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.2013年7月；195（13）：2971-81。
doi:10.1128/JB.02267-12。 Epub 2013年4月26日。

铜绿假单胞菌应激诱导的外膜囊泡生成

伊恩·麦克唐纳 1, Meta J Kuehn公司
附属公司

铜绿假单胞菌应激诱导的外膜囊泡生成

伊恩·麦克唐纳等。 J细菌. 2013年7月.

摘要

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种条件致病菌，在感染过程中必须能够适应环境中的变化和压力并生存下来。为了帮助铜绿假单胞菌在恶劣的宿主环境中生存，铜绿假双胞菌进化出了防御机制，包括产生胞外多糖胶囊和分泌大量降解蛋白酶和脂肪酶。外膜衍生小泡（OMV）的产生是毒力因子的分泌机制，也是细菌对外膜作用应激源的一般反应。本研究探讨亚致死性生理应激源对铜绿假单胞菌产生OMV的影响，以及假单胞杆菌喹诺酮类信号（PQS）和MucD周质蛋白酶是否是该反应的关键机制因素。暴露于一些环境应激源可以增加OMV的产生水平以及AlgU的活性，AlgU是控制MucD表达的西格玛因子。AlgU的过度表达足以诱导OMV的产生；然而，胁迫诱导的OMV产生并不依赖于AlgU的激活，因为胁迫导致缺乏AlgU的菌株的囊泡形成增加。我们进一步确定MucD水平不是急性应激下OMV产生的指标，并且在应激或非应激条件下OMV的产生不需要PQS。最后，对铜绿假单胞菌对氧化应激反应的研究表明，过氧化物诱导的OMV生成需要B带而不是A带脂多糖的存在。总之，这些结果表明，铜绿假单胞菌中存在不同的应激诱导OMV生成机制。

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图1
图1
压力源处理诱导PA14产生OMV，与AlgU和MucD水平无关。从经250μg/ml处理的PA14/pLW127培养物中收集OMV并对其进行定量d日-环丝氨酸（A）、4μg/ml多粘菌素B（B）或250μM过氧化氢（H2O（运行）2)（C）。将OMV产量平均并归一化为未处理对照（未处理），以计算折叠变化。（D） 从25°C下生长并转移至37°C或39°C的PA14 pLW127培养物中收集OMV并对其进行定量。OMV产量平均并归一化为25°C（25°C）的培养物。在培养物（37°C；OD）中测量AlgU启动子活性600，0.9至1.1）用250μg/ml处理的PA14/pLW127d日-环丝氨酸（E）、4μg/ml多粘菌素B（F）或250μM过氧化氢（H2O（运行）2)（G）使用β-半乳糖苷酶分析。将数值平均并归一化为未经处理的对照组（未经处理），以计算折叠变化。（H） 在培养物（OD）中测量AlgU启动子活性600，0.9至1.1）的PA14/pLW127在25°C下生长，并转移至37°C或39°C。将数值平均并归一化为25°C的培养物，以计算折叠变化。使用或不使用250μg/ml治疗15至30分钟后，PA14/pLW127中的周质MucD表达d日-环丝氨酸（I）、4μg/ml多粘菌素B（J）或250μM过氧化氢（H2O（运行）2)（K）通过密度计测定。将数值平均并归一化为未处理样品，以计算折叠变化。*，P（P）≤ 0.05; **,P（P）≤ 0.01 (n个≥ 3).
图2
图2
PA14中的AlgU表达对于OMV的生产是足够的，但不是必需的。（A） 从PA14Δ培养物中收集OMV并进行定量algU公司/pMF54（ΔalgU公司+向量）和PA14ΔalgU公司/pIM001（Δ代数单位+AlgU），在中对数阶段均补充了1 mM IPTG。差异不显著(P（P）= 0.068). （B） 从PA14Δ培养物中收集OMV并进行定量algD公司/pMF54（ΔalgD公司+向量）和PA14ΔalgD公司/pIM001（ΔalgD公司+AlgU），在中对数阶段均补充了200μM IPTG。（C） 从PA14Δ培养物中收集OMV并进行定量algU公司(Δ代数单位)用250μM过氧化氢（ΔalgU公司+H（H）2O（运行）2). OMV产量归一化为含载体（A和B）或未经处理的培养物（C）的产量，以计算折叠变化。*，P（P）< 0.05; **,P（P）≤ 0.01 (n个= 3).
图3
图3
MucD的过度表达增加了PAO1产生的OMV，但不增加PA14的OMV。（A） 用1 mM IPTG诱导PA14/pMF54（Vector+in）或PA14/pLW112（MucD+in。（B） 从IPTG诱导的PA14/pMF54（Vector+In）和PA14/pLW112（MucD+In。（C） 从PAO1/pMF54（PAO1+In）和PAO1/pLW112（PAO1/MucD+In，P（P）≤ 0.05; **,P（P）≤ 0.01 (n个= 3).
图4
图4
MucD过度表达不会降低PA14中OMV的氧化应激诱导。从PA14/pMF54（载体+H2O2）和PA14/pLW112（MucD+H2O2）培养物中收集OMV并进行定量，这两种培养物均由IPTG诱导，并在中对数期用250μM过氧化氢处理。OMV产量归一化为诱导矢量控制（矢量+H2O2），以计算折叠变化。**，P（P）≤ 0.01 (n个= 3).
图5
图5
PA14中的本构或应力诱导OMV生产不需要PQS。（A） PA14和PA14ΔpqsA基因在LB肉汤中生长到晚期对数相，用硫酸铵沉淀无细胞上清液。通过密度梯度分馏从浓缩上清液中纯化OMV。通过FM4-64对OMV组分（FM4-64/CFU）中脂质的定量来测定OMV的产生。（B） PA14和PA14ΔpqsA公司在BHI肉汤中培养过夜，将无细胞上清液超速离心以分离OMV。通过FM4-64对OMV组分（FM4-64/CFU）中脂质的定量来测定OMV的产生。从PA14Δ培养物中收集并定量（C到E）OMVpqsA基因用250μg/ml处理d日-环丝氨酸（C）、4μg/ml多粘菌素B（D）或1 mM过氧化氢（H2O（运行）2)（E）。OMV产量归一化为未处理对照组（ΔpqsA公司)计算折叠变化。**，P（P）≤ 0.01 (n个≥ 3).
图6
图6
H需要B波段LPS2O（运行）2-诱导PA14中OMV的形成。从PA14、PA14Δ的未经处理的培养物中收集OMV并进行定量白细胞压积（B带突变），PA14Δ人民币元（A带突变）和PA14ΔwapR软件（A-和B-带突变体）和250μM过氧化氢处理的培养物（ΔwbpM+H2O2，Δrmd+H2O2和ΔwapR+H2O2）。OMV产量标准化为未经处理的PA14培养物（PA14）。*，P（P）≤ 0.05; **,P（P）≤ 0.01 (n个≥ 3).
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