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.2002年7月；22(13):4723-38.
doi:10.1128/MCB.22.13.4723-4738.2002。

真核转录机器的蛋白质组学：用多维质谱鉴定与酵母TFIID组分相关的蛋白质

史蒂文·桑德斯 1, 詹妮弗·詹宁斯, 阿德里安·卡努特斯库, 安德鲁·林克, P安东尼·威尔
附属公司

真核转录机器的蛋白质组学：用多维质谱鉴定与酵母TFIID组分相关的蛋白质

史蒂文·桑德斯等。 分子细胞生物学. 2002年7月.

摘要

一般转录因子TFIID是TATA结合蛋白（TBP）和14种不同的TBP相关因子（TAF）的多亚单位复合物。尽管TFIID成分是大多数mRNA编码基因转录启动所必需的，但TFIID的作用机制尚不清楚。为了深入了解TFIID的功能，我们试图生成一个与TFIID亚单位特异性相互作用的蛋白质组目录。为此，使用针对每个亚单位的多克隆抗体对TFIID进行系统免疫纯化，并通过耦合多维液相色谱和串联质谱直接鉴定TBP-和TAF-相关蛋白群。观察到许多新的蛋白-蛋白质关联，并对其中一些进行了详细描述。这些相互作用包括TBP与RSC染色质重塑复合体之间的关联，Swi6p反式激活蛋白与TFIID的TAF17p依赖性关联，以及SAGA乙酰转移酶复合体的三个新亚单位的鉴定，包括一个假定的泛素特异性蛋白酶组分。我们的结果为mRNA基因转录机制提供了重要的新见解，并证明了构建真核转录器完整蛋白质组相互作用图的可行性。

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数字

图1。
图1。
与TFIID的TBP和TAF亚单位相关的蛋白质的鉴定策略。（A） Bio-Rex 70色谱分级和免疫纯化程序概述。（B） DALPC示意图。详见正文。根据初始胰蛋白酶肽（即蛋白质）混合物的复杂性，可以增加从SCX微毛细管柱收集的组分的数量。（C） SDS-PAGE测定通过使用针对所有15个TFIID亚单位的抗原亲和纯化抗体进行免疫纯化的蛋白质组分的复杂性。将每个免疫纯化组分的5至10μl等分样品置于10%NuPAGE凝胶上，使用吗啉丙基磺酸缓冲液（Invitrogen）进行SDS-PAGE，并通过银染色显示分离的蛋白质。用于免疫纯化的抗体列在顶部，TFIID亚单位标记在左侧。用抗HA（HA）单克隆抗体IgG从一种来源于HA-TAF130型-材料和方法中描述的标记菌株作为阳性对照，并指示15个已知TFIID亚单位的流动性。在这一分析水平上，该抗HA免疫纯化组分仅包含TFIID亚单位，但存在两种污染蛋白质（参见标记为“对照”的阴性对照组分和箭头所示的多肽）。星号表示TFIID和SAGA之间共享的五个TAF。注意，由于免疫纯化效率低，抗TAF40p-IgG免疫纯化部分需要更多样品（20μl）用于SDS-PAGE。
图2。
图2。
DALPC方法的准确性、特异性和精密度。（A） TFIID和SAGA亚基的鉴定。来自一组免疫纯化（顶部列出的抗体）的代表性肽命中数据显示了由DALPC识别的TFIID和SAGA亚基（左侧）。所有肽都被唯一地分配给相应的蛋白质。共享的TAF分数有阴影；所有亚单位在各自的复合物中按分子量的降序排列。（B） 鉴定用针对TAF30p的抗体进行免疫纯化的蛋白质。三种独立衍生的抗TAF30p-IgG免疫纯化制剂接受DALPC。各分析中已知含TAF30p复合物（列在每个框顶部）的蛋白质亚基（列在每框左侧）的鉴定所用的肽命中数据（参见丰度颜色代码的图例）列在各列中。在任何部分中均未发现介体亚单位Srb8p、Srb9p、Srb10p和Srb11p。
图3。
图3。
DALPC蛋白质评分。显示了DALPC鉴定TFIID亚单位的肽命中数据（顶部；参见颜色编码图例）和评分（底部）。用于免疫纯化的抗体列在顶部，每个标签下的方框列对应于DALPC分析的肽命中数据，这些肽命中数据是用相应抗体独立生成的免疫纯化部分。由DALPC鉴定的TFIID亚单位蛋白质显示在左侧，按分子量递减顺序列出，图中列出了每个蛋白质对应的肽点击数。所有的肽被唯一地分配给相应的蛋白质。评分公式和用于计算分数的分数显示在中间。计算TFIID评分与对照评分的t值，并比较其显著性(对)t值的测定采用逐步下降多元排列试验（17）(n个1= 9,n个2=32，α=0.05）。DALPC在对照组或TFIID组分中鉴定TFIID亚单位的得分以表格形式显示在底部。注意，使用这种统计分析（即降压多元排列测试）对值可以为零。
图4。
图4。
新SAGA亚基的鉴定。（A） DALPC在STAF组分中鉴定的蛋白质按其得分排序。意义(对)每个蛋白质的STAF和TFIID-S评分的计算t值的比较是通过逐步下降的多元排列测试确定的(n个1= 10,n个2= 19, α = 0.05). 仅显示具有显著t值的蛋白质；候选SAGA亚基被遮蔽。α值为0.05（>95%置信度；如图所示）和0.1（>90%置信度）时获得了相同的结果，这表明除了列出的亚基之外，还有其他新的SAGA亚基的可能性很低。（B） DALPC肽点击输出，用于识别富含共享TAF组分的蛋白质，说明这些数据的特异性（即TFIID-S点击；左）和再现性（STAF）。肽命中丰度传奇如图3所示。（C） 候选亚单位编码YCL010C型,YGL066W型、和UBP8（UBP8）与SAGA相关。使用从未标记野生型菌株（−）或含有指示HA-标记等位基因的菌株（顶部）制备的WCE进行抗-HA IP。对每个输入（In，2%）和沉淀（P，25%）的一部分进行免疫印迹，以检测指示的蛋白质（左）。从同一印迹的四个独立暴露中检测到单个HA标记蛋白（底部）；检测每个蛋白质的输入和沉淀（top）来自相同的暴露。
图5。
图5。
推测TFIID-相关蛋白。（A） DALPC在用抗TBP和抗TAF IgG生成的免疫纯化制剂中识别的蛋白质根据TFIID评分进行排序。意义(对)TFIID和对照组得分的计算t值的比较通过逐步下降多元排列测试确定(n个1= 9,n个2= 32, α = 0.1). 仅显示具有显著t值（90%置信水平）的非TFIID亚单位蛋白质；在八个或九个（共九个）对照组分中鉴定的背景蛋白没有出现。指出了酵母蛋白质组数据库（11）中列出的功能分类。（B） Swi6p-TFIID关联依赖于TAF17p。免疫沉淀由对照（C道）、抗TAF65p（65道）、反TAF61p（61道）或抗TAF67p（67道）抗体与WCE制备而成TAF17开关6-HA三(TAF17型)单元格或taf17 SWI6-HA三(塔夫17)细胞在允许的温度（30°C）下生长。用适当的抗体对部分输入（2%）和沉淀（67%）进行免疫印迹，以检测所示的蛋白质（左）。输入物和沉淀物中TAF40p的检测来自同一斑点的独立暴露。
图6。
图6。
TAF30p是INO80染色质重塑复合物的一个完整亚单位。使用抗Flag MAb和从顶部列出的相关基因型菌株制备的WCE进行IP。输入（In，0.6%）和沉淀（P，25%）的一部分用适当的抗体进行免疫印迹，以检测左侧所示的蛋白质。
图7。
图7。
TBP与RSC染色质重塑复合物的相关性。（A） 在三种独立生成的抗TBP IgG免疫纯化制剂中，有三种由DALPC鉴定的蛋白质按TBP评分的降序排列；显示了TBP/TFIID得分比大于4的患者。星号表示已知的RSC亚单位；新的RSC候选亚基被遮蔽。（B） DALPC肽用于鉴定富含抗TBP IgG纯化组分的蛋白质。蛋白质按分子量递减的顺序列出。图例如图3所示。（C） TBP与RSC的关联。用WCE进行IPs，WCE由顶部和对照（泳道C）、抗TBP（泳道T）或抗TAF67p（泳道67）抗体指示的相关基因型菌株制备。对输入（In，2%）和沉淀（P，20%）的百分比进行免疫印迹，以检测指示的蛋白质（左）。（D） TBP与RSC的相互作用。一种由携带RSC的酵母菌株制备的WCEMYC-RSC1型和HA-RSC2型基因被用于2或5μg大肠杆菌-与谷胱甘肽琼脂糖结合的衍生重组GST或GST-TBP。通过考马斯蓝染色（凝胶）或免疫印迹（Blot）观察25%的每种沉淀物，以检测所示的蛋白质。输入等于2%。（E） 几个候选亚单位与RSC相关。如图4B所示，用表达所示HA标记基因的酵母菌株制备的WCE进行具有抗HA MAb 12CA5 IgG的IP（顶部）。输入等于4%，沉淀等于20%。注意，与输入相比，Sth1p在沉淀中的迁移速度较慢；这种行为的原因尚不清楚。
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