在动物模型中监测抗肿瘤治疗效果的新方法：结合功能MRI和纹理分析

摘要

背景

功能性磁共振成像（fMRI）发展非常迅速，因为它提供了无创性和精确的成像，特别是其区分组织特征的能力。此外，利用病变的特征，fMRI可实时、无损地测量体内的病理过程，以便早期诊断和治疗评估。两种新型fMRI扫描技术，多b值扩散加权成像（DWI）和动态对比增强MRI（DCE-MRI），有可能检测乳腺癌等主要疾病。总的来说，DCE-MRI在检测乳腺癌方面显示出很高的敏感性（89-100%），DWI在预测适当的治疗方案和监测治疗反应方面显示出了实用性[1]。肿瘤内血管异质性对肿瘤治疗至关重要。因此，抗血管生成治疗被认为是预防肿瘤生长和转移的一种极具前景的新策略。这两种功能性MRI技术能够测量微血管结构并反映其通透性[2]。DCE-MRI的几个定性和半定量参数，从时间-强度曲线的简单半定量检查到更复杂的示踪动力学模型，可以提供肿瘤内血管通透性的信息[三]。此外，表观扩散系数（ADC）的值基于肿瘤组织的相对信号强度变化，在多b值DWI中随着b值的增加而增加，可以提供细胞水平的显微结构信息。ADC值的变化与组织和细胞密度呈负相关[4,5]。因此，这两种成像方法有可能用于监测和评估治疗早期抗血管生成治疗的疗效。

最近的临床研究表明，贝伐单抗（bevacizumab）是一种基因工程人源化单克隆抗体，由于其抗血管内皮生长因子（VEGF）的活性，在治疗各种肿瘤方面非常有效。贝伐单抗可以特异性地与VEGF结合，阻止VEGF与VEGFR的结合，从而抑制新血管的形成，并以低毒性抑制肿瘤生长[6]。作为对照，另一种常用的化疗药物紫杉醇可以与β-微管蛋白结合并稳定微管，从而抑制细胞有丝分裂和细胞增殖[7]。如上所述，一种有希望的方法是结合使用多b值DWI和DCE-MRI来评估贝伐单抗与紫杉醇的抗血管生成活性。

为了确保我们研究的准确性，我们采用了另一种新技术——纹理分析，来分析和验证成像结果。纹理分析作为一种新的肿瘤成像生物标志物，可以量化肿瘤的区域异质性，这是公认的恶性肿瘤特征，与侵袭性生物学、不良预后和治疗耐药性有关[8]。因此，该图像处理算法可以通过评估纹理粗糙度的分布来扫描细微的肿瘤内异常。重要的纹理参数，包括平均强度、灰度直方图分布的标准差、熵（灰度分布的不规则性）、偏度（直方图的不对称性）和峰度（直方图的平坦性），可以反映从解剖结构到生物功能的各种信息[9]。先前的研究表明，与其他成像和生物学参数相比，粗糙纹理特征可能反映CD34定义的潜在血管系统[10]。根据本研究，对功能性MRI表现进行纹理分析并评估结果之间的相关性是有价值的。

方法

结果

肿瘤大小测量

对照组、紫杉醇单药组和联合治疗组的基线肿瘤体积为192.4 ± 47.7毫米^三, 263.7 ± 82.8毫米^三和195.3 ± 85.2毫米^三分别无显著差异(P（P） = 0.26). 同样，在治疗后第7天，这三组中的4个T1肿瘤的生长没有显示出明显差异（对照组、紫杉醇组、紫杉醇加贝伐单抗组：156.5 ± 48.7%, 119.3 ± 42.0%和118.7 ± 48.0%；P（P） = 0.60). 然而，治疗15天后，测量结果显示，对照组的肿瘤明显大于联合治疗组。肿瘤体积达到652.5 ± 142.8毫米^三未经治疗，肿瘤体积仅为416.2 ± 157.5毫米^三紫杉醇和贝伐单抗联合治疗(P（P） = 0.018）。紫杉醇组的平均体积为521.2 ± 129.0毫米^三因此，在对照组和紫杉醇单药治疗组之间没有发现明显差异(P（P） = 0.177），两个治疗组之间的区别不太直观(P（P） = 0.055）（图1).

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图1

三组患者的肿瘤生长趋势。一不同疗法治疗前、治疗7天和15天后的轴向T2WI图像。在整个过程中，对照组肿瘤变大，生长速度最快，导致试验结束时周围器官严重收缩。然而，联合治疗组的肿瘤生长最慢，在治疗后期肿瘤相对较小且较浅。紫杉醇组的生长速度介于中间。b条肿瘤体积的百分比变化。对照组肿瘤几乎呈线性生长。治疗后第7天，三组之间没有显著差异(P（P） = 0.60). 然而，在治疗结束时，与第15天的对照组相比，紫杉醇和贝伐单抗联合治疗明显抑制了肿瘤生长(P（P） = 0.018)

DWI结果

所有治疗后的多b值扩散加权成像（DWI）显示ADC呈增加趋势_缓慢的这三组的价值，尤其是联合治疗组的价值显著增加（对照组：42.17 ± 19.0%，紫杉醇：53.74 ± 24.16%，联合治疗组：118.84 ± 47.59%，P（P） = 0.002). 对照组和联合治疗组之间存在显著差异(P（P） = 0.001），两个治疗组的差异相同(P（P） = 0.008). 遗憾的是，对照组和紫杉醇单药组之间没有发现明显差异(P（P） = 0.269). 更显著的是，灌注分数（f）值表现出相反的行为。在对照组和紫杉醇组中观察到f值的增长趋势（对照组：36.72 ± 17.47%; 紫杉醇：52.24 ± 36.35%），但贝伐单抗和紫杉醇联合组表现出下降（− 25.12 ± 47.39%）。这些变化趋势在三组之间造成了显著差异(P（P） = 0.010）。同时，对照组和联合治疗组之间以及两个治疗组之间的统计差异非常显著(P（P） = 0.013,P（P） = 分别为0.005）。对照组和紫杉醇单药组之间的f值没有显著差异(P（P） = 0.671）（图2).

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图2

多b值DWI产生三组。一不同疗法治疗前、治疗7天和15天后的DWI和ADC图。皮下肿瘤（白色箭头）被植入膀胱附近（红色箭头）。从ADC图中可以看出，肿瘤（蓝色）中的水分子扩散比膀胱（红色）中的低得多。对照组肿瘤区域扩散较低。然而，经过7天的抗肿瘤治疗后，紫杉醇组和联合组的水扩散限制均得到改善（肿瘤中心区域显示稍高的绿色信号）。此外，在治疗15天后，联合组的改善更为明显。同时，在ADCslow中观察到显著的差异(b条)和灌注分数（f）(c（c）)三组治疗前后比较。变化趋势由方差分析得出，根据各自的不同模式反映了治疗15天后的变化

DCE-MRI结果

对三组抗肿瘤治疗前后的DCE-MRI结果进行比较分析，显示出显著差异。传输速率常数（K^反式)两个治疗组的数值均显著下降，而对照组的数值则有所增加（紫杉醇：-28.8 ± 20.3%; 联合治疗组：− 55.42 ± 30.43%; 控制：127.37 ± 76.7%;P（P） = 0.016）。因此，统计结果与DWI调查结果非常相似。对照组和联合治疗组之间存在显著差异(P（P） = 0.003）或两个治疗组之间(P（P） = 0.044). 在K中未检测到显著差异^反式对照组和紫杉醇单药组的数值(P（P） = 0.219). 此外，三组之间的其他参数没有显著差异（图三).

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图3

DCE-MRI分为三组。一K系列^反式这三组患者治疗前和治疗15天后的DCE-MRI图谱。如图所示，治疗前肿瘤边缘的血液供应（红色/绿色）比中心部分（蓝色）更丰富。然而，在15天的处理过程中出现了一些分歧。对照组的血液供应更充足，其他两组的分布趋势几乎相反，尤其是联合组。定量分析结果进一步证实了这些变化，并显示出K的显著差异^反式b条三组治疗前后比较。变化趋势也来源于方差分析

免疫组织化学结果

对4例T1移植瘤的组织学分析表明，联合治疗可显著抑制肿瘤，CD31免疫染色对新生血管的特异性高于CD34。通过CD31对微血管密度（MVD）进行定量分析，发现联合治疗组在治疗15天后微血管密度明显下降，与其他两组（联合治疗组：- 17.61 ± 23.16%与对照组：31.39 ± 30.41%与紫杉醇：30.12 ± 27.65%). 这些检测结果也有显著的统计差异（联合治疗与对照/紫杉醇：P（P） = 0.007/P（P） = 0.006). 此外，对照组和紫杉醇单药治疗组的MVD变化趋势相同，没有造成显著差异(P（P） = 0.907).

VEGF的平均光密度在这些组之间也显示出相同的变化。通过贝伐单抗和紫杉醇的联合治疗，VEGF的平均光密度降低（− 13.50 ± 57.25%），但对照组和紫杉醇单药组表现出增加（14.20 ± 44.41%, 27.50 ± 分别为96.19%）（图4).

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图4

免疫组织化学结果（× 200）治疗15天后，用CD31和VEGF染色对照、紫杉醇和联合治疗肿瘤。目标物质被染成棕黄色。联合治疗组CD31测定的微血管密度（MVD）和VEGF的光密度均明显低于其他两组

相关分析结果

为了进一步阐明我们的研究，我们对上述结果进行了关联研究。该分析包括MVD与DWI/DCE-MRI、DWI与DCE-MRI以及纹理分析与DWI/DC E-MRI的比较^反式为0.612(P（P） = 0.012），MVD与ADC的对比_缓慢的是− 0.810 (P（P） = 0.001），MVD与灌注分数（f）的比值为0.580(P（P） = 0.019），K的值_{电动自行车}与ADC相比_快速的是− 0.593 (P（P） = 0.016），ADC的_缓慢的与熵之比为− 0.503美元(P（P） = 0.047）和ADC_缓慢的与MPP相比为0.603(P（P） = 0.013). 此外，MVD与VEGF的表达呈正相关(第页 = 0.563,P（P） = 0.023）（图5).

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图5

这些线性图可用于直接反映各种参数之间的相关性。MVD与K之间存在显著的正线性相关性^反式灌注分数（f）和VEGF。然而，MVD和ADC_缓慢的呈负相关。此外，ADC_缓慢的值与熵呈显著负相关，与MPP呈正相关。多b值DWI的影像学参数与DCE-MRI之间也有很强的相关性，例如ADC与_快速的和K_电子脉冲

讨论

在本研究中，我们旨在开发一种实用的方法来评估早期抗肿瘤治疗的疗效。以前的研究表明，血管生成可以为肿瘤提供营养和氧气，因此在肿瘤进展中起着至关重要的作用[16]。肿瘤在血管受累时呈指数级增长，但在无血管环境中缓慢线性增长[17]。因此，抗血管生成在肿瘤治疗中具有不可替代的作用，以肿瘤血管生成为靶点的抗肿瘤药物已成为近年来的研究热点。贝伐单抗是FDA批准的第一种抑制肿瘤血管生成的药物，其在阻断VEGF诱导的血管生成方面具有很高的亲和力，可以诱导内皮细胞的增殖和迁移，增加微血管的通透性[18]。通常，评价药物是否成功抑制肿瘤血管生成的金标准是MVD计数。然而，在临床实践中，通过计算微血管密度，几乎不可能连续地从患者体内清除肿瘤组织来实时观察抗血管生成治疗的疗效。令人鼓舞的是，我们的研究证实，这个问题可以通过一种新的多参数融合分析来解决。

在这项临床前研究中，我们发现许多重要的成像参数对不同的治疗很敏感。在添加贝伐单抗后，联合治疗组的功能MRI和纹理分析的变化非常显著，导致肿瘤体积与其他组相比存在差异。DWI在反映组织的微观结构（高b值）和血液灌注状态（低b值）方面具有很大的优势，尤其是其关键参数ADC[19,20]。因此，如果治疗有效，细胞完整性将被破坏，那么ADC_缓慢的从高b值DWI中得出的值将因水扩散的增强而上升[21]这得到了我们的研究结果的支持。随着肿瘤中心位置坏死的发生，ADC_缓慢的未经任何治疗，对照组的数值略有增加。然而，当贝伐单抗阻断血管生成时，肿瘤生长所需的营养素将不足，由此导致的细胞密度降低将导致ADC显著增加_缓慢的值。同时，实验数据表明，紫杉醇对细胞有丝分裂的抑制导致的细胞密度降低不如贝伐单抗，但ADC增加_缓慢的与对照组相似。此外，f值直接评估了血液灌注，并显示出各组之间低b值DWI的显著差异。结果与ADC对比_缓慢的抗血管生成治疗导致治疗开始后15天f值显著降低，但其他两组表现出相反的趋势。此外，f值的变化与MVD密切相关，但ADC的变化_缓慢的与微血管计数呈显著负相关。DWI参数和组织学结果的非常有意义的相关性与早期研究完全一致，研究表明DWI可用于监测血管靶向药物的早期治疗效果[22].

DCE-MRI是组织血液灌注无创评估的最常用技术，是通过跟踪Gd-DTPA的药代动力学来监测各种治疗效果的有效方法[23]。反映血管通透性、血流量和血容量的最常用参数是K^反式.与其他参数相结合，如K_{电动自行车}，K^反式可以在一定程度上反映肿瘤血管生成的程度[24,25]。我们的研究表明，高钾^反式对照组随着肿瘤的生长而出现数值。这一发现与两个治疗组（如K^反式价值不断下降。K的增加^反式这些数值表明，肿瘤血液灌注增加，毛细血管通透性增加，为肿瘤生长提供了更多营养，最终加速了肿瘤细胞的增殖。在实验后期，对照组的皮下肿瘤体积明显大于其他两组，这为K提供了很好的验证^反式此外，两个治疗组的下降趋势显著不同是由紫杉醇和贝伐单抗的不同机制引起的。紫杉醇通过抑制微管系统具有明确的抗肿瘤作用。然而，一些学者证实贝伐单抗可以改善紫杉醇的给药和疗效[26]。贝伐单抗抑制血管生成和血管通透性可确保紫杉醇的浓度。体积的显著变化，K^反式与单纯紫杉醇组和对照组相比，联合组的其他影像学参数可能发生变化，因为治疗持续时间不够长，导致紫杉醇单药组与对照组之间存在明显差异。令人鼓舞的是，组织学结果与DCE-MRI一致。MVD计数与K^反式通过贝伐单抗治疗，联合组VEGF的表达降低。近年来，K受到了越来越多的关注_{电动自行车}之前的研究表明，K的高基线值_{电动自行车}对应于血浆和血管外细胞间隙（EES）之间药物的高交换分数，表明潜在的优越治疗效果[27]。最有可能的是，个体差异、肿瘤细胞坏死等因素导致造影剂残留在间质空间并导致血管外细胞外渗透量的误差，最终导致K缺乏显著变化_{电动自行车}在我们的研究中。另一方面，K_{电动自行车}也受到V的显著影响_电子根据Tofts的说法，这可能由细胞密度、囊性变性和组织反应等因素决定[28]，V_电子不是一个非常稳定的因素，因为它经常受到病变周围水肿的影响。然而，当我们分析DCE-MRI和DWI之间的相关性时，我们发现K_电子脉冲与ADC呈负相关_快速的从低b值DWI中提取。由于双指数模型中的ADC值主要反映肿瘤密度特征，肿瘤密度的增加必然会影响造影剂从EES返回血浆的速率。因此，从上述分析可以得出结论，多b值DWI和DCE在评估血管生成功能和肿瘤灌注方面是互补的。

虽然多b值DWI和DCE-MRI为监测肿瘤生长和肿瘤治疗效果提供了大量信息，但这两种成像技术可能受到许多因素的影响，例如肿瘤组织的不均匀性、，皮下肿瘤模型和动物在成像过程中的运动产生的伪影[29]。此外，临床图像在反映病变的细胞和分子特征方面也有一些局限性，如细胞增殖和代谢、坏死和缺氧[30]。最近，越来越多的研究试图通过纹理分析来阐明医学图像异质性的测量，纹理分析是一种二阶统计技术，其参数来源于局部特征的分布，可以更好地描述组织特征、图像分割、，并预测治疗反应和生存率[31,32]。因此，该潜在工具的主要优点是可以最大限度地利用临床图像中的信息，而无需额外采集[9]。在我们的研究中必须充分利用这一优势。通过测量未增强的T2加权MRI，我们发现所有移植瘤荷瘤小鼠在治疗前都处于相同的状态，但随着治疗和各种处理，三组在所有SSF下的熵值显著增加。熵表示ROI中像素的无序程度，其值越高，组织的无序度越大。之前的一份出版物显示，严重程度与纹理粗糙度有关，纹理粗糙度与葡萄糖摄取测量值相关（从FDG-PET、，第页 = 0.51,P（P） = 0.03）[33]。因此，很明显，葡萄糖代谢的增加使这4个T1同种异体移植瘤的生长速度增加，这与所有小鼠肿瘤的增大相一致。根据Ng等人[34]肿瘤组织的异质性随着生长而增加。根据Ganeshan等人[10]和Henriksson等人[30]肿瘤内部图像异质性的增加可能与区域肿瘤细胞数、增殖、缺氧、血管生成和坏死的差异有关。因此，通过贝伐单抗和紫杉醇联合治疗的抗血管生成和抑制细胞有丝分裂的作用，肿瘤的微观结构，包括细胞、细胞外基质和微血管会受到干扰，在细胞和分子水平上产生一系列变化，这些变化太细微，无法使用传统的成像诊断技术进行检测。持续的变化最终导致病灶内像素平均值的显著差异（平均强度，P（P） < 0.05），平均值（SD，P（P） < 0.03). 由于缺乏强有力的有效化疗，其他两组治疗后均未出现明显变化。在一项核医学研究中，学者们发现水分布更不均匀的肿瘤（即高SD和阳性像素平均值MPP）糖酵解作用更强[35]。我们的经验证据也支持这一结论。当贝伐单抗阻断血管生成时，组织灌注的减少限制了肿瘤的氧气供应，导致与治疗前相比，对糖酵解能量的依赖性显著（P_{MP公司P（P）} < 0.05). 支持这一说法的另一个发现是，平均值、SD和MPP的变化都发生在中粗纹理尺度上，这些尺度更倾向于反映生物学特征，作为基于Chowdhury等人的研究的基因组学分析[35]。此外，上述分析适用于不同组之间的比较。细胞和分子水平上的差异，如单一治疗和联合治疗引起的抗增殖、缺氧、血管生成和坏死，最终导致解剖结构的差异（在精细和中等纹理尺度下），体现了像素平均值（平均值、，P（P） < 0.05）和正像素（MPP，P（P） < 0.05）。如上所述，在传统成像参数中可以观察到这些主要结构变化。在我们的研究中，纹理分析不是独立的；它与功能性磁共振成像密切相关。熵与ADC显著负相关_缓慢的(第页 = − 0.503,P（P） < 0.05). 较高的熵表示非均质性增加，这在一定程度上表示水扩散受到限制（较低的表观扩散系数）。令人惊讶的是，MPP值的增加与ADC显著正相关_缓慢的(第页 = 0.603,P（P） = 0.013），可能是因为糖酵解环境（较高的MPP）产生的代谢物增加了细胞膜的渗透性并促进了水分子的扩散。然而，需要进一步确认。

诚然，我们的研究存在一些局限性。6周龄裸鼠的脆弱性和其他因素导致了实验期间的高死亡率；因此，在有限数量的小鼠中建立了动物肿瘤模型。此外，皮下肿瘤模型中气-软组织边界处DWI的敏感性伪影[29]动物在成像过程中的运动，以及植入的肿瘤比原发肿瘤更均质的事实导致了不可避免的系统误差。在进一步的研究中，我们将努力克服这些局限性，探索更加多样化的多模态融合成像方法。

结论

本研究显示，在临床前乳腺癌模型中，使用多b值DWI、DCE-MRI和纹理分析成功监测抗血管生成治疗的早期阶段。通过多参数的集成，DWI、DCE和TexRad提供了从生物学特征到解剖结构的全面而有价值的信息。更令人鼓舞的是，治疗前后关键参数的显著变化与组织学结果具有良好的相关性和一致性。这三种成像和分析技术相辅相成，可能作为非侵入性生物标记物，用于指导治疗算法和监测未来临床试验中抗血管生成治疗的早期反应。

致谢

缩写

作者的贡献

MM、JL和HX设计了实验；MM进行了实验；MM分析数据并撰写手稿；QW、JL、YL和TS提供了材料和分析工具，并进行了统计分析；HX和ZJ设计并监督了整个研究；ZJ参与了讨论、数据解释和手稿修订。所有作者审查并批准了最终稿。

注意事项

参与者信息

明蒙，电子邮件：moc.361@enihsnus_sivam.

薛华丹，电子邮件：moc.liamtoh@59annadjb.

景磊，电子邮件：moc.621@825gnijiel.

王勤，电子邮件：moc.621@825gnijiel.

刘静娟，电子邮件：moc.361@60naujgnijuil.

袁丽，电子邮件：moc.621@8891nauyilgnodnahs.

孙婷，电子邮件：商务部qq@094996646.

徐海燕，电子邮件：nc.ude.cmup@yhux.

金正宇，电话：+86 10 69155442，电子邮件：moc.621@nij_uygnehz.

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