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.2016年11月；71(11):1020-1029.
doi:10.1136/thoraxjnl-2015-208032。 Epub 2016年6月10日。

肺泡巨噬细胞衍生的微泡介导急性肺损伤

萨努伊·索尼 1, 迈克尔·威尔逊 1, 基兰·P·奥迪 1, 马里科·吉田洋子 1, 奥马尔·卡特贝 1, 萨曼莎·伍兹 1, 高田正雄 1
附属公司

肺泡巨噬细胞衍生的微泡介导急性肺损伤

萨努伊·索尼等。 胸部. 2016年11月.

摘要

背景：微泡（MV）是细胞间通讯的重要介质，包装着各种分子物质。它们与各种炎症疾病的病理生理学有关；然而，它们在急性肺损伤（ALI）中的作用尚不清楚。

目标：我们旨在确定肺泡内MV在ALI中的生物活性和功能作用。

方法：将脂多糖（LPS）气管内注入C57BL/6小鼠，并评估支气管肺泡灌洗液（BALF）中的MV群。LPS后1小时分离BALF MVs，评估细胞因子含量，并与小鼠肺上皮（MLE-12）细胞孵育。在单独的实验中，初级肺泡巨噬细胞衍生的MV与MLE-12细胞孵育或气管内滴注到小鼠体内。

结果：肺泡巨噬细胞和上皮细胞在LPS后迅速向肺泡释放MV。1小时时，主要人群为肺泡巨噬细胞衍生，这些MV携带大量肿瘤坏死因子（TNF），但携带少量IL-1β/IL-6。与未经处理的小鼠MV相比，将这些混合MV与MLE-12细胞孵育，可诱导上皮细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达和角朊细胞衍生细胞因子释放（p<0.001）。LPS激发的肺泡巨噬细胞在体外释放的MVs导致MLE-12 ICAM-1表达的类似增加，这是由TNF介导的。当向小鼠气管内注入这些MV时，这些MV诱导BALF中性粒细胞、蛋白和上皮细胞ICAM-1表达增加（p<0.05）。

结论：我们首次证明了急性肺损伤早期不同肺泡内前体细胞产生MV的顺序。我们的研究结果表明，肺泡巨噬细胞衍生的MV携带生物活性TNF，可能在启动ALI中发挥重要作用。

关键词：ARDS；细胞因子生物学；巨噬细胞生物学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：未声明。

数字

图1
图1
采集和评估体内产生的微泡（MV）生物活性的协议。20 将µg脂多糖（LPS）静脉滴入小鼠体内。采集支气管肺泡灌洗液（BALF）1 LPS激发后1小时（或未经处理的小鼠）使用700 µL生理盐水，然后离心以去除细胞和较大颗粒（200 g、 5个 4°C时最小值）。丢弃细胞/大颗粒颗粒，高速离心上清液（20 000 g、 30个 将MV颗粒与小鼠肺上皮细胞（MLE-12）孵育4小时 24孔板中放置小时。遵循4 培养小时后，用ELISA试剂盒测定细胞上清液中的角质细胞衍生细胞因子（KC），并用流式细胞术检测MLE-12细胞表面ICAM-1的表达。最后清洗和离心步骤后从MV颗粒中分离出来的洗净后上清液也与MLE-12细胞一起培养，以区分MV相关效应与可溶性因子（例如LPS或可溶性BALF炎症介质）诱导的效应。细胞间粘附分子-1；PBS，磷酸盐缓冲盐水。
图2
图2
体外产生的初级肺泡巨噬细胞衍生微泡（MV）的I.t.滴注。收集的初级肺泡巨噬细胞被放置在24孔板中，准备1个 1小时 µg/mL脂多糖（LPS）达到促炎表型，然后用6 mM ATP，40 µM钙离子载体（A23187）和1 mM外ATP酶抑制剂（ARL67156）2 生成MV的小时数。随后收集上清液并离心，以清除细胞/细胞碎片（200 5克 4°C时最小值）。以高速离心（20 000 30克 在4°C下，隔离MV，MV清洗两次。然后将这些初级肺泡巨噬细胞衍生的MV静脉滴注到未经治疗的幼稚小鼠体内。在最后清洗步骤后分离出的洗涤后上清液也被收集用于静脉滴注，作为对照，以说明尽管清洗步骤仍存在的MV产生的任何可溶性因素。在4之后 小时激发，检测急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的四个参数：支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白、BALF角质细胞衍生细胞因子（KC）、BALF-中性粒细胞计数和上皮细胞表面ICAM-1表达。细胞间粘附分子-1。
图3
图3
用i.t.脂多糖（LPS）刺激小鼠1或4次，显示支气管肺泡灌洗液（BALF）中微泡（MV）特征的代表性曲线 小时。（A） 流式细胞仪图显示了门控策略，以识别1以下事件 微米，使用0.88 µm胶珠。请注意，图中所示的计数珠的尺寸为6 微米。（B） 选通策略1 LPS后1小时显示CD11c种群+低于1的事件 μm大小，因此被认为是肺泡巨噬细胞衍生的MV。CD11c有明显区别+CD11c事件−材料和流式细胞仪产生的背景噪声（光学和电噪声）。（C） 添加0.1%的triton洗涤剂会导致CD11c分解+随着囊泡膜被triton溶解，进一步证实了其MV的性质。CD11c公司+从最终的MV计数中减去对洗涤剂（可能是抗体复合物）有抗性的事件。（D） CD11c公司+这些事件也被发现为F4/80阳性，证实了它们被解释为肺泡巨噬细胞衍生的MV。（E） 确定上皮细胞MV数量的门控策略（EpCAM+1岁以下 微米大小）1 LPS后小时。（F） CD11b+事件在4 小时。（G） 这些CD11b+细胞对Ly6G也呈阳性，因此被归类为中性粒细胞衍生MV。
图4
图4
不同肺泡内前体细胞的微泡（MV）的顺序释放。MV计数表示为对洗涤剂敏感的事件数（即总数减去耐洗涤剂的事件数）<1 每µL支气管肺泡灌洗液（BALF）中表达母细胞抗原的μm大小。（A） 显示未经治疗的对照小鼠BALF中肺泡巨噬细胞衍生MV数量的直方图，以及1 小时和4 静脉注射脂多糖（LPS）后小时。数字峰值为1 小时，然后又落下。（B） 上皮细胞MV随着损伤时间的延长而持续增加，4天后达到显著水平 小时。（C） 中性粒细胞衍生的MV直到4时才被检测到 LPS滴注后小时。N=5-8***p<0.001。数据采用方差分析和Tukey's HSD进行分析，显示为平均值+标准差。方差分析。
图5
图5
体内衍生微泡（MV）的TNF、IL-1β和IL-6含量。（A） 从未经治疗的对照小鼠或1只 内毒素（LPS）后1小时。然后用1%吐温洗涤剂处理MVs，通过ELISA试剂盒测量表面和膀胱内细胞因子。在取自对照小鼠的MV粒剂中未检测到可识别的细胞因子。从接受LPS治疗的小鼠获得的MV中含有大量TNF，但IL-1β和IL-6的含量最低。数据显示为平均值+SD，N=5。（B） 从BALF提取的MV 1 i.t.LPS后小时。如图所示，肺泡巨噬细胞衍生的MV中有一定比例的TNF染色呈阳性，突出了其促炎表型。
图6
图6
体内衍生微泡（MV）的促炎活性。（A） 不同处理对MLE-12细胞ICAM-1表达的影响（以平均荧光强度（MFI）表示）。从脂多糖（LPS）处理的小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）中获得的MVs在与MLE-12细胞孵育4小时时引起最大的增加 小时。这种效应明显大于对照MVs（从未经治疗的小鼠BALF中获得）、MV-depleted上清液或PBS引起的效应。在高剂量和低剂量LPS后，MLE-12 ICAM-1的表达略有增加，但这些与PBS没有显著差异，与MVs的效应相比明显减少。（B） 不同处理对MLE-12细胞产生角质细胞衍生细胞因子（KC）的影响。同样，从LPS处理小鼠的BALF中获得的MV产生了最大的KC，显著大于对照MV和PBS，并且显著大于MV缺失上清液和LPS。N=5-6**p<0.01，***p<0.001。使用Kruskal-Wallis和Dunn’s对数据进行分析，并通过盒子须图显示中值、IQR和最小/最大值。细胞间粘附分子-1；PBS，磷酸盐缓冲盐水。
图7
图7
体外生成的初级肺泡巨噬细胞衍生微泡（MV）的促炎活性。（A） 流式细胞仪图显示肺泡巨噬细胞（CD11c+和F4/80+)从支气管肺泡灌洗液（BALF）中提取。正如所料，从BALF中回收的细胞几乎全部是肺泡巨噬细胞。因此，该体外系统产生的MV实际上完全来自肺泡巨噬细胞。（B） 这些巨噬细胞要么用脂多糖（LPS）激发，要么在PBS中孵育1小时 然后在体外用ATP、A23187和ARL67156刺激产生“炎症”或“非炎症”MV。这些被鉴定为CD11c+低于1的事件 μm大小，与体内LPS模型中确定的肺泡巨噬细胞产生的MV一致。（C） 肺泡巨噬细胞衍生的“炎症”MV与MLE-12细胞孵育4 小时，与非炎症MV、相关上清液部分（从相同的MV生成制剂中获得）和PBS相比，ICAM-1表达显著增加。MV治疗前向MLE-12细胞应用抗-TNF抗体可消除ICAM-1的增加，证实MVs具有TNF介导的明确生物活性。N=3-5，***p<0.001。使用Tukey的HSD通过方差分析对数据进行分析，并将数据显示为反向变换平均值，变换数据的置信区间为95%（下限、上限）。方差分析；细胞间粘附分子-1；PBS，磷酸盐缓冲盐水。
图8
图8
进行原发性肺泡巨噬细胞源性炎性微泡（MVs）或相关上清液的盲静脉滴注，并检查急性肺损伤（ALI）的多项参数。（A） 与上清液相比，静脉滴注MVs后支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白水平显著升高。（B） BALF中性粒细胞显著增加4 肺泡巨噬细胞衍生MV滴注后小时。（C） 接受肺泡巨噬细胞衍生的MVs的小鼠在1型上皮细胞和（D）2型上皮细胞上的ICAM-1表面表达也显著增加。（E） 在被MVs攻击4小时的小鼠中，BALF角质细胞衍生细胞因子（KC）水平趋于增加 小时，但未达到统计显著性。N=5，*p<0.05，**p<0.01。参数数据通过配对t检验进行分析，并显示为平均值+SD（D和E），或转换数据（B和C）的95%置信区间（上下限）的后转换平均值。非参数数据（A）通过Wilcoxon秩和检验进行分析，并通过箱须图显示中值、IQR和最小/最大值。细胞间粘附分子-1。
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