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.2011年8月；55（8）：3845-53。
doi:10.1128/AAC.01772-10。 Epub 2011年5月16日。

卡他莫拉菌外膜囊泡携带β-内酰胺酶，通过灭活阿莫西林促进肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的存活

维维卡·沙尔 1, 塞尔·诺德斯特伦, 马蒂亚斯·莫尔盖林, 克里斯蒂安·里斯贝克
附属公司

卡他莫拉菌外膜囊泡携带β-内酰胺酶，通过灭活阿莫西林促进肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的存活

维维卡·沙尔等。 抗菌剂Chemother. 2011年8月.

摘要

卡他莫拉菌是一种常见的病原体，见于上呼吸道感染儿童和慢性阻塞性肺病加重期患者。细菌种类通常与肺炎链球菌和流感嗜血杆菌一起分离。外膜囊泡（OMV）由卡他霉释放，含有磷脂、粘附素和免疫调节化合物，如脂寡糖。我们最近发现卡他分枝杆菌OMV存在于鼻咽定植患者中。由于几乎所有卡他分枝杆菌分离株均为β-内酰胺酶阳性，因此本研究的目的是调查卡他分枝菌OMV是否携带β-内糖酶，并分析OMV是否因此能够阻止阿莫西林诱导的死亡。在兔子体内产生重组β-内酰胺酶并提高抗体。透射电镜、流式细胞术和Western blotting证实OMV携带β-内酰胺酶。此外，酶分析显示卡他分枝杆菌OMV含有活性β-内酰胺酶。OMV（25μg/ml）与阿莫西林孵育1h，阿莫西兰完全水解，浓度高达2.5μg/ml。在功能实验中，阿莫西林（10×MIC）与卡他分枝杆菌OMV预孵育完全解救阿莫西利敏感卡他分枝菌、肺炎链球菌、，β-内酰胺诱导杀灭的b型或非型流感嗜血杆菌。我们的结果表明，源于含β-内酰胺酶OMV的阿莫西林耐药卡他分枝杆菌的存在可能为呼吸道病原体铺平了道路，这些病原体根据定义对β-内肽抗生素敏感。

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数字

图1。
图1。
阿莫西林耐药卡他分枝杆菌菌株产生含OMV的β-内酰胺酶。（A） 八卡他分枝杆菌10株中的菌株对兄弟PCR分析显示该基因（522 bp）。兄弟在菌株KR395和Bc5中未发现等位基因。（B）卡他分枝杆菌对OMV和细菌总裂解物（各10μg）进行SDS-PAGE（左），然后通过Western blotting（右）检测β-内酰胺酶（35kDa）。整体裂解物卡他分枝杆菌RH4和KR395细菌分别作为阳性和阴性对照。还包括重组RH4β-内酰胺酶（0.6μg）。上部带代表37.7kDa大小的重组蛋白。较低的频带很可能是由N端退化引起的。位于C末端的His标签不受降解的影响，因为可以使用亲和层析纯化重组β-内酰胺酶。（C） 使用重组RH4β-内酰胺酶抗血清进行流式细胞术。箭头所示为含有OMV KR526的β-内酰胺酶阳性，而来自Bc5的OMV为阴性。将不含β-内酰胺酶抗血清的OMV（黑色）与孵育有β-内糖酶抗血清（白色）的OMV进行比较。（D） 金标抗β-内酰胺酶抗体通过透射电镜证实了β-内酰胺酶的存在。
图2。
图2。
卡他分枝杆菌OMV含有酶活性β-内酰胺酶。（A） 四种不同来源的全细胞裂解物和OMV的β-内酰胺酶含量卡他分枝杆菌对菌株进行了分析。OMV的β-内酰胺酶含量与全细胞裂解物大致相同。（B） 在OMV内部发现了β-内酰胺酶。β-内酰胺酶的活性通过酶水解β-内氨基硝基头孢的能力进行量化，从而导致OD吸光度的变化380至外径485，通过分光光度法测定。用蛋白酶K（100μg/ml）和/或皂苷（0.2%）处理β-内酰胺酶或OMV，然后测定酶含量。作为阴性对照，OMV首先用皂苷处理，然后用蛋白酶K处理。在面板a中，β-内酰胺酶含量表示为每mg OMV每分钟水解的硝基头孢摩尔数。在B组中，β-内酰胺酶活性被定义为OMV在不含阿莫西林的情况下的酶活性百分比，设定为100%。所示数据是至少三个独立实验的平均值和SEM。
图3。
图3。
β-内酰胺酶携带卡他分枝杆菌OMV水解阿莫西林。（A） 阿莫西林（AMX）在1.25-10μg/ml浓度下诱导的杀伤作用随着含β-内酰胺酶OMV浓度的增加（0-50μg/ml）而逐渐降低。通过测量β-内酰胺敏感细菌的抑制生长区来测定阿莫西林浓度黄体八叠球菌（B）β-内酰胺酶阳性和阴性卡他分枝杆菌25μg/ml的OMV与增加的阿莫西林浓度一起培养。数据显示为至少三个独立实验的平均值和SEM。β-lac+和β-lac−，β-内酰胺酶分别为阳性和阴性，P（P）≤ 0.001.
图4。
图4。
β-内酰胺酶阳性卡他分枝杆菌OMV保护阿莫西林敏感卡他分枝杆菌被阿莫西林杀死的菌株。β-内酰胺酶敏感卡他分枝杆菌KR935（107CFU/ml）与阿莫西林（1μg/ml）一起培养，阿莫西兰在25μg/mlβ-内酰胺酶阳性OMV（A和B）或β-内酰酶阴性OMV（B和C）存在下预先培养。β-内酰胺酶阳性和阴性OMV从卡他分枝杆菌KR526（β-lac+)和Bc5（β-lac−)分别是。生长量表示为相对于初始浓度的相对生长量，初始浓度测量为吸光度（OD600)（A和C）或CFU数量（B）。显示了至少三个独立实验的平均值和SEM。*，P（P）≤ 0.05.
图5。
图5。
β-内酰胺酶阳性的水泡卡他分枝杆菌保护NTHi免受阿莫西林的侵害。阿莫西林敏感NTHi 772（A至C）或Hib KR124（D）（107CFU/ml）与阿莫西林（2μg/ml）一起培养，阿莫西兰与25μg/mlβ-内酰胺酶阳性OMV（A和B）或β-内酰酶阴性OMV（B和C）预先孵育。OMV从卡他性支原体KR526和Bc5分别为β-内酰胺酶阳性和阴性。生长量表示为相对于OD时吸光度测量的起始浓度的相对生长量600（A和C）或CFU数量（B和D）。结果显示为至少三个独立实验的平均值和SEM。*，P（P）≤ 0.05; ***,P（P）≤ 0.001.
图6。
图6。
卡他分枝杆菌含β-内酰胺酶的OMV保护肺炎链球菌（肺炎球菌[Pnc]）被阿莫西林杀死。阿莫西林敏感肺炎链球菌ATCC 6303（106CFU/ml）与阿莫西林（1μg/ml）一起培养，预先与25μg/mlβ-内酰胺酶阳性OMV（A和B）或β-内酰酶阴性OMV（B和C）孵育。OMV从卡他分枝杆菌KR526（β-lac+)和Bc5（β-lac−). 生长量表示为相对于初始浓度的相对生长量，初始浓度测量为吸光度（OD600)（A和C）或CFU数量（B）。数据表示为至少三个独立实验的平均值和标准误差。*，P（P）≤ 0.05; **,P（P）≤0.01；***，P（P）≤ 0.001.
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