布地奈德、丙酸氟替卡松和阿奇霉素在巨噬细胞感染期间不调节THP-1巨噬细胞和呼吸道病原体的膜泡释放

细菌菌株和培养

选择了以下菌株：流感嗜血杆菌（NTHi，ATCC-49247），铜绿假单胞菌（Psa，ATCC-27853），肺炎链球菌（Spn，ATCC-49619）和临床卡他莫拉菌（Mrc）分离物（荷兰马斯特里赫特大学医学中心（MUMC+））。ATCC菌株具有良好的特性，并被ATCC推荐用于质量控制和抗菌药物敏感性测试。除NTHi外，所有细菌均在血平板上培养过夜，NTHi在5%CO中培养于补充维生素的巧克力琼脂平板（Oxoid，Wesel，Germany）上₂37°C时。过夜预培养后，细菌在0.5 McFarland（1.5×10⁸菌落形成单位（cfu）/ml），并用于感染或培养实验。细菌培养时，使用的细菌为5×10⁷cfu/ml，在10 ml RPMI1640中培养6小时，不含或含BUD、FLUT或AZI。接下来，通过1200×离心处理条件培养基克在室温下保持10分钟。粒化细菌在PBS中清洗、稀释，并使用光学甲基丙烯酸盐一次性试管（美国北卡罗来纳州牛顿市萨斯特特）在600 nm处测定光密度。上清液再次以1200×克持续10分钟，通过0.22µM过滤器过滤上清液。此后，通过在4000×克使用Amicon Ultra-15 10-kDa离心过滤装置（Millipore，Billerica，MA，USA）过滤15分钟。

用于刺激THP1巨噬细胞的MV来自细菌培养物（密度为1×10⁸cfu/ml）在含有5%FCS的30ml完全囊泡贫化培养基中培养4小时后细胞和培养基“第节。培养后，通过两个离心步骤在1200×克过滤10分钟和0.22µm。然后通过超滤和尺寸排除色谱（SEC）进一步处理从细菌中清除的上清液，如下所述。

细胞和培养基

人类单核细胞系THP-1（ATCC-TIB202）保存在RPMI1640（Sigma，St.Louis，MO，USA）中，补充100 mM丙酮酸钠、22.5%葡萄糖、25 mMβ-巯基乙醇和10%胎牛血清（FCS）（比利时Lonza，Verviers），并在5%CO中培养₂37°C时。为了进行单核细胞分化，将细胞接种在一个24孔板中，浓度为0.5×10⁶细胞/孔或在1×10的96 well板中⁴细胞/孔，并用200 nM佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐刺激72小时（PMA；Sigma，St.Louis，MO，USA）。THP-1巨噬细胞刺激在含有5%FCS（完全囊泡缺失培养基）的囊泡缺失介质中进行。该培养基是通过将囊泡缺失的RPMI1640培养基与30%FCS和无FCS培养基（均添加丙酮酸钠和葡萄糖）相结合获得的。通过过夜离心以100000×克在Optima L-90K超离心机中使用70Ti-rot，κ-因子44（均为Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA）。

用于膜泡分析的巨噬细胞感染

接种在24孔板中的THP-1巨噬细胞用PBS冲洗三次，并用完全囊泡缺失培养基替换培养基。此后，用BUD（0.1µM）、FLUT（0.1μM）或AZI（3µg/ml）预处理细胞1 h，之前计算浓度以表示吸入给药后局部获得的浓度（Wagner等人。2015; Olsen等人。1996; Ek等人。1999). 预处理后，巨噬细胞感染其中一种细菌，感染倍数为10，持续6小时。感染后，收集培养基，在300×克和1200×克，用0.22-µM微孔过滤器过滤，然后用流式细胞仪进行分析。

利用超滤和SEC从调节介质中浓缩和纯化MV

对从细菌培养物中获得的细菌净化条件培养基进行超滤（Lobb等人。2015)和证券交易委员会（Böing等人。2014). 首先，以4000×克使用Amicon Ultra-15 10-kDa离心过滤装置在室温下保持15分钟（Millipore，Billerica，MA，USA）（Lobb等人。2015). 然后，SEC使用Sepharose柱对浓缩物进行纯化，如Boíng等人所述，只需稍作修改（Böing等人。2014). 为此，15 ml TELOS过滤柱（Kinesis Scientific Experts，St.Neots，Cambridgeshire，UK）与总共10 ml Sepharose CL-2B（GE Healthcare，Uppsala，Sweden）堆叠在一起。将浓缩物装载到柱上，并使用PBS洗脱0.5 ml的馏分。将MVs高度富集且游离蛋白阴性的馏分（流式细胞术和Micro BCA、Pierce、Rockford、IL、USA测定的馏分7–11）合并并储存在−80°C下，直到进一步使用。

使用抗体包被的乳胶珠对MV进行流式细胞术分析

基于Volgers等人之前描述的方法的基于珠的流式细胞术分析(2017)用于细菌MV和CD63的半定量分析⁺/CD81型⁺主机单元衍生MV。将四个微米大小的醛-硫酸盐珠在MES缓冲液中洗涤，用α-CD63抗体或针对细菌囊泡的抗体包被（Spn除外，因为我们无法建立Spn的这种测定方法）。在室温下以1000 rpm的恒定搅拌下，将抗体涂层珠与感染后获得的处理过的上清液（200µl）孵育过夜。接下来，使用通过含有2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的0.22-µM过滤器过滤的PBS清洗珠子两次，并在室温下连续搅拌下与PE结合检测抗体（宿主细胞囊泡的α-CD81-PE或PE结合的α-细菌抗体）孵育90分钟。根据制造商的说明，使用PE结合试剂盒（美国马萨诸塞州剑桥市Abcam）对细菌抗体进行PE结合。然后，清洗泡床复合物，将其悬浮在PBS（300µl）中，并使用FACSCanto™（BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ，USA）进行流式细胞术分析。根据PE阳性对照珠的百分比（基于培养基），检测下限设定为2%。使用FACSDiva软件进行分析。MVs的相对数量通过阳性小球百分比与中值荧光强度的乘积计算，并表示为相对于对照组的百分比（作为对照组的%）。

可调电阻脉冲传感MV分析

使用qNano Gold、Izon Control Suite Software v3.2和Izon（Izon Science Ltd.，Oxford，UK）提供的EV分析试剂盒（RK1型），使用可调电阻脉冲传感分析确定MV浓度。使用NP150孔进行测量。拉伸固定在47 mm，压力保持在6 mbar，基线电流保持在±100 nA。将溶液G（10%）添加到在溶液Q（1:1）中稀释的上清液中，测量每个样品10分钟，并在发生系统不稳定时重复测量。使用114-nm聚苯乙烯校准珠（CPC100，Izon Science Ltd.，Oxford，UK）以1×10的浓度校准样品⁹在培养基中稀释的颗粒/ml。

巨噬细胞刺激MV

使用接种在96个平板中的巨噬细胞用MV刺激THP-1巨噬细胞。在刺激之前，用PBS冲洗细胞三次，然后用完全囊泡缺失培养基替换培养基。然后用BUD（0.1µM）、FLUT（0.1μM）或AZI（3µg/ml）预处理细胞1小时。接下来，再次清洗细胞，然后将其暴露于20µl含MV的SEC组分中，在完全囊泡完全培养基中，不含BUD、FLUT或AZI或在其存在下，暴露16小时。此后，收集培养上清液并用于细胞因子测量。

细胞因子测量

使用人类Ready-Set-Go TNF-αELISA试剂盒eBioscience（美国加利福尼亚州圣克拉拉市Affymetrix eBioschience），通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定刺激实验上清液中的TNF-β水平。

细菌MV释放对BUD、FLUT和AZI的反应

接下来，我们旨在确定在没有宿主细胞的情况下，细菌MV释放是如何受到BUD、FLUT和AZI的影响的。不使用或使用这些药物培养6小时后，通过可调电阻脉冲传感分析测定囊泡释放。我们观察到，FLUT、BUD和AZI治疗均不影响细菌MV的释放（图3a） ●●●●。

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图3

BUD、FLUT和AZI对培养过程中MV释放和细菌生长的影响。在FLUT、BUD或AZI的持续存在下培养NTHi、Mrc、Spn或Psa 6小时。通过TRPS分析确定MV释放(一)用细菌悬液在600nm处的光密度测定细菌的生长(b条) (n个 = 3, *P（P） < 0.05)

接下来，我们确定FLUT、BUD或AZI是否对细菌生长有任何影响。为了评估这一点，使用FLUT、BUD和AZI处理后，通过测量光密度来确定细菌的相对数量。如图所示3b、 在AZI存在下进行细菌培养后，只有Mrc计数显著降低。

作者感谢荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学医学中心的J.P.Hays博士，感谢他为卡他莫拉菌在本出版物中使用。