介绍
组蛋白是染色质的主要组成部分，对染色体行为的大多数（如果不是所有的话）方面都有深远的影响。染色质的功能状态部分由组蛋白修饰酶和依赖ATP的染色质重塑酶调节。后一类酶的成员在体外改变核小体的结构或沿DNA滑动核小体贝克尔和霍兹2002;彼得森2002). 这些酶具有催化的DNA-依赖型ATP酶亚单位，其序列与RNA-依赖性ATP酶的DEAD/DEAH-box类相似。这个家族的原型是酿酒酵母Swi2/Snf2蛋白，最初因其在促进转录中的作用而鉴定。
除了组蛋白修饰和核小体重塑/滑动外，还有第三种形式的染色质调节，包括用组蛋白变体替换典型组蛋白。例如，组蛋白H3被保守的H3变体（在酿酒酵母，Cid输入果蝇，或人类CENP-A）对动粒的组装至关重要（参见Smith 2002年). 另一种在酵母和人类之间保守的组蛋白变体是H2A。Z、 在大约十分之一的核小体中取代H2A。按照惯例，编码H2A的基因。Z英寸酵母菌属被称为HTZ1型基因的突变形式被称为htz1。我们之前已经证明了H2A的一个重要功能。Z英寸酿酒酵母是为了防止沉默染色质（也称为异染色质）扩散到相邻的常染色区(Meneghini等人，2003年). 沉默中酿酒酵母发生在HMR公司和HML公司沉默的交配型暗盒，靠近端粒和rDNA（综述于Rusche等人，2003年). 所有三种类型的沉默都需要NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶Sir2p。端粒和HM公司沉默还需要组蛋白H3/H4尾部结合蛋白Sir3p和Sir4p。在缺乏H2A的酵母细胞中。Z、 爵士建筑群超出其正常边界HMR公司并进入邻近的常染色质，导致基因表达的抑制(Meneghini等人，2003年). 通过删除SIR2型或删除核化位点以沉默HMR公司同样，端粒附近基因的沉默htz1型Δ单元格通过删除SIR2型在酵母中，H2A。Z本身在两侧的常染色区域富集HMR公司并在无声区域耗尽。遗传分析表明H2A。Z的作用独立于出现在染色质右边界的特征染色质边界元素HMR公司无声磁带。因此，H2A。Z是一种常染色质特异性因子，通过独立于至少一个特征边界元素的机制对抗沉默的传播(Meneghini等人，2003年). 然而，沉默染色质扩散边界的建立可能涉及额外的蛋白质因素，如双溴结构域蛋白Bdf1p，其功能与H2A相似。Z，其优选地与在沉默区域外的常染色质中发现的乙酰化组蛋白结合(Ladurner等人，2003年;Matangkasombut和Buratowski，2003年).
尽管它在防止异染色质扩散方面起着关键作用，但H2A的作用机制。Z沉积在常染色质中尚不清楚。典型组蛋白可以通过复制耦合和复制无关的沉积机制沉积（参见豪沙尔特和卡多纳加2003). 在人类细胞中，复制耦合沉积途径对于S期进展和细胞存活至关重要(霍克和斯蒂尔曼2003;Ye等人，2003年). 相反，在芽殖酵母中，没有单一的沉积途径对其活力至关重要(考夫曼等人，1998年;福尔摩沙等人，2002年). 例如，组蛋白H3/H4伴侣CAF-I和Asf1p在体外复制耦合组蛋白沉积过程中协同发挥作用，并在体内协同形成异染色质。然而，CAF-I和Asf1p对酿酒酵母，缺少这两种蛋白质的突变体也是可行的(Tyler等人，1999年). Nap1p是一种哺乳动物组蛋白伴侣的酵母同源物，是在复制独立组装分析的基础上提纯的，对于细胞的存活也是必不可少的酿酒酵母(Ishimi和Kikuchi 1991年;Kellogg and Murray 1995年). 因此，必须通过其他机制在活细胞中沉积染色质。一个候选人是果蝇属因子ACF和同源人类复合物RSF，它们各自包含一个ISWI型Swi2/Snf2 ATP酶亚基（在豪沙尔特和卡多纳加2003). 这些因素在体外促进ATP依赖的有序核小体阵列组装，但其在体内的确切作用尚未确定。
对变异组蛋白沉积的机制知之甚少。了解含有H2A的常染色质的机制。Z的形成需要识别催化其沉积的机器。本研究的结果确定了一种多亚单位蛋白质复合物，即SWR1-Com（SWR1-Com），它包含一个Swi2/Snf2 paralog，是H2A所必需的。Z沉积和功能酿酒酵母我们将这种复合物在结构和遗传学上与NuA4组蛋白乙酰转移酶（HAT）和Ino80-C染色质重塑复合物联系起来。
结果
与组蛋白变体H2A相关的蛋白质复合物（SWR1-Com）。Z轴
H2A。Z对于确定基因组中的常染色区域很重要酿酒酵母(Meneghini等人，2003年). 确定哪些其他蛋白质有助于引导H2A。Z到其染色体位置，我们纯化了与H2A可溶性库相关的蛋白质。Z来自含等位基因的酵母菌株的全细胞提取物HTZ1型将羧基末端融合编码到串联亲和纯化（TAP）标签（参见材料和方法)(Rigaut等人，1999年). 这些初始纯化是在低盐条件下进行的，洗涤步骤有限，以最大限度地提高蛋白质复合物的回收率，随后使用更严格的条件来区分强相互作用和弱相互作用以及潜在的人为相互作用（见下文）。使用大蛋白复合物直接分析法测定样品的蛋白质组成，该方法包括混合物的胰蛋白酶消化、多维微毛细管色谱、串联质谱和获得的光谱数据的基因组辅助分析(Link等人，1999年;Sanders等人，2002年). 一种蛋白质被判定与H2A相关。Z表示H2A中相应肽的数量。Z-TAP纯化材料高于从缺乏标记H2A的菌株纯化的材料。Z蛋白，如果该蛋白通过了下面描述的附加标准。分析中排除了用TAP标记的蛋白质进行非特异性铜纯化的蛋白质(舍甫琴科等人，2002年). 使用这些标准和额外的纯化（如下所述），我们鉴定了15种与H2A相关的蛋白质。Z轴()其中13个组成一个综合体，命名为SWR1-Com(和见下文）。最大的亚基对应于Swr1p（Swi2/Snf2相关），这是ATP依赖性染色质重塑酶Swi2/Snf2家族中的一个未鉴定的成员(波拉德和彼得森1998).
SWR1-Com的亚单位结构及其与NuA4和Ino80-C复合物的重叠文氏图显示了SWR1、NuA4、Ino80p-C和Nap1p/Kap114p复合物的拟议亚基组成。分配基于中显示的数据和和TAP纯化中使用的蛋白质用“*”表示，由基本基因编码的蛋白质用下划线表示。
SWR1-Com与必需HAT-NuA4和Ino80-C染色质重塑复合物共享的亚单位
在Ino80-C染色质重塑复合物中还发现了四个SWR1-Com亚单位，分别是Rvb1p、Rvb2p、Arp4和actin(Shen等人，2000). 类似地，Yaf9p，如下所示和其他(Le Masson等人，2003年)以及Arp4p和actin也是NuA4 HAT的组成部分(Galarneau等人，2000年). 确定是否与H2A相关的蛋白质。Z形成了一个离散的复合物、多个复合物或铜净化污染物，其中三个蛋白质本身被标记为TAP结构域。全细胞提取物可溶部分的络合物在与H2A类似的条件下进行纯化。Z-TAP纯化，纯化材料的成分通过与H2A相同的程序进行评估。Z-TAP（总结于和). 除组蛋白伴侣Nap1p和导入蛋白Kap114p外，用TAP标记的Swr1p铜纯化的蛋白质与用H2A发现的蛋白质组相似。Z、 除了两个额外的蛋白质，这里指定为Swc3p和Swc7p，被鉴定出来。类似地，从带有TAP标记的Swc4p和Yaf9p的菌株中纯化，几乎产生了与Swr1p和H2A相关的所有蛋白质。Z，缺少Nap1p和Kap114p。与Swr1-TAP材料一样，Swc4-TAP相关材料包含Swc3p和Swc7p，支持这两种蛋白质分配给Swr1-Com。TAP标记的Swc4p和Yaf9p也与NuA4复合物的大多数亚单位（包括Tra1p、Epl1p、Eaf3p、Yng2p和催化亚单位Esa1p）相关。这些数据表明，SWR1-Com和NuA4共享Yaf9p、Swc4p、Arp4和肌动蛋白亚基。
高严格条件下的代表性复杂净化（参见材料和方法)带有Swr1-TAP、Yaf9-TAP或未标记控制菌株的菌株如所示A.与Swr1-TAP和Yaf9-TAP共纯化的蛋白质代表Swr1-Com的亚单位(A、 箭头），而仅与Yaf9-TAP共纯化的蛋白质代表特定的NuA4亚单位(A、 星星）。SWR1-Com亚基的结构域示意图如所示B.复合物中的一些蛋白质含有与染色质相关的蛋白质中发现的基序（SANT、Bromo、YEATS和HIT），表明SWR1-Com直接作用于染色质。
SWR1-Com与NuA4共享亚单位以及包含染色质生物学相关基序的蛋白质（A） 蛋白质复合物重叠。净化是在高严格条件下进行的（参见材料和方法)来自Swr1 TAP、Yaf9 TAP和未标记的对照菌株，通过SDS-PAGE解析并用银染色。由于Swr1-TAP纯化效率相对较低，因此与Yaf9-TAP相比，使用两倍于起始材料量的原料进行wt和Swr1-TA纯化。并非所有通过质谱鉴定的蛋白质都能在凝胶上清晰可见。箭头指向Swr1-TAP和Yaf9-TAP纯化过程中常见的蛋白质，而星号则指向通过目视检查和蛋白质大小与质谱数据的比较判断出的仅在Yaf9-TA纯化过程中发现的蛋白质。垂直条表明凝胶中该区域的蛋白质无法被清楚地分解。
（B） SWR1-Com的结构域。所示为从SMART数据库中获得的分配给SWR1-Ccom的单个蛋白质的SMART结构域表示(网址：http://smart.embl-heidelberg.de/). 包括域名，绿色条表示卷曲区域，洋红色条表示低复杂性区域。Swr1p的氨基末端部分没有缩放。
由于组蛋白伴侣Nap1p和导入因子Kap114p与H2A共纯化。Z，但不是复合物的其他成员，它们可能是H2A的一部分。与SWR1-Com不同的含Z的蛋白质复合物。对TAP标记的Rvb2p（Ino80-C染色质重塑复合物的一种已确定成分）进行亲和纯化，得到与Ino80.C复合物的其他已知亚单位以及SWR1-Com的六个成员相对应的肽，其中三个成员（Swc4p、Arp4p和actin）也是NuA4的亚单位(表S1). 与SWR1-Com亚单位的分配一致，在对整个细胞提取物进行甘油梯度离心后，这些蛋白质的细胞池中的百分比相互共沉积(图S1).
最初的纯化表明，Swc4p和Bdf1p都具有与组蛋白尾部识别有关的结构域，它们与H2A共纯化。Z-TAP，可能是SWR1-Com的一部分。通过分析规模亲和纯化Yaf9-TAP、Esa1-TAP、Rvb2-TAP、SWR1-TAP和Ino80-TAP，从含有在其羧基末端融合为三重血凝素（HA）的Swc4p的细胞中获得对质谱推断的络合物组成的独立评估标签。这些分析级亲和纯化比最初的TAP纯化更严格，因此有助于消除假阳性结果，并提供相互作用的独立测试。使用抗-HA表位抗体和抗NuA4最大亚单位Tra1p的抗体分析铜提纯材料。Yaf9-TAP和Esa1-TAP均与可比较数量的Tra1p和Swc4p相关，支持Yaf9p和Swc 4p作为NuA4的新亚单位的分配。同样，Rvb2-TAP和Swr1-TAP也与大量Swc4-HA共提纯，但Ino80-TAP没有。Rvb2-TAP、Swr1-TAP和Ino80-TAP与Tra1p无关(A） ●●●●。这些数据与Swr1p和Rvb2p是SWR1-Com的组成部分而不是NuA4的组成部分相一致。进一步支持将Swc4p指定为NuA4的一个亚单位，Swc4-TAP分析标度纯化的材料中存在大量的NuA4亚单位Tra1p和Esa1p(B） ●●●●。
Swc4p和Bdf1p是SWR1-Com的组件该图显示了分析级TAP纯化的免疫印迹。捕获的TAP标记蛋白质显示在凝胶上方，测试关联的蛋白质显示在右侧。
（A） Swc4p和Tra1p协会。Swc4-HA存在于Yaf9-TAP、Esa1-TAP、Rvb2-TAP和Swr1-TAP的纯化物中，但不存在于Ino80-TAP中。NuA4仅存在于Yaf9-TAP和Esa1-TAP材料中。
（B） 相互确认Swc4p为NuA4的一部分。Swc4-TAP和Yaf9-TAP纯化材料含有NuA4成分Esa1p和Tra1p。
（C） Bdf1p协会。Bdf1p存在于Swr1-TAP、Yaf9-TAP和Swc4-TAP的纯化中，但不存在于Esa1-TAP中。
在TAP纯化过程中，对应于Bdf1p的肽的数量很低，而Bdf1p仅在H2A中发现。Z-TAP和Yaf9-TAP(). 通过从携带Yaf9-TAP、Swr1-TAP、Swc4-TAP和Esa1-TAP的菌株中进行额外的分析级亲和纯化，并用Bdf1p抗体进行免疫印迹，进一步测试了Bdf1p的潜在存在。Bdf1p与Swr1 TAP、Yaf9 TAP和Swc4 TAP相关，但不与Esa1 TAP或未标记的控制材料相关，支持将Bdf1p分配为Swr1 Com的子单元(C） ●●●●。
SWR1-Com与组蛋白H2A选择性相关。Z与H2A
确定SWR1-com的亚单位是否与H2A特异相关。Z或两个H2A。Z和H2A，H2A的TAP标记版本。Z和H2A从含有HA标记版本的五种不同SWR1-Com组分Swr1p、Swc2p、Swc3p、Swc4p和Swc7p以及核导入因子Kap114p的细胞中纯化。然后用HA标签、Bdf1p和Tra1p抗体的免疫印迹法评估铜提纯材料的组成。Yaf9-TAP作为SWR1-Com和NuA4恢复的阳性对照。
H2A。Z与SWR1-Com的很大一部分相关，这是根据与H2A共提纯的材料中SWR1-Com亚基的可比信号强度判断的。Z-TAP和Yaf9-TAP，而没有NuA4与H2A铜化。Z-TAP基于H2A中缺少Tra1p。Z-TAP样品(A） ●●●●。相反，组蛋白H2A仅用微量Swc2-HA、Swc3-HA、Swc-4-HA、Swc7-HA和Bdf1p进行铜纯化，几乎没有Swr1-HA（参见). Kap114-HA与两种H2A相关。Z-TAP和H2A-TAP，而不是Yaf9-TAP，这表明它没有区分典型和变体H2A。因此，根据相互作用的表观相对强度，SWR1-Com（与Kap114-HA相反）主要与H2A相关。Z、 尽管SWR1-Com对H2A的弱亲和力是可能的。此外，这些实验还支持将Swc3p和Swc7p分配给SWR1-Com，尽管这两种蛋白质的肽仅存在于最初的SWR1-TAP和Swc4-TAP纯化中。
SWR1-Com选择性地与H2A关联。Z和含H2B（A） H2A的分析规模TAP纯化。通过免疫印迹法分析右侧所示成分的Z-TAP、Yaf9-TAP和H2A-TAP。SWR1-Com优先与H2A关联。Z-TAP，而Kap114-HA与H2A同等相关。Z-TAP和H2A-TAP，但不是Yaf9-TAP。
（B） SWR1-Com是从带有HA标记的H2A版本的菌株中纯化的。Z或H2B，并通过免疫印迹分析这些组蛋白以及SWR1-Com亚单位Act1p的存在。
不与染色质结合的典型H2A通常存在于H2A/H2B二聚体中(杰克逊1987). 通过从含有H2A的菌株中纯化SWR1-Com，研究了SWR1-Ccom中是否存在H2B。Z-HA和H2B-HA。SWR1-Com含有H2A。Z-HA和H2B-HA(B） 。这些数据增加了这种复合物使用H2A的可能性。Z/H2B二聚体作为底物。
相似的基因表达谱htz1型Δ和开关量1Δ电池
确定H2A的作用程度。Z依赖于SWR1-Com功能开关1Δ细胞与htz1型Δ电池(Meneghini等人，2003年). 为了进行最佳比较，在之前用于分析的条件下进行了实验htz1型Δ电池（参见材料和方法). 由于H2A的作用。Z表示防静电，H2A。依赖Z的基因往往位于诸如端粒等沉默区域附近。这一主题在开关量1Δ突变。具体来说，94个（45%）依赖Swr1p的基因中有42个位于染色体末端的20kb内，不到基因组的3%(A） ●●●●。根据以下判断，这种富集非常显著第页-超几何分布估计值(B） 。端粒中40kb以上区域的Swr1p-依赖基因表达不足，这表明，正如之前对H2A的研究一样。Z、 端粒近端基因对Swr1p功能丧失最敏感。
Swr1p激活基因的染色体分布（A） 显示Swr1p激活基因数量的直方图，作为它们到最近染色体末端距离的函数。
（B） 使用超几何函数测定了Swr1p激活基因的富集程度与最近端粒距离的关系，以及端粒大于40kb区域Swr1p-激活基因的缺失程度(Tavazoie等人，1999年).
基因组转录谱的比较swr1Δ单元格设置为htz1型Δ细胞也显示出明显的重叠(A） ●●●●。94个基因在开关量1Δ突变型与野生型相比。在这94个Swr1p依赖基因中，64个在htz1型Δ(A） ●●●●。这种巨大的重叠是非常重要的(第页= 2.9 × 10−80（使用超几何分布计算），对端粒近端基因来说更令人印象深刻。这些数据表明Swr1p和H2A。Z在调节基因表达方面具有共同的功能。
Swr1p或H2A激活的基因之间的关系。Z轴（A） 表达显著减少的基因数量的维恩图开关量1Δ单元（本工程）或htz1型Δ电池(Meneghini等人，2003年)，显示出很大的重叠。顶部显示的是基因组整体的关系，底部显示的是端粒20 kB内基因的关系。H2A。Z依赖基因，其表达无法在开关量1删除Δ细胞。
（B） 表达显著减少的所有基因的颜色表示开关量1仅Δ电池，htz1型仅Δ单元或两者，根据（A）分组。每列代表一个独立的微阵列实验的数据，该实验比较了所示基因型突变细胞和wt细胞的全基因组表达。每一行代表八个实验中单个基因表达的变化。以对数表示的表达式变化2根据所示的色标指示突变体/wt表达比率。红细胞是指在两种细胞中都有表达增加的基因开关量1Δ电池或htz1型Δ细胞在另一个突变体中的表达减少。不包括在两个突变体中增加表达的基因。
大量H2A。Z依赖基因（116）似乎不需要Swr1p来表达。的颜色表示开关1Δ和htz1型Δ数据集对中描述的基因进行分组A类(B） 发现其中一个子集在开关量1Δ细胞，但没有减少到足以满足严格的显著性截止值。然而，也有明确的例子表明需要H2A的基因。Z表示表达式，但不表示Swr1p。同样，在94个需要Swr1p表达但不需要H2A的基因中也有明确的例子。Z轴().
H2A需要Swr1p。体内Z沉积
与H2A相关的证据。Z和Swr1p函数以及H2A的关联。带有SWR1-Com的Z和H2B表明，SWR1-Com负责沉积H2A。体内染色质上的Z，可能以H2A的形式存在。Z/H2B二聚体。（ACF和RSF复合体中的Swr1p亲属在体外组装染色质中发挥相关作用（在豪沙尔特和卡多纳加2003). 如果是这样，那么缺乏Swr1p的细胞应该会显示H2A水平降低。染色质中的Z。
为了验证这一预测，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验，将野生型与开关量1表达功能性氨基末端三重-HA标记H2A版本的Δ菌株。Z表示为HTZ1型正常染色体位点（HA3-H2A.Z）的启动子。符合H2A。Z与Swr1p处于一个稳定的复合物中，保护其免受蛋白质降解，即HA3-H2A水平。Z英寸开关量1Δ应变减少约2至3倍(图S2). 为了使所测定的每个实验基因座的信号正常化，我们测量了来自表达为H2A的对照基因座的DNA水平。Z独立（位于PRP8项目打开阅读框[ORF]），在从每个完整细胞提取和沉淀得到的样品中（参见材料和方法). 我们首先检查了HA3-H2A。两个染色体区域的Z水平，其中H2A。Z防止Sir依赖性沉默的传播：沉默交配位点的一侧HMR公司另一个位于十四号染色体右臂端粒附近(A） ●●●●。野生型为H2A。Z的水平与前面描述的类似(B） ；HA3-H2A。Z从沉默中耗尽HMR公司在两侧常染色区富集(B） 。此外，HA3-H2A。Z从检测到的最接近端粒的基因座中缺失，AAD3、，可能是因为该基因的端粒沉默。同样，HA3-H2A。Z在YNR074C型该基因是XIV染色体上的一个端粒近端基因，受到H2A的强烈保护，不会沉默。Z.公司。
HA3-H2A的ChIP分析。Z沉积在HMR公司第XIV号染色体右端粒附近的区域（A） PCR引物的位置。
（B） ChIP结果为野生型（条形图表示相对富集于PRP8项目ORF；显示标准错误）。ChIP浓缩信号位于HMR公司相对于PRP8项目小于1.0表示存在H2A。Z沉积发生在PRP8型控制区域。
（C） ChIP结果开关量1Δ单元。
与此形成鲜明对比的是开关1Δ细胞，富集度（相对于PRP8项目位点）。每个被测基因座的Z值接近1(C） ●●●●。这些数据与Swr1p对H2A沉积至关重要一致。Z在HMR公司位于第XIV号染色体右端粒附近。然而，由于ChIP测量值被标准化为PRP8项目基因座，我们考虑了等量HA3-H2A的可能性。例如，如果HA3-H2A的结合有特定的增加，Z仍保留在突变体中检测的所有染色体位点上。Z和PRP8项目而不是所有其他位点的减少。由于从颗粒中获得的DNA与整个细胞组分的比率平均下降了约13倍，这一可能性被打消了开关量1Δ细胞相对于野生型，表明HA3-H2A的绝对染色质结合存在实质性缺陷。缺少Swr1p的细胞中的Z。
H2A。Z也沉积在非沉默区域附近的几个位点上(Meneghini等人，2003年). H2A的功能。这些区域的Z是未知的。确定H2A是否也需要Swr1p。Z沉积在这些位点，我们检测了H2A。染色体III上12个常染色区域的Z水平，每个区域都显示出一定程度的HA3-H2A沉积。Z轴(A） ●●●●。这些位点是在H2A的综合研究中确定的。染色体III上的Z沉积（M.D.M.、M.Bao、H.D.M.，未发表数据）。与上述区域一样，HA3-H2A的相对ChIP富集。在没有Swr1p的情况下，Z在每个位点接近一个(B） ，并且从这些基因座沉淀的DNA的绝对量显示开关量1Δ突变（数据未显示）。因此，HA3-H2A的沉积普遍需要Swr1p。Z、 甚至在远离沉默域的区域。值得注意的是，对于在开关量1Δ突变，ChIP富集度显著小于1，表明可能存在HA3-H2A的残留沉积。Z位于PRP8项目位于这些细胞中。
H2A的ChIP分析。非端粒常染色位点的Z沉积（A） ChIP导致野生型。
（B） ChIP结果开关量1Δ单元。我们检测到H2A浓度降低。当我们估计绝对H2A时，Z位于所有这些位点。Z丰度通过将免疫沉淀DNA的数量除以每个位点的总输入DNA的数量。
SWR1-Com支持细胞生长需要NuA4功能
SWR1-Com和NuA4之间四种蛋白质的共享（参见)提出SWR1-Com在功能上与NuA4相连的可能性，NuA4是组蛋白H4和H2A的主要HAT。Yaf9-TAP和Swc4-TAP菌株的初步纯化表明，由非必需基因编码的蛋白质YDR359C型是NuA4的一个亚单位，与早期高通量研究的一些结果一致(加文等人，2002年). 初步尝试将三重HA-tag融合到YDR359C型虽然没有成功，但我们注意到所有由YDR359C型来自酵母菌属sense strictu菌株的羧基末端延伸约22个氨基酸，这表明可能存在错误酿酒酵母顺序。因此，我们选择在染色体位置整合一个三重HA-tag，该染色体位置对应于狭义感毒株的第二到最后一个密码子，并发现该版本现已成功标记。最近YDR359C型终止密码子在我们选择的位置被存放在GenBank并命名为EAF1型。因此，我们在此处使用此名称，而不是之前为更短版本的YDR359C。Eaf1p包含一个SANT域和一个HSA域，该域与SANT域关联，并存在于解旋酶中(Letunic等人，2002年).
分析规模的亲和纯化表明，与Tra1p类似，Eaf1-HA与Yaf9-TAP、Swc4-TAP和Esa1-TAP共纯化，但与H2A不共纯化。Z-TAP和Swr1-TAP(A） ●●●●。此外，H4乙酰化缺陷在eaf1Δ但不在htz1型Δ，yaf9号机组Δ，或开关量1Δ电池(B） 。这是基于用针对四乙酰化H4的抗体获得的免疫印迹实验中减少的信号。针对单个乙酰化残基的抗体的类似实验表明，缺乏H4乙酰化缺陷的菌株EAF1（EAF1）对H4的K8和K12影响最大，而对H4中的K5和K16影响较小(B） 。同样，H2A的K9在任何突变体中都没有强烈的乙酰化缺陷(B） 。物理关联和H4乙酰化缺陷提供了独立证据，证明Eaf1p是NuA4的一个亚单位。
Eaf1p是NuA4帽子的一个子单元（A） 与NuA4亚单位相关的Eaf1-HA。显示了分析级TAP纯化的免疫印迹。捕获的TAP标记蛋白质显示在凝胶上方，测试关联的蛋白质显示在右侧。
（B） 缺乏应变EAF1（EAF1）组蛋白H4乙酰化有缺陷。如右图所示，使用针对不同形式乙酰化H4和H2A的抗体，对顶部所示突变菌株的全细胞提取物进行全局组蛋白乙酰化测试。
为了探索SWR1-Com和NuA4之间的遗传联系，进行了表型和双突变分析。SWR1-Com突变体和缺失菌株EAF1（EAF1）对基因毒性和应激条件的共同敏感性(A） ●●●●。这个eaf1Δ菌株也生长缓慢，而其他菌株则没有。所有检测到的突变菌株对DNA复制抑制剂羟基脲（HU）和微管毒素苯诺明以及咖啡因和甲酰胺敏感，这些试剂会引起许多细胞反应(A） ●●●●。缺乏应变HTZ1型和YAF9号机组对HU和甲酰胺相当敏感，但htz1型Δ菌株对苯诺明和咖啡因更敏感。缺乏菌株SWR1软件对HU和甲酰胺的敏感性低于其他菌株，但对咖啡因和苯诺明的敏感性与yaf9号机组Δ应变(A） ●●●●。缺乏NuA4亚单位Eaf1p的细胞对HU和咖啡因最敏感，它们对苯甲酸和甲酰胺的敏感性与htz1型Δ突变体(A） ●●●●。虽然缺陷的严重程度不同，但SWR1-Com和NuA4中突变体的相似表型表明，这两种复合物广泛需要用于抵抗DNA损伤和遗传毒性应激。
NuA4和SWR1-Com具有相似的表型并在遗传学上相互作用（A） SWR1-Com和Eaf1p是抵抗DNA损伤和遗传毒性应激所必需的。用SWR1-Com亚基和EAF1（EAF1）在30°C下培养2–3天。使用含有以下浓度化学物质的YPD板：100 mM HU、10μg/ml苯诺明、2%甲酰胺或3 mM咖啡因。
（B） SWR1-Com和NuA4在基因上相互作用。从活孢子克隆的遗传分析中推导出的双突变体被圈出，每一个交叉中的两个感兴趣的突变显示在旁边。所有双突变体都是不可见的。
为了测试对DNA损伤和基因毒性应激的敏感性是否是SWR1-Com和NuA4的共同功能，或者这些敏感性是否是由独立功能引起的，使用EAF1（EAF1）作为示例性NuA4亚单位的基因。未获得删除了EAF1（EAF1）和HTZ1型,SWR1、，或YAF9号机组(B） 。因此，SWR1-Com和NuA4在遗传上相互作用，这两个复合物至少具有一种基本功能。
讨论
用变异组蛋白替代典型组蛋白的蛋白质复合物是调节染色质功能状态的基本机制。以前的工作已经确定了能够组装、重塑和修饰染色质的大型蛋白质复合物（参见贝克尔和霍兹2002;彼得森2002). 相反，这里描述的研究确定了一种新的复合物，称为SWR1-Com，其假定的ATP酶Swr1p促进组蛋白H2A变体H2A的沉积。Z、 在体内转化为染色质。
SWR1-Com，一种多亚单位复合体，与H2A特异性相关。Z轴
SWR1-Com通过其与H2A的特异性关联进行鉴定。Z.SWR1-Com由13个亚基组成：其中6个仅在SWR1-Com中发现，4个在SWR1-Com和NuA4之间共享，4个是在SWR1-Com和Ino80复合体之间共享。这三个复合物中都含有两个亚单位Arp4和actin（参见). SWR1-Com的几个亚单位包含的基序高度暗示了该复合体在影响染色质结构中的作用。其中最主要的是Swr1p，它是Swi2/Snf2 ATP依赖性染色质重塑酶复合物的含ATP酶亚单位的亲属(波拉德和彼得森1998). Swc4p亚单位包含一个SANT结构域，在其他情况下被认为可以介导蛋白质与组蛋白尾部的关联(Boyer等人，2002年;Sterner等人，2002年). 类似地，Bdf1p含有两个溴代腺嘌呤，它们优先结合组蛋白H3和H4的乙酰化尾部(Ladurner等人2003;Matangkasombut和Buratowski，2003年). Swc6p亚单位包含一个HIT结构域，该结构域位于与类固醇受体结合的人类蛋白质中(Lee等人，1995年)Yaf9p亚单位包含一个YEATS结构域，该结构域存在于涉及染色质修饰的几种蛋白质中，如SAS-I HAT复合物，以及与人类白血病相关的几种蛋白质(Xu等人，1999年;Le Masson等人，2003年). 相对于SWR1-Com亚基和H2A之间的相互作用，SWR1-Com亚基和H_2A之间的交互作用较弱。Z认为SWR1-Com的作用与富含H2A的染色质结构有关。Z.H2B-HA与H2A的结合进一步支持了这一点。高纯度SWR1-Com的Z-HA，表明该组蛋白二聚体是SWR1-Ccom活性的生理底物。
全基因组表达谱和表型分析确定了H2A之间的功能联系。Z和SWR1-Com
SWR1-Com功能中断和H2A损失的后果之间的相似性。Z蛋白提示H2A需要SWR1-Com。Z函数。这些相似之处包括缺乏SWR1-Com功能或H2A的细胞的惊人敏感性。Z对各种细胞和基因毒性应激。全基因组表达谱的比较开关量1Δ和htz1型Δ菌株在许多位点也表现出对两种功能丧失的类似反应。这些包括端粒附近基因的沉默和HMR公司沉默交配型基因座，被H2A拮抗。Z轴(Meneghini等人，2003年). 此外，还有一些位于沉默结构域远端的基因需要同时使用H2A。Z和Swr1p表示。因为大多数基因表达缺陷出现在开关量1Δ细胞也出现在htz1型Δ细胞、Swr1p和SWR1-Com的作用主要是促进H2A的功能。Z.公司。
H2A。SWR1-Com促进Z沉积到染色质中
SWR1-Com促进了H2A的沉积。Z变成染色质。在沉默者两侧的20个地点HMR公司先前确定为H2A富集或缺失的位点。Z、 H2A的比率。Z在这些位置相对于PRP8项目ChIP确定的ORF在开关量1Δ单元。此外，HA-H2A的绝对富集度急剧下降13倍。Z相关DNA在开关量1Δ单元。对12个H2A位点的分析也显示出类似的情况。Z沉积在染色体III上。因此，Swr1p是H2A富集所必需的。Z位于各种各样的位点，包括沉默区的远端。
一些证据表明，Swr1p和SWR1-Com可能在H2A中发挥直接作用。Z沉积到染色质中。最支持这种观点的是H2A的紧密物理结合。全细胞提取物中含有SWR1-Com的Z。此外，Swr1p和SWR1-Com的其他成员具有在染色质中作用的蛋白质中发现的序列基序，并且定位在细胞核中。特别是，Bdf1蛋白通过其溴代代谢物可能负责补充SWR1-Com以沉积H2A。Z到常染色区，通常以H4尾部乙酰化为特征。最后开关量1H2A中的Δ细胞。Z沉积和Swi2/Snf2家族成员直接作用于核小体的既定作用进一步支持了Swr1p和SWR1-Com在H2A中的直接作用。Z沉积。
一些观察结果与少量H2A一致。在缺乏Swr1p功能的细胞中染色质中的Z沉积。首先，一些基因受htz1型Δ不受开关量1Δ. 第二，H2A的富集。Z位于相对于PRP8项目ORF在开关量1Δ突变，表明H2A残留。Z出席PRP8项目。可能在没有SWR1-Com的情况下，会出现一些H2A。Z的沉积机制与H2A的本体沉积机制相同。然而，关键的观察结果是H2A明显缺乏。无Swr1p功能时的Z沉积。
Swr1p同源基因的保守性增加了SWR1-Com类复合物在其他生物体中沉积变异组蛋白的可能性。这个果蝇属Domino蛋白、人类SRCAP和人类p400是SWR1软件，并作为此类综合体创始成员的候选人。中的突变多米诺牌手表影响Polycomb蛋白的沉默，尽管这些影响的直接性尚不清楚(Ruhf等人，2001年). SRCAP蛋白与CREB结合蛋白相关，p400被腺病毒E1A癌蛋白征募(Johnston等人，1999年;Fuchs等人，2001年). 虽然SRCAP和p400主要被称为转录因子，但我们的结果表明这些蛋白在变异组蛋白沉积中可能发挥作用。在审查这项工作的同时，两个小组独立报告了SWR1-Com，并描述了其在H2A中的作用。Z沉积(Krogan等人，2003年;Mizuguchi等人，2004年). 与我们的数据一致，纯化的SWR1-Com具有Swr1p依赖的组蛋白交换活性(Mizuguchi等人，2004年)因此提出了染色质重塑的第三种机制。
SWR1-Com和NuA4功能已链接
SANT-domain-containing proteins Swc4p和Eaf1p是NuA4的亚单位，这里有新的描述。与其他NuA4亚单位相关的蛋白质和缺乏NuA4的细胞EAF1型有全局组蛋白H4乙酰化缺陷。在一株携带必需的SWC4软件基因（M.S.K.、H.Xu、C.Boone和J.R.，未发表数据）。Swc4p与SWR1-Com共享，而Eaf1p则不共享。然而，细胞缺乏EAF1（EAF1）与缺乏SWR1-Com和H2A亚单位的细胞一样，对DNA损伤药物和基因毒性应激条件敏感。Z.虽然已知NuA4参与DNA损伤存活(Bird等人，2002年;Choy和Kron，2002年;Boudreault等人，2003年)，本文提供的数据扩展了这一观点，表明在与SWR1-Com相一致的基因组完整性维护中可能需要更广泛的基因EAF1（EAF1）三个SWR1-Com亚单位揭示了更深层次的联系。具体来说企业外语Δ与SWR1-Com的空等位基因结合表明，这些复合物可能具有共同的基本功能。也就是说，当NuA4活性因缺失EAF1、，反之亦然。虽然了解这些机制还需要进一步研究，但这些数据表明H2A之间存在重要的功能联系。Z沉积机械和NuA4 HAT。
为什么SWR1、NuA4和Ino80复合体共享子单位？
如上所述，SWR1-Com的三分之一亚单位与Ino80复合体、NuA4 HAT或两者共享。虽然不同蛋白质复合体之间的亚基共享并非史无前例，但这可能反映了高度相关的功能，而不是进化过程中机会和环境的变幻莫测。SWR1-Com和NuA4之间的功能重叠和遗传互作支持了这一点。共享的亚单位可以充当核心支架，在染色质修饰周期中，独特的亚单位可在其上组装和交换。这个概念在一个名为piccolo NuA4的mini-NuA4复合体的存在中找到了一些支持，该复合体只包含NuA4特有的一些亚单位(Boudreault等人，2003年). SWR1-Com的共享亚单位可以协调类似mini-SWR1-Com的招募，以实现组蛋白亚单位替换，而mini-SWR1-Com则由piccolo NuA4取代，以实现新重组核小体的乙酰化。该模型可以解释为什么在H2A中检测到NuA4的两个亚单位（Tra1和Epl1p）。低严格条件下的Z相关材料（参见). 或者，NuA4对H2A的乙酰化可能有助于H2A取代H2A。Z.还可能涉及SWR1-Com、NuA4和Ino80-C复合物的其他作用顺序，例如H2A的乙酰化。Zby NuA4是SWR1-Com进行交换的先决条件。亚基共享的其他潜在作用包括将复合物靶向公共位置或促进其生物发生或组装。我们的数据可能解决了一个有趣的悖论，即Bdf1p在染色质上的定位。早期工作表明，Bdf1p是TFIID的一个亚单位，但在TFIID核心亚单位TATA盒结合蛋白不存在的区域中发现了Bdf1p(Matangkasombut和Buratowski 2003年). Bdf1p是两种不同复合物SWR1-Com和TFIID的一部分，这一发现解释了Bdf1p和TATA盒结合蛋白定位之间缺乏完美对应。
支持信息
图S1
共沉积SWR1-Com子单元的一部分：用抗HA抗体进行免疫印迹分析从含有HA标记的SWR1-Com亚单位（如右图所示）的全细胞提取物的甘油梯度离心中收集的部分。梯度为10%至40%的甘油，从顶部开始，每种情况下收集22个0.1毫升的组分（组分1）。所测试的所有六个SWR1-Com亚基的总细胞池的百分比存在于相同的组分中，与它们在一个复合物中的关联一致。
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图S2
H2A。SWR1-Com保护Z免受降解：从wt或开关量1对Δ菌株进行3HA-H2A水平测试。Z使用抗HA抗体。用抗Vma1p抗体的免疫印迹观察到，每次稀释都有等量的总蛋白提取物。H2A水平。中的Z开关量1Δ突变体减少约2至3倍。这表明SWR1-Com对H2A的稳定性有贡献。Z、 可能是通过保护它免受蛋白质降解。
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表S1
Rvb2-TAP纯化中的肽：（54 KB PDF）。
表S2
本研究中使用的酵母菌株：（95 KB PDF）。
表S3
ChIP寡核苷酸序列：（60 KB PDF）。
