染色质组装因子1是必不可少的，它将染色质组装与DNA复制结合在一起体内

摘要

在真核细胞中，DNA被包装成染色质，染色质是体内DNA复制机器的底物。父母的核小体暂时从DNA中移除，并在DNA复制叉后面快速组装(1–4). 还沉积了新的核小体从头开始在染色质组装因子1（CAF-1）催化的反应中复制叉处(5,6). CAF-1由三种表观质量为150、60和48 kDa的多肽组成，它们结合组蛋白H3和H4，并优先将组蛋白四聚体沉积在复制DNA上(7). H2A/B二聚体随后在不一定与DNA复制耦合的第二步中被加载(8). 核小体沉积中CAF-1的生化活性取决于它与DNA聚合酶滑动钳、增殖细胞核抗原（PCNA）的相互作用(9–11)并与其活动相一致在体外，CAF-1在S期复制灶中发现，也与DNA损伤后的PCNA灶有关(9,12,13). 在DNA修复过程中，CAF-1也在受损的DNA模板上沉积核小体在体外CAF-1和复制机制之间的这种紧密联系表明，正常的S期进展可能需要紧密耦合的DNA复制和染色质组装。

鉴于此从头开始核小体组装可能是一个必要的过程，令人惊讶的是，缺乏CAF-1的酵母是可以存活的，没有明显的细胞增殖表型(14,15). 这一观察结果表明，其他染色质组装途径可以补偿酵母CAF-1的损失。事实上，其他因素，如Asf1和组蛋白调节蛋白，都是已知的组蛋白结合蛋白(16,17)这些基因的缺失与CAF-1结合会导致严重的基因沉默和细胞增殖缺陷(18–20). 人类HIRA蛋白是酵母Hir1、Hir2和Hir3蛋白的直系同源物，最近已被证明参与复制无关的核小体组装，对于缺乏CAF-1和Asf1染色质组装途径的酵母来说，类似的途径可能就足够了(21).

酵母中CAF-1的破坏导致端粒和沉默交配型位点的基因沉默缺陷，当Asf1被删除时，这些表型增强(14,15,18). 类似地，CAF-1截短型的过度表达导致沉默转基因在人类细胞中的表达和发育缺陷爪蟾胚胎(22,23). 因此，CAF-1的丢失或抑制会影响染色质结构的组装，从而抑制酵母和人类的转录。

因为CAF-1与复制焦点紧密相连体内由于人类染色质明显比酵母染色质复杂，我们推测CAF-1可能在人类细胞增殖中发挥重要作用。通过小干扰RNA（siRNA）介导的复合物敲除来研究人CAF-1的功能。与酵母相比，人类CAF-1是通过S期有效进展所必需的，CAF-1的丢失激活了一个特定的检查点。此外，CAF-1的缺失完全消除了细胞提取物中的任何复制耦合染色质组装活性，表明该蛋白是复制分叉处的主要染色质组装机器。这些结果表明，CAF-1是有效复制叉进展所必需的，S期检查点机制监测染色质组装。

材料和方法

细胞培养和转染。RKO和HeLa细胞保存在标准培养基中。分别使用200或100 nM寡核苷酸浓度的寡核苷酸（Invitrogen）转染RKO和HeLa细胞。所有实验在0和24小时进行了两轮转染。siRNA寡核苷酸来自Dharmacon，每个寡核苷酸的靶向序列为对照GL3（针对萤火虫荧光素酶）：CUUACGCUGAGUACUGAdTdT；150-1，AGGGGAAAGCCGAUGACAUdTdT；和150-2，CUGUCAUGGGUUCUGACdTdT。

流式细胞术分析。为了进行细胞周期流式细胞术分析，细胞通过胰蛋白酶化收集，洗涤，在冷甲醇中固定，洗涤，并在20μg/ml碘化丙啶（PI）和10μg/ml核糖核酸酶中染色。细胞在Coulter Epics Elite仪器上进行分析。为了进行BrdUrd/PI流式细胞术分析，收集细胞，将其固定在甲醇中，并用FITC偶联的抗BrdUrd（Becton Dickinson）和碘化丙啶（有关详细信息，请参见支持文本作为支持信息发布在PNAS网站上，网址：www.pnas.org).

蛋白质印迹和免疫荧光。总细胞提取物在转移至硝化纤维素的SDS/10%PAGE凝胶上分离，并进行处理以进行Western分析。用SS1或SS48单克隆抗体检测CAF-1 p150，用SS53抗体检测CAF-1 p60，用PC10抗体检测PCNA。还使用了抗-Chk1、抗Chk1磷酸-S317、抗Chk 2磷酸-T68、抗p53磷酸-S15（细胞信号技术）、抗p5（CM1，NovoCastra）和抗p21/CIP1/WAF1（BD Transduction Laboratories）。有关抗体稀释的详细信息，请参阅支持文本.

为了进行免疫荧光分析，在转染前16小时将细胞接种在盖玻片上。转染后，将细胞固定在PBS中2%的多聚甲醛中，并进行免疫荧光处理（参见支持文本详细协议）。为了观察染色质结合的PCNA，在CSK缓冲液中用Triton X-100预先提取细胞(13). 使用的主要抗体为抗CAF-1 p150 SS1、抗PCNA PC10、抗p53磷酸化-S15、抗Chk1磷酸化-S317和Alexa Fluor 594-结合抗BrdUrd（分子探针）。次要抗体是山羊德克萨斯红抗兔或FITC抗鼠（杰克逊实验室）。细胞在蔡司Axioplan或Axiopot显微镜上使用×40或×63油浸物镜进行可视化。使用OPENLAB v.3.1.1软件处理图像，并传输至photoshop（版本6.0；Adobe Systems，Mountain View，CA）用于程序集。

体外染色质组装分析。使用提取方案，在48小时从两个转染siRNA的细胞板中制备HeLa细胞提取物(24)其中细胞质细胞提取物（命名为S100组分）和细胞核是通过25G½针头低渗溶解和细胞机械破碎制备的。含CAF-1的核提取物是通过高盐提取核芯块制备的（参见支持文本). 按说明进行染色质组装分析(9). 在一步分析中，使用10、20和30μg核提取物作为CAF-1的来源。对于两步分析，20 fmol在体外-通过旋转柱过滤纯化的复制DNA在存在或不存在40 fmol重组CAF-1和25或50μg S100提取物的情况下组装，作为组蛋白H3/H4和组装所需的其他未知因素的来源。还添加了限制反应的外源拓扑异构酶I（每个反应1个单位，京都Takara Shuzo）、拓扑异构酶II（100 ng）和组蛋白H2A/B二聚体（280 ng）。重组CAF-1和猴病毒40（SV40）T抗原来自杆状病毒感染的Sf9细胞(9)，拓扑异构酶II来自小牛胸腺(25)和H2A/B二聚体(26)来自人类细胞。

结果

正常S相进展需要CAF-1。为了检测CAF-1在人类细胞中的功能，设计了两种针对编码复合物p150亚基的信使核糖核酸的siRNA(27,28). 转染这两种寡核苷酸中的任何一种，但不是非特异性对照寡核苷酸，导致RKO细胞中CAF-1的显著下调。通过每隔24小时转染两次，到转染后48小时，95%以上的细胞被显著敲除(图1A类和数据未显示）。Western blot分析也检测到CAF-1复合物p60蛋白的伴随降低。由于免疫耗竭实验表明，293个核提取物中CAF-1的两个最大亚单位几乎完全存在于一个复合体中（数据未显示），p60亚单位的同步减少可能反映了游离亚单位的周转增加。因此，p150的敲低会显著降低RKO细胞中CAF-1的活性水平。相反，PCNA（一种CAF-1相关蛋白）的水平(9)，未受影响(图1A类).

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图1。

CAF-1的RNAi诱导S期细胞聚集(A类)Western blot分析用对照寡核苷酸或两种靶向CAF-1 p150的不同寡核苷酸处理的细胞总细胞提取物。装载等量的细胞提取物，并用抗CAF-1 p150、CAF-1 p 60和PCNA的抗体进行检测。注意，p60的大部分在p150敲低细胞中被耗尽。(B类)转染后48和72小时对对照细胞和CAF-1缺失细胞进行细胞周期分析。用流式细胞仪测定DNA含量。

将缺乏CAF-1的细胞与对照siRNA处理的细胞的细胞周期分布进行比较。缺乏CAF-1的RKO细胞积累48小时，S期DNA含量增加，72小时进一步增加(图1B类). 72小时时，DNA含量低于2C的细胞群也变得明显，可能代表早期凋亡细胞群。HeLa和HCT116细胞在S期也有类似的细胞聚集（数据未显示）。为了进一步检查S期进展缺陷的性质，用BrdUrd对细胞进行10分钟或24小时的脉冲处理，并对BrdUrd和CAF-1进行免疫染色。10分钟脉冲后，细胞显示BrdUrd染色减少或没有染色，与24小时标记后含有CAF-1的细胞相比，染色大大减少，表明DNA复制速度减慢，但没有完全被抑制(图2A类). 使用二维流式细胞术分析检测S期DNA含量的细胞中BrdUrd掺入证实了这一结果。如前所述，p150的敲除导致S期细胞数量增加48小时，但CAF-1缺失细胞中S期细胞弧的扩散证明细胞结合BrdUrd的能力较差，这表明DNA复制存在缺陷(图2B类). 72 h时，BrdUrd掺入缺陷更为严重。用2 mM羟基脲（HU）预处理RKO细胞1 h，阻止所有BrdUrd掺入，表明CAF-1缺失细胞中非零掺入量不是由背景染色引起的（数据未显示）。我们的结论是，CAF-1的丢失导致DNA复制和S期细胞积累缓慢。

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图2。

CAF-1缺失导致S期进展缓慢。(A类)CAF-1敲除细胞用40μM BrdUrd脉冲处理10分钟（转染后48小时）或24小时（转染之后36–60小时），并用BrdUrd和p150特异性抗体染色。对照细胞显示出高水平的BrdUrd掺入，而CAF-1缺失细胞没有有效地掺入BrdUrd（箭头所示）。(B类)二维流式细胞术分析监测BrdUrd掺入和DNA含量。细胞用BrdUrd脉冲处理10分钟，固定，并用FITC-偶联的抗BrdUrd抗体和碘化丙啶染色以染色DNA。BrdUrd强度以对数刻度绘制在年轴，DNA含量绘制在x个轴。G公司₁，G₂、和S期人群在每个样本中都被选通，右上角的数字表示每个样本中BrdUrd-阳性细胞的百分比。

CAF-1阴性细胞在S期早期和中期积聚。CAF-1在整个S期定位于DNA复制病灶，CAF-1的丢失可能通过干扰复制因子的募集而影响复制(9). CAF-1也在异染色质的复制和成熟中起作用，因为它定位于S期晚期异染色素复制的位点(12)结合异色HP-1蛋白并将其招募到DNA在体外(29)，并且CAF-1的缺失导致酵母和人类细胞中的沉默缺陷(14,15,22). 因此，CAF-1的丢失可能会不成比例地影响异染色质的复制，导致复制病灶在细胞中的分布发生改变。为了检验这种可能性，在RNA干扰（RNAi）处理后用PCNA对细胞进行染色，并测定复制病灶的分布。S期的阶段可以通过PCNA染色的特征模式来区分，PCNA染色在S期的早期、中期和晚期(30–32) (图3A类). 晚期S相模式(4和5)在整个核质和核外围有数量较少、较大的病灶。对细胞进行染色质结合PCNA染色，并检查对照细胞或CAF-1 RNAi处理细胞中的复制灶。CAF-1缺陷细胞中显示晚期S期模式的细胞数量显著减少(图3B类和C)观察到早期和中期S相模式都相应增加。没有发现异常复制模式，这表明复制工厂组装正确，复制缺陷发生在PCNA招募的下游。晚期S期细胞数量较少可能是由于异染色质复制困难，但也可能是由于S期进展中存在更广泛的缺陷。

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图3。

CAF-1缺失细胞聚集正常复制灶，并在S期早期至中期积聚。(A类)对细胞进行染色质结合的PCNA染色，并对复制模式进行评分。提供了早期、中期和晚期S相模式的示例。(B类)晚期S期模式在对照细胞中很容易看到，但在用CAF-1靶向siRNA处理的细胞中发现的频率较低。箭头表示早期、中期和晚期复制位点(▹, 早期S相模式；→, 中间S相模式；▸, 晚期S相模式）。(C)转染48小时后，S期细胞的分布显示早期、中期或晚期S期复制模式。每个样品计数300个S期细胞，结果是两个独立实验的平均值。

CAF-1丢失激活检查点。DNA复制速度的降低和复制分叉的缓慢或停滞会导致S期内检查点的激活(33). 检查点激酶ATR通过优先在S317和S345上磷酸化激活下游激酶Chk1，以响应复制叉应激或DNA中大量加合物的存在(34). 相反，ATM优先被激活以响应人类细胞中的双链DNA断裂，并通过磷酸化T68激活Chk2激酶(35–37). ATM和ATR都磷酸化S15上的p53，导致该蛋白转录反式激活潜能增加(38). 为了测试RKO细胞中CAF-1激活的检查点通路是否丢失，使用了针对Chk1、Chk2和p53的磷酸特异性抗体。在缺乏CAF-1的细胞中检测到Chk1的S317磷酸化，但未诱导Chk2磷酸化(图4A类). 48小时后诱导p53水平，诱导蛋白在S15上磷酸化(图4A类). p53转录靶点p21的积累也被检测到，表明p53在这些细胞中是活跃的(图4A类). Chk1而非Chk2的激活意味着DNA损伤反应途径的ATR分支已被激活，这与CAF-1缺乏导致持续DNA复制缺陷一致。

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图4。

CAF-1缺失细胞中的检查点激活。(A类)对CAF-1 RNAi后的总细胞裂解物进行Western分析，以通过使用针对p53 S15、Chk1 S317和Chk2 T68的磷酸特异性抗体来监测检查点激活。整体Chk2水平不变（数据未显示）。将用羟基脲（20mM）处理24小时的细胞提取物作为阳性对照，该提取物导致所有三种蛋白质的磷酸化。(B类)对照细胞和CAF-1缺失细胞中检查点激活和BrdUrd掺入的时间进程。每孔接种三个盖玻片，并根据标准方案进行转染。在转染后24、36、48和60 h收集细胞，用BrdUrd脉冲处理10 min，并用p53的S15、Chk1的S317或BrdUrd的磷酸特异性抗体染色。24小时内的细胞只转染过一次。与对照组相比，36小时后BrdUrd掺入量出现了一些损失，转染后48小时，BrdUrd掺入量显著下降。(C)对单个CAF-1敲除细胞中的检查点激活和BrdUrd掺入进行比较的绘图，将其归一化以控制转染细胞。对于对照和CAF-1靶向寡聚物1的每种抗体，每个时间点计数三百个细胞，所示结果是两个实验的平均值。所有在背景上显示检查点激活的细胞，只有明亮的BrdUrd标记细胞被评为阳性。直到转染后48小时才发现显著的检查点激活。

CAF-1敲除细胞中出现的缓慢复制可能是由DNA复制的主要缺陷或检查点机制的激活引起的。为了分析这一点，在转染后24到60小时内，通过监测p53和Chk1磷酸化以及免疫荧光分析BrdUrd掺入，将DNA复制缺陷的发生与检查点激活进行比较。36小时时检测到BrdUrd掺入减少，转染后60小时DNA复制似乎受到很大抑制，尽管仍能检测到非常微弱的复制病灶(图4B类和C). 然而，p53的显著磷酸化仅在48小时时出现，并在60小时时在更多的细胞中积累(图4C图6，作为支持信息发布在PNAS网站上）。与对照细胞相比，p53磷酸化增加约50倍(图4C)，而Chk1磷酸化比对照组增加4倍，可能是因为即使在对照细胞中也有一些活化(图4A类，C车道，48小时）。这些数据表明，p53和Chk1的激活与复制缺陷的发生同时发生或稍晚发生。

CAF-1对于复制偶联染色质组装来说是必要和充分的。在支持SV40 DNA复制的S100提取物存在下，从人类细胞核组装染色质纯化的CAF-1(5,7). 由于CAF-1在酵母中不是必需的，因此在DNA复制耦合染色质组装反应中，核提取物中存在的其他因子可能会替代CAF-1。因此，对转染CAF-1 siRNA的细胞的核提取物进行染色质组装活性测试。在HeLa细胞转染对照或p150靶向siRNAs 48小时后，从HeLa细胞核和S100细胞制备小规模提取物。CAF-1仅与核提取物分离，而PCNA在两个组分中都发现(图5A类). 用对照寡核苷酸转染细胞的提取物能够优先支持复制模板上的染色质组装，如在CAF-1存在下复制模板的超螺旋增加所测，而p150敲除细胞的提取物不能支持染色质组装(图5B类). 这显然是由于CAF-1蛋白的缺陷，因为添加纯化的重组CAF-1可以将组装活性恢复到正常水平。这表明CAF-1对于人类细胞提取物中的DNA复制偶联染色质组装至关重要。

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图5。

复制耦合染色质组装活性取决于CAF-1。(A类)RNAi后HeLa核和S100组分中CAF-1的Western blot分析。(B类)一步染色质组装分析，以监测控制和CAF-1缺失核提取物将复制SV40 DNA组装成核小体的能力。包含SV40来源的pSV011 DNA在包含³²P-dATP标记复制的DNA，并用核提取物或重组CAF-1组装成染色质。封装在染色质积累的负超螺旋中的DNA相对于未组装的DNA流动性增强[比较通道1（低CAF-1）和通道2-4（足够的CAF-1”）]。溴化乙锭染色显示大量未复制DNA(下部)保持放松，表明CAF-1优先将核小体装载到复制DNA上。当CAF-1被RNAi耗尽时（5-7和9-11通道），组装没有发生。添加重组CAF-1恢复了这些提取物中的组装活性（泳道8和12）。将核提取物（10-30μg）滴定到每组反应中。(C)两步染色质组装分析表明，来自CAF-1敲除细胞的S100含有组装染色质所需的所有辅助因子（包括组蛋白H3和H4）。SV40 DNA在S100复制提取物中复制，通过凝胶过滤从蛋白质中纯化，并在存在或不存在CAF-1的情况下与来自对照或p150缺失提取物的S100孵育。每次反应中使用25μg和50μg提取物。在这些条件下，组装成染色质需要CAF-1（比较通道3和4，–/+CAF-1）和S100（比较通道2和4）。乙炔染色中的未复制DNA(下部)没有组装成染色质，并且基本上保持松弛。

在S期持续进行的组蛋白合成是高效S期进展和Hir蛋白异位表达所必需的，Hir蛋白抑制组蛋白基因的表达，导致复制缺陷，类似于CAF-1缺失时的复制缺陷(17,39,40)因此，对S期细胞聚集的一种解释可能是CAF-1的丢失间接影响了未结合组蛋白和新合成组蛋白的水平。这些组蛋白池存在于细胞的细胞质中，该组分中的H3和H4对于由CAF-1介导的复制后染色质组装至关重要(9,41). 为了确定组蛋白H3和H4是否在CAF-1缺失的提取物中受到限制，使用了两步染色质组装试验，其中首先复制SV40 DNA并进行放射标记在体外在标准的DNA复制反应中，通过快速凝胶过滤步骤，将产生的DNA-蛋白质复合物从DNA复制所需的其他蛋白质组分中分离出来。这种“标记”的DNA随后在依赖于CAF-1的第二次反应中组装成染色质(9,41). CAF-1能够在复制的DNA上组装染色质，因为PCNA在复制后仍与DNA拓扑连接，并且可以招募CAF-1。随后的染色质组装反应需要S100提取物提供的成分，包括组蛋白H3和H4(41). 在本试验中，从缺乏CAF-1的细胞制备的S100提取物支持重组CAF-1组装染色质的能力没有缺陷(图5C). 此外，组蛋白H3的总水平在CAF-1敲除细胞中未受影响（数据未显示）。这些结果表明，CAF-1的缺失不太可能对组蛋白合成或稳定性产生影响。

讨论

染色质组装和DNA复制在真核细胞中紧密耦合。核小体仅在复制叉前短暂中断，并迅速沉积并定位在复制叉后(1,3,4,42,43). 染色质组装蛋白CAF-1长期以来一直被假设为将染色质组装与真核细胞中的DNA复制耦合，但当CAF-1的缺失导致酵母中只有适度的表型时，这一假设受到了质疑(14,15). 在本报告中，我们表明CAF-1是人类细胞中主要的复制耦合染色质组装机器，CAF-1的丢失导致DNA复制和S期进展的缺陷，这表明在人类细胞中，CAF-2将染色质组装耦合到DNA复制，对细胞增殖至关重要。

一些研究报告了CAF-1显性负性版本的过度表达，也得出结论，CAF-1对细胞增殖至关重要。人CAF-1 p150在爪蟾通过干扰细胞分裂抑制胚胎的正常发育(23). 类似地，无法结合PCNA的CAF-1短暂过表达导致人类细胞S期阻滞(44). 本研究还表明，显性阴性CAF-1的表达诱导了S期内检查点，显性阴性ATR仅能在同样缺乏ATM的细胞系中消除S期阻滞，这与这两种激酶在介导显性阴性CAF1诱导的阻滞中的作用一致。然而，在这两项研究中，显性负性结构的隐秘功能可能在诱导观察到的增殖缺陷中发挥了作用。然而，我们的实验使用了一种独特的RNAi方法来消除CAF-1功能，与之前的研究一致，并证明了CAF-1在S期进展中的基本作用。这不太可能是由于H3和H4细胞质池或DNA复制和染色质组装所需的其他细胞因子耗竭所致在体外.

CAF-1在S期进展中的作用是什么？复制叉组装正常，因为CAF-1缺失细胞中PCNA的S期染色模式正常，其他复制蛋白如RPA、RFC和DNA聚合酶-δ仍被招募到染色质中（数据未显示）。然而，CAF-1缺陷细胞在S期早期和中期积累，表明通过S期的进展受到抑制。这可能是由于早期S期复制分叉停滞、染色质缺陷引起的S期内检查点激活或异染色质复制中的特定缺陷引起的。异染色质通常在S期复制较晚，对S期进展缺陷的部分解释可能是CAF-1在异染色素复制中起着特殊而独特的作用。标记异染色质的蛋白质，如HP1，有可能通过自结合将染色质纤维交联成一个致密且不易接近的结构(45,46). 因为CAF-1结合HP1色影结构域，所以它可能在复制过程中破坏异色结构，使复制机制通过异染色质有效进行，从而解释为什么CAF-1的丢失会导致早期和中期S期细胞的积累。

然而，CAF-1在整个S期定位于复制灶，并且由于其与PCNA的相互作用而与所有复制叉密切相关。这一观察结果表明，CAF-1可能在DNA复制中发挥更广泛的作用，包括在复制叉前后处理核小体。对复制SV40微小染色体的分析表明，核小体在复制分叉前短暂中断，在复制分岔后迅速组装(2). H2A和H2B在复制过程中交换，但H3和H4四聚体仍与DNA相关(1). 因此，与复制叉相关的H3/H4伴侣，如CAF-1或Asf1，可能参与复制叉传代所需核小体的短暂失稳，干扰此功能可能会干扰复制叉的进展，CAF-1的丢失可能通过改变DNA拓扑结构而更间接地影响复制。核小体有助于基因组的拓扑状态，因为它们将负超螺旋引入DNA。在没有CAF-1介导的染色质组装的情况下，给定DNA片段上的总超螺旋密度可能会显著降低。负超螺旋有助于局部DNA解旋，核小体的破坏可能在复制叉进展中很重要。为了支持DNA拓扑学在哺乳动物复制中的作用，最近发现蛋白质DEK-1可以在不剥离组蛋白的情况下降低核小体DNA的超螺旋密度(47)SV40染色体与DEK-1孵育显著降低DNA复制效率在体外(48).

众所周知，停滞的复制叉可以激活S期内检查点，DNA拓扑结构的改变或暴露过多的裸DNA可能是检查点机器监测到的新损伤。我们在CAF-1敲除细胞中检测到了Chk1的激活，但没有检测到Chk2的激活，以及p53及其转录靶点p21的激活。活化的Chk1促进Cdc25A的降解，从而干扰CDK活性并导致S期进展缓慢(49). 此外，p21通过p53的上调可能在复制阻滞中起作用，因为p21与PCNA结合以应对DNA损伤并抑制DNA复制在体外或通过其CDK抑制作用阻碍S期晚期进展(50–52).

我们的数据表明，复制缺陷的出现先于或与检查点激活同时发生，尽管早期可能存在低于检测阈值的低水平检查点活动。因此，检查点激活可能是由CAF-1丢失导致的暂停复制分支的存在引起的。然而，CAF-1也可能与检查站机制有更密切的联系。在酵母中，Asf1染色质组装蛋白与人类Chk2同源物Rad53相互作用(53,54). 为了应对DNA损伤，Asf1从Rad53中释放出来，可以自由结合H3和H4并促进染色质组装。Asf1的过度表达抑制了雷达53–21突变体，将Asf1与Rad53的检查点和复制功能联系起来(53). CAF-1和Asf1也在维持酵母基因组完整性中发挥作用，因为这些基因与检查点基因（如电话1，chk1，以及dpb11型导致染色体总重排和突变率增加(55). 在人类细胞中，Chk1被认为以与酵母Rad53类似的方式监测复制，它激活Tlk激酶，而Tlk酶又以Asf1和潜在的其他染色质沉积因子为靶点，以应对DNA损伤(56). 因此，CAF-1和Asf1可能直接向检查点机制发出染色质状态的信号，这些蛋白质的丢失可能导致检查点激活(13,15).

在哺乳动物细胞中，组蛋白H3有两种主要形式，即组蛋白H3.1和组蛋白H3.3。前者被加载到复制的DNA上，而H3.3在基因组转录区取代H3.1(57). 有趣的是，酿酒酵母只有组蛋白H3的H3.3版本，可能是因为大多数基因组是转录的(58). 因此，我们认为CAF-1在酵母中不是必需的，因为两种相关形式的染色质之间不存在区别。然而，在人类细胞中，CAF-1主要将组蛋白H3.1型核小体沉积并维持在复制DNA上，因此是必不可少的。

补充材料

致谢

笔记

缩写：CAF-1，染色质组装因子1；增殖细胞核抗原；小干扰RNA；Hir，组蛋白调节。

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