的失活所抑制，而S6K是正常自噬所必需的[5]. 因此，TOR介导的自噬调节包括正反馈和负反馈。
自噬对细胞生长的负面影响
自噬是一个分解代谢过程，与细胞生长呈负相关，表明生长受限细胞中自噬水平的增加可能导致其生长速度降低。本文的结果为该模型提供了遗传支持。我们的数据表明，在正常诱导自噬的生理条件下，包括饥饿和雷帕霉素治疗，自噬缺陷细胞的克隆比野生型细胞具有生长优势。这些结果被过度表达Atg1的细胞的显著缩小所证实，进一步支持了自噬作为TOR信号中生长的负效应物的作用。因此，自噬在一定程度上负责TOR信号生理抑制导致的生长限制，并且能够独立于TOR信号抑制生长。
与我们在自噬缺陷细胞中观察到的生长优势相反，以前使用酵母或培养的哺乳动物细胞的研究报告称，抑制自噬会导致细胞快速死亡以应对饥饿[2,17]. 这种差异可能是由于我们实验的镶嵌性质，其中克隆了附件1突变细胞被具有自噬能力的野生型细胞包围，实际上可能寄生通过其邻居的自噬活动释放的营养物质。这可能在专门用于储存和动员营养物质的脂肪体细胞中尤为明显。我们注意到，这种基因镶嵌与野生型组织中肿瘤细胞面临的情况相似。因此，自噬破坏导致的生长能力增加可能有助于肿瘤抑制剂如PTEN、TSC1&2、beclin 1/Atg6突变细胞的致瘤性[5,7,8]可能还有LC3/Atg8和Atg7[38].
尽管自噬在生理条件下对细胞生长有抑制作用，但在TOR信号严重受损的细胞中，情况并非如此，例如在TOR基因突变为空的细胞中预测值k1（本报告）或托尔[5]尽管这些细胞中的细胞生长减少和自噬增加有很强的相关性。自噬的破坏对小鼠的生长没有影响Pdk1型空单元格，实际上导致单元格大小进一步减小托尔突变体。在完全缺乏TOR信号的情况下，营养素摄入严重减少[32]在这些极端条件下，自噬释放的营养物质的代谢益处可能超过其潜在的生长抑制分解代谢作用。我们的结论是，自噬对细胞生长具有上下文依赖性影响，在严重营养剥夺的条件下提供基本水平的代谢和生长，在TOR信号减少的条件下充当生长的净抑制剂，并在诱导到高水平时强烈抑制细胞生长。这些发现为越来越多的效应器途径和细胞过程增加了自噬，TOR信号通过这些途径控制细胞生长，包括翻译、转录、营养物质输入和内吞。
自噬与细胞死亡
先前在许多实验系统中的研究表明，自噬在细胞死亡中的作用也可能与环境相关。例如，研究发现，在生长因子缺乏、饥饿和神经退化的情况下，自噬可以防止细胞死亡[17,39,40]，但在某些自噬细胞死亡的情况下需要[14-16,41]. 因此，对死亡细胞中自噬结构的观察与自噬在细胞死亡中的因果、中性甚至抑制作用是一致的。通过Atg1过度表达诱导自噬的能力使我们能够直接测试自噬在促进细胞死亡中的潜在作用。我们的结果表明，诱导自噬足以诱导细胞死亡。我们发现，由Atg1诱导的自噬引起的死亡受到caspase抑制的抑制，并与caspase激活、DNA片段化和细胞骨架破坏有关，这表明高水平的自吞噬导致凋亡细胞死亡。最近的研究表明，抗凋亡蛋白Bcl-2的过度表达可以通过与Atg6同源物Beclin 1相互作用来抑制自噬，这进一步支持了凋亡和自噬之间的联系[42]. 无法结合Bcl-2的Beclin 1突变型刺激自噬并促进细胞死亡，类似于Atg1的作用。
自噬可能通过什么机制导致细胞死亡？饥饿诱导的自噬是可逆的，通常不会导致细胞消除，这一观察表明饥饿条件可能对自噬诱导的死亡具有保护作用。诱导自噬在生物合成活性降低的细胞中是可以耐受的，甚至是有益的，但在资源用于持续生长的细胞中可能是有害的。自我限制机制也有助于防止饥饿诱导的自噬持续处于高水平[5,42]. 在自噬细胞死亡期间，自噬机制的交替激活可能会绕过这些反馈机制，导致对细胞具有破坏性的高水平持续自噬。此外附件1基因表达可能是关键的，因为它在饥饿条件下不会上调[27]但其含量在果蝇蛹期开始时达到峰值[43]当诱导自噬细胞死亡时。自噬性细胞死亡也可能是由特定促生存或死亡抑制因子的选择性降解引起的。在这方面，最近的研究表明，caspase抑制剂zVAD导致过氧化氢酶的靶向自噬降解，导致自由基氧物种的积累和死亡[16].
结束语
总之，我们的结果表明，自噬的构成诱导抑制细胞生长并导致细胞死亡，这突出了抑制这一过程的生理机制的重要性。此外，Atg1表达足以诱导自噬的发现为自噬实验或治疗操作提供了新的工具。靶向Atg1激酶活性的化合物可能会为与自噬相关的广泛疾病带来新的治疗方法。
