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.2011年7月；7(7):737-47.
doi:10.4161/auto.7.7.15491。 Epub 2011年7月1日。

ULK1抑制mTORC1信号传导，促进多位点猛禽磷酸化并阻碍底物结合

伊莱恩·邓洛普 1, 大卫·K·亨特, 雨果A Acosta-Jaquez, 黛安·芬加, Andrew R T恤
附属公司

ULK1抑制mTORC1信号传导，促进多位点猛禽磷酸化并阻碍底物结合

伊莱恩·邓洛普等人。 自噬. 2011年7月.

摘要

蛋白质合成和自噬是控制细胞生长以响应营养供应的两个相反过程。雷帕霉素复合物1（mTORC1）通路的哺乳动物/机械靶点，作为控制蛋白质合成的主调节器，最近被证明通过磷酸化和灭活一种自噬调节蛋白ULK1来抑制自噬。ULK1还抑制mTORC1底物S6K1的磷酸化，表明mTORC1-ULK1之间存在复杂的信号相互作用。在这里，我们证明ULK1在体内和体外诱导猛禽的多位点磷酸化。使用磷酸特异性抗体，我们确定Ser855和Ser859被ULK1强烈磷酸化，还观察到Ser792中度磷酸化。有趣的是，ULK1的过度表达也以mTORC1依赖的方式增加了猛禽Ser863和mTOR自身磷酸化位点Ser2481的磷酸化。尽管有证据表明ULK1过度表达后mTORC1激酶活性升高，但mTORC1-介导的S6K1和4E-BP1磷酸化被显著抑制。ULK1的表达对mTORC1组分之间的蛋白质相互作用没有影响，但会降低猛禽与底物4E-BP1结合的能力。此外，ULK1的shRNA敲除导致mTORC1底物磷酸化增加，Raptor在Ser859和Ser792的磷酸化降低。我们提出了一种新的机制，即ULK1通过阻碍底物与猛禽的对接来促进mTORC1抑制。这是一个新的负反馈回路，发生在自噬激活时，以在营养供应受限时维持mTORC1抑制。

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数字

图1
图1
ULK1诱导猛禽的磷酸化。（A） 将转染Myc-mTOR、HA-Raptor、HA-mLST8和V5标记的ULK1（如有指示）的HEK293细胞用放射标记[32P] -正磷酸盐。裂解后，使用抗HA抗体免疫沉淀mTOR/Raptor/mLST8，并通过放射自显影术评估mTORC1组分的磷酸化。（B） HA-Raptor和V5-ULK1在HEK293细胞中共表达，Raptor通过HA-免疫沉淀纯化。如图所示，用SAP处理一个样本。采用蛋白质印迹法测定猛禽的活动性。（C） 用HA-Raptor和野生型（WT）或激酶死亡（KD）V5-ULK1联合转染HEK293细胞。HA-免疫沉淀后，通过western blot评估样本的猛禽活动性。（D） 如（C）所示，但细胞被放射性标记为[32P] -溶解和免疫沉淀前的正磷酸盐。用放射自显影术测定猛禽的磷酸化。
图2
图2
ULK1在293细胞的多个位点上诱导猛禽的磷酸化。（A） 显示猛禽结构的示意图，包括猛禽N末端保守（RNC）结构域、3个HEAT重复序列和7个C末端WD40重复序列。本研究中检测到的磷酸化位点的位置显示在蛋白质的中央区域。（B） 用HA-Raptor和野生型（WT）或激酶死亡（KD）V5-ULK1转染HEK293细胞。在HA免疫沉淀后，使用位点特异性抗体评估样本中猛禽的磷酸化。Total Raptor和ULK1显示为控件。（C） 用Myc-mTOR、HA-Raptor和野生型（WT）或激酶死亡（KD）V5-ULK1转染HEK293细胞，并在裂解前用1µM Ku-0063794处理3 h，如有指示。如（B）所示进行免疫沉淀和蛋白印迹，以总mTOR、猛禽和ULK1作为对照。
图3
图3
ULK1在体外磷酸化ATG13和猛禽。（A） 通过免疫沉淀野生型（WT）或激酶死亡型（KD）V5-ULK1，然后在γ--[32P] -ATP。[32P] -通过放射自显影术确定放射性标签并入基底。（B） 使用GST-Raptor作为底物和冷ATP，按照（A）中的方法进行分析。使用位点特异性磷酸受体抗体评估样本的猛禽磷酸化。Total Raptor和ULK1显示为控件。
图4
图4
ULK1降低S6K1的磷酸化和活性。（A） 用HA-S6K1转染HEK293细胞（含或不含V5-ULK1），隔夜饥饿血清，并用100 nM胰岛素刺激30分钟，然后在需要的情况下进行裂解。HA-S6K1被免疫沉淀并用于体外激酶检测，以对抗重组rpS6肽。[32P] -通过放射自显影术确定放射性标记并入rpS6。使用磷酸化-Thr389抗体测定S6K1磷酸化。图中显示了三个实验中磷酸-rpS6自载物的密度测定（平均值±SD）。使用学生的t检验进行统计显著性分析，*p<0.01。（B） S6K1检测如（A）所示，但检测是否存在Flag-Rheb表达，而不是胰岛素刺激。S6K1活性通过S6K1的Thr389磷酸化和[32P] -无线电标签并入rpS6。密度测定法[32P] -图中显示了三个实验中放射性标记的rpS6 autorads（平均值±SD）。使用学生t检验进行统计显著性分析，*p<0.05。
图5
图5
ULK1通过mTORC1抑制4E-BP1的磷酸化。（A） HEK293细胞用野生型或激酶死亡的ULK1转染，血清饥饿过夜，然后在裂解前用100nM胰岛素刺激30分钟，如有指示。western blotting分析Ser65处4E-BP1的磷酸化。总计4E-BP1和ULK1显示为对照。图中显示了来自独立实验的磷酸-4E-BP1的密度测定（平均值±SD）。使用学生的t检验进行统计显著性分析，*p<0.01。（B） 如图所示，在存在或不存在活性GST-Rheb（Q64L）的情况下，通过将免疫沉淀的Myc-mTOR/HA-Raptor复合物与重组GST-4E-BP1结合，进行体外mTORC1激酶检测。用磷酸化4E-BP1（Thr37/46）抗体通过western印迹法测定mTORC1激酶活性。图中显示了三个实验中磷酸化-4E-BP1印迹的密度测定（平均值±SD）。使用学生t检验进行统计显著性分析，*p<0.05。
图6
图6
ULK1在不影响mTORC1结合的情况下导致Raptor底物结合丧失。（A） HA-Raptor在V5-ULK1存在或不存在的情况下表达。HA-免疫沉淀后，用western blotting检测内源性mTOR和mLST8与猛禽共免疫沉淀的量。（B） 使用猛禽覆盖试验评估猛禽基质结合。750 ng GST-4E-BP1通过SDS-PAGE溶解并转移至PVDF膜。将其与含Myc-受体的裂解物孵育，并用Myc抗体进行western blotting测定与4E-BP1结合的Myc-受体数量。该图显示了三个实验（平均值±SD）的Raptor-4E-BP1结合的组合密度测定数据。使用学生的t检验进行统计显著性分析，*p<0.01。使用抗-GST和抗V5抗体分别获得GST-4E-BP1和V5-ULK1的总水平。
图7
图7
敲除内源性ULK1可防止猛禽磷酸化并增加mTORC1信号。（A） 使用shRNA敲除内源性ULK1表达，并使用磷酸特异性抗体测定内源性mTORC1底物的磷酸化（左部分）。猛禽的磷酸化通过[32P] -放射性标记纳入内源性猛禽并使用磷酸特异性抗体（右侧）。用Scr shRNA作为对照-血清=无血清DMEM，-aa=氨基酸和无血清Krebs Ringer缓冲液。（B） V5-ULK2和HA-Raptor在HEK293细胞中过度表达。在HA-免疫沉淀后，使用位点特异性抗体测定猛禽的磷酸化。猛禽总水平显示为对照。（C） 在正常生长条件下分析HEK293细胞中内源性磷酸-AMPK（Thr172）和磷酸-ACC（Ser79）的水平，这些细胞在裂解前24小时转染了V5-ULK1或V5-ULK2。总AMPK、ACC、HA-Raptor和V5-ULK1显示为控件。（D） 示意图显示了ULK1介导的mTORC1抑制的拟议机制。ULK1通过mTORC1（mTOR/Lst8/Raptor蛋白复合物）与Raptor的相互作用和磷酸化抑制信号转导（ULK1 P位点：Ser855、Ser859，Ser792弱）。ULK1与Raptor的相互作用干扰mTORC1底物的识别。与ULK1结合的AMPK也磷酸化抑制性Ser792位点。在抑制自噬后，ULK1与猛禽分离，使猛禽能够有效地相互作用并磷酸化mTORC1底物，如Thr389上的S6K1。
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