Hir蛋白是位置依赖性基因沉默所必需的酿酒酵母在没有染色质组装因子I的情况下

酵母菌株。

本研究中使用的酵母菌株的基因型如表所示​表1。1所有使用的菌株均来自菌株W303(70)通过转化或与该背景中的其他菌株杂交第21页Δ：：HIS3等位基因，从GNX193-1B菌株回交(44)在构建此处使用的菌株之前，对W303菌株进行六次测试。先前描述的缺失等位基因包括以下内容：碳酸钙1Δ：：LEU2,碳酸钙Δ：：TRP1,碳酸钙Δ：URA3,碳酸钙Δ：：hisG-URA3-kan-hisG、和URA3-VIIL公司(28);希尔1Δ：：HIS3和希尔3Δ：：HIS3(53);sir1Δ：：LEU2(21);（hht1-hf1）Δ：：LEU2（质粒pUK192[39]);（小时2小时2小时）Δ：：HIS3（pUK431）[39]);hhf2型Δ：：LEU2（pPK21[29]);（hta2-htb2）Δ：：TRP1（pJH21）[16]); 和嗯Δ：：LEU2（pJH455）[76]).

如其他地方所述，通过醋酸锂转化野生型二倍体进行基因破坏(24). 所选菌落在转化后纯化两次，然后产孢。所有病例的DNA杂交均证实了正确的基因断裂。这个HTA1型Δ负-HIS3型进一步检查菌株，以确保其具有Hir⁻表型(48)：在收获前用0.2M HU处理30分钟，从对数期细胞中分离出的总RNA通过Northern blot杂交进行分析，表明HTA1型mRNA没有下调（数据未显示）。

遗传程序和培养基。

标准程序用于遗传杂交和四分体分析。用于杂交和标记遗传标记分离的标准酵母培养基如其他地方所述(24). YPAD是酵母提取物-胃蛋白酶-葡萄糖（YPD）培养基，补充50 mg/L的腺嘌呤。在所有情况下，以1 mg/ml的浓度将5-氟代甲酸（FOA）添加到合成培养基中。

活性和生长分析。

通过将YPD肉汤中在30°C下呈指数增长的细胞系列稀释液电镀到预热的YPD平板上，并在30和37°C下培养，进行活性测试。在进行重复电镀之前，还使用血细胞仪对样品（80μl固定在磷酸盐缓冲盐水中–3.7%甲醛）进行计数，以确定总细胞数。在30或37°C的YPD培养基中，根据660nm的吸光度测定生成时间；对于几个计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体，通过用血细胞仪计数细胞数量来确定产生时间。因为trp1-1型W303菌株背景中存在的等位基因导致16°C时生长缓慢，我们进行了对照实验以表明计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体在这个温度下有生长缺陷，这与TRP1号机组基因（数据未显示）。

端粒沉默测定。

为了测量端粒沉默URA3公司如前所述，将基因插入染色体VIIL端粒旁(28); 最初在参考文献中描述11). 我们发现，使用对数相细胞可以获得等效结果(A类₆₀₀，～0.6）从液体培养基或从平板上取下的细胞，并调整为A类₆₀₀～0.6（参见参考文献57). 为了定量评估群体中沉默细胞的比例，将细胞置于含有或不含FOA的合成培养基上（表中数据的质粒可以是完整的，也可以是选择性的​表4），4)，并且在30°C下孵育8天后测定每个接种的活细胞的FOA抗性集落的数量。由计算机辅助计算Δ菌株在解剖显微镜下计数。3天后，在合成的完全（或选择性）培养基平板上计数菌落，以评估活的平板细胞数量。为了校正不同批次平板中FOA效力的变化，每次重复实验时，将FOA抗性细胞的分数标准化为野生型菌株的分数。在使用携带质粒的菌株进行的实验中，每个受试菌株的重复转化子得出了相同的结果。在某些情况下，通过在含有或不含FOA的培养基上检测5μl数量的10倍连续稀释的细胞，可以获得端粒沉默的视觉、半定量评估；然而，这些现场测试的数据并没有用于获得所给出的数值。

定量交配分析。

按照其他说明进行定量分析(7)，使用菌株216(垫子一他的1)和217(垫子α他的1)作为测试人员。补丁匹配测试（见图。​图3C）三C） 通过在30°C的YPD培养基上培养细胞贴片过夜，然后将贴片复制镀在合成葡萄糖琼脂平板上，将合适的交配测试仪的新鲜培养物涂在该平板上，或将其作为细胞生长的对照物涂在YPD平板上。在30°C下生长2天后拍摄斑块。

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图3

删除两者CAC公司和HIR公司基因协同减少端粒近端的沉默URA3公司基因ADE2型基因位于HMR公司、和一天然基因HML公司轨迹。（A） 代表菌株沉默的定量。PKY090码(CAC公司⁺)，PKY106(碳酸钙1Δ），PKY117(希尔1Δ），PKY361(第21页Δ），PKY329(第21页Δ希尔1Δ），PKY360(碳酸钙1Δ第21页Δ），PKY302(碳酸钙1Δ希尔1Δ）和JRY4470(沉默信息调控因子2Δ）。将每个菌株的十倍连续稀释液置于非选择性（YPAD）培养基上，观察细胞总数，并置于FOA培养基上观察能够沉默端粒的细胞。对于每个独立实验，活细胞对FOA（FOA）的抵抗率^R（右）)归一化为野生型（wt）应变的值；给出了三个实验数据的平均值±标准偏差，未观察到FOA耐药菌落（2×10⁶至4×10⁶电镀）。（B） 含有HMR公司⁺::ADE2型等位基因(68)在不添加腺嘌呤的YPD培养基上生长。深色菌落表示沉默ADE2型基因。菌株PKY268（野生型[wt]），PKY269(碳酸钙1Δ）和PKY375(碳酸钙1Δ希尔1Δ）。（C） 菌株PKY730(垫子一公顷Δsir1Δ碳酸钙Δ希尔3Δ）（左）和PKY364(垫子一HML公司αsir1Δ碳酸钙Δ希尔3Δ）（右）被复型镀到YPD培养基上以测试生长（上面板）或铺有交配测试菌株217草坪的合成葡萄糖培养基上(垫子α他的1)选择二倍体形成（下面板）。

生长缺陷计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体。

单体损失CAC公司或HIR公司基因不会导致生长缺陷，同一组中的多个成员也不会丢失(9,28,60)（图。​（图2）。2). 然而，大多数计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体细胞在30°C下的生长速度略慢于野生型或单突变体细胞，这反映在平板上的菌落尺寸减小；这种表型在低（16°C）（数据未显示）和高（37°C）时加重（图。​（图2A）2A） 尽管没有与37℃生长相关的特定形态缺陷（例如细胞周期阻滞表型）。只有当缺失CAC公司和HIR公司基因结合在一起，在碳酸钙Δ希尔2Δ双突变体和双突变体缺失的三突变体希尔1和HIR2型在30°C和37°C下均发现生长缺陷（图。​（图2B）。2B） ●●●●。计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变细胞的产生时间也比计算机辅助计算Δ或希尔Δ液体YPD培养基中的单个突变细胞。例如，碳酸钙Δ或希尔2Δ单突变菌株在30和37°C下每90至100分钟翻一番，而碳酸钙Δ希尔2Δ双突变体在30°C时的世代时间为125分钟，在37°C时为195分钟（表​（表2）。2). A类碳酸钙Δ希尔1Δ希尔2Δ三突变体的世代时间更长，在30°C下每225分钟加倍一次。也，计算机辅助计算Δ希尔四分体分离后，Δ菌落较小，包括在液体培养中，在30°C时菌落大小没有显著减小或倍增时间没有增加的双突变体（例如。，碳酸钙1Δ希尔1Δ突变体[图。2C] ）。相反，在任何一种基因的多个成员缺失时，都没有观察到小的四分体群体表型CAC公司或HIR公司基因家族（数据未显示）。

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图2

的生长缺陷计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体。将培养物划线到YPD平板上，以分配到单个菌落中，平板培养3-5天。（A）计算机辅助计算Δ希尔Δ应变在37°C下生长；（B） 三重和四重计算机辅助计算Δ希尔Δ缺失菌株在30和37°C下生长。使用的菌株为W303(HIR公司⁺ CAC公司⁺)，W303Δ1(希尔1Δ），W303Δ2(希尔2Δ），W303Δ1Δ2（FOA）(希尔1Δ希尔2Δ），PKY035(碳酸钙1Δ），PKY031(碳酸钙Δ），PKY034(碳酸钙Δ），PKY102(碳酸钙1Δ希尔1Δ），PKY103(碳酸钙Δ希尔1Δ），PKY132(碳酸钙Δ希尔1Δ），PKY136(碳酸钙1Δ希尔2Δ），PKY137(碳酸钙Δ希尔2Δ），PKY103(碳酸钙Δ希尔2Δ），PKY110(碳酸钙1Δ希尔1Δ希尔2Δ），PKY111(碳酸钙Δ希尔1Δ希尔2Δ）和PKY112(碳酸钙1Δ碳酸钙Δ希尔1Δ希尔2Δ). （C） 增长缓慢碳酸钙1Δ希尔1Δ萌发后的孢子。菌株PKY102(垫子αcac1Δ：：LEUZ hir1Δ：：HIS3)与PKY090配对(垫子一URA3公司-VIIL）。由此产生的二倍体被孢子化，四分体被解剖。在30°C的YPAD培养基上生长3天后，此处显示的活子代有两种大小。标记的评分显示所有较小的后代都是他的⁺卢⁺，表明他们碳酸钙1Δ希尔1Δ双突变体（数据未显示）。注意，大菌落与小菌落之比为3:1的完整四分体的数量低于四分体预期的2:3频率；这大概是因为CAC1公司染色体XVI着丝粒。

增长速度较慢的计算机辅助计算Δ希尔37°C下的Δ双突变体通常不是由细胞不可见引起的，因为除了一个例外，当在30和37°C的YPD培养基上培养时，双突变体同样具有活力（表​（表2）。2). 例外情况是碳酸钙Δ希尔2Δ双突变体，在37°C下表现出4到10倍的活力损失，但在30°C下没有。碳酸钙Δ希尔1Δ希尔2Δ三重突变体和碳酸钙1Δ碳酸钙Δ希尔1Δ希尔2然而，Δ四倍突变体不仅表现出非常小的菌落尺寸，而且在37°C时也降低了存活率（图。​（图2B）。2B） ●●●●。例如，>99%碳酸钙Δ希尔1Δ希尔2当在37°C下电镀时，Δ细胞是不可见的，尽管在30°C下镀时，三重突变体没有显示出活性丧失（表​（表22).

合成生长表型可能是因为计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体在组蛋白合成和/或染色质形成方面的缺陷比单突变体严重。为了测试第一种可能性，我们检查了计算机辅助计算Δ突变体显示组蛋白H2A1编码的适当转录调控HTA1型基因(60). 使用HTA1-lacZ公司报告基因，我们发现来自HTA1型无论是单启动子还是双启动子都没有改变计算机辅助计算Δ突变细胞：对HTA1-lacZ公司当HU阻断DNA合成或存在编码组蛋白H2A和H2B的额外基因拷贝时，报告基因被抑制的能力（未显示数据和参考文献43和60). 此外HTA1型报告基因在希尔Δ单个突变体和in计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体（数据未显示）。因此，CAF-I似乎没有规定HTA1型转录。

协同效应计算机辅助计算Δ和希尔端粒基因沉默的Δ突变。

测试计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体是由于染色质形成缺陷，我们首先分析了端粒染色质的结构和功能。在酿酒酵母端粒近端基因受到位置依赖性但基因依赖性沉默的影响，称为端粒位置效应（TPE）(11). TPE可以通过放置URA3公司端粒附近的基因；人群中对药物FOA（尿毒症的代谢毒物）有耐药性的细胞比例⁺单元格，表示URA3公司基因。在计算机辅助计算Δ突变体，TPE降低但未废除(9,28). 我们量化了计算机辅助计算Δ突变体，希尔Δ突变体，以及计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体。希尔1Δ突变体在TPE中无缺陷；事实上，这些菌株的TPE略有增加（图。​（图3A）。三A） ●●●●。希尔1Δ突变体与希尔2Δ或希尔3本试验中的Δ突变体（数据未显示）。相反，计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体的TPE水平比部分脱脂突变体低约3个数量级计算机辅助计算Δ突变体。这些协同作用在多个方面被观察到计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体组合：删除碳酸钙1Δ或碳酸钙Δ与任一希尔1Δ,希尔2Δ，或希尔3Δ给出了类似的结果，FOA抗性菌落的比例在10的范围内⁻⁴到10⁻⁵相对于野生型细胞（图。​（图3A三A和数据未显示）。碳酸钙Δ突变体的TPE缺陷比碳酸钙1Δ或碳酸钙Δ突变体(28)、和碳酸钙Δ希尔Δ双突变体的去表达量也略低于其他突变体计算机辅助计算Δ希尔Δ组合（数据未显示）。

这个希尔1,HIR2型、和HIR3型基因并不编码组蛋白基因转录的唯一调节因子。一些基因的突变改变了Ty转座子插入导致基因启动子无功能的转录起始位点（有关综述，请参阅参考文献77). 缺少这些基因的突变（称为标准贯入试验【Ty抑制基因】因此有一个Spt⁻功能转录起始位点通过Ty插入恢复到基因启动子的表型。的子集标准贯入试验突变体也有Hir⁻表型，因为它们不能抑制HTA1型HU处理后的转录；相反，希尔Δ突变也改变Ty转录，从而导致Spt⁻表型(59,64).标准贯入试验正常Hir所需的基因⁺表型包括SPT1型，它与HIR2型(59);SPT11标准和第12页，编码组蛋白H2A和H2B(三); 和SPT10标准和SPT21标准，这是转录HTA2-HTB2型和HHT2-HHF2型组蛋白基因对(5).

为了测试其他错误调节组蛋白基因表达的基因是否也影响TPE，我们测量了第21页Δ,计算机辅助计算Δ第21页Δ和希尔Δ第21页Δ应变（图。​（图3A三A和数据未显示）。在所有组合中第21页Δ缺失表现为希尔端粒基因沉默的Δ缺失。第21页Δ细胞具有接近野生型的TPE水平（TPE大约减少两倍可能是因为这种突变是多效性的，影响了大量位点的表达[44]). 结合第21页Δ和a希尔1Δ或希尔3Δ删除不会导致TPE的协同变化（图。​（图3A三A和未显示的数据），如以下组合所观察到的希尔Δ删除（数据未显示）。相反，计算机辅助计算Δ第21页Δ双突变体对TPE的抑制作用与计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体（图。​（图3A三A和数据未显示）。因此，这些数据扩展了我们的观察，即导致组蛋白合成失调的突变也会导致端粒沉默的显著减少计算机辅助计算Δ突变体。

协同效应计算机辅助计算Δ和希尔Δ突变HM公司基因沉默。

位置依赖性转录抑制HML公司和HMR公司的位置酿酒酵母确保只有一或α基因垫子基因座被表达；消音缺陷HML公司或HMR公司引起共表达一和同一细胞中的α基因，导致交配效率降低（有关综述，请参阅参考文献37). 尽管计算机辅助计算Δ突变体的交配效率与野生型细胞相同(9,28)（表​（表3），三)，我们问计算机辅助计算Δ和希尔Δ突变导致协同沉默缺陷HM公司基因座。我们量化了垫子一菌株作为α基因沉默的检测HML公司我们测量了同基因的交配垫子α菌株作为沉默一基因位于HMR公司如前所述，计算机辅助计算Δ或希尔Δ基因本身的缺失不会导致交配缺陷（表​（表3）。三). 然而，在垫子一计算机辅助计算Δ希尔Δ双突变体（例如。，碳酸钙Δ希尔3Δ[表三])，观察到交配减少了大约10倍，表明HML公司解除压力。这表明位置依赖性基因沉默的协同损失计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体并不局限于端粒近端基因。

沉默于HMR公司比在HML公司因为顺式-作用消声器HMR-E(37). 例如，碳酸钙Δ希尔3Δ突变体没有显示HMR公司通过配合检测的消声缺陷（表​（表3）。三). 然而，对于减少沉默的更敏感的分析HMR公司它依赖于沉默器内的突变或不同的报告基因，已经被开发出来。在一个案例中，发现替换一基因通常存在于HMR公司与ADE2型基因允许通过菌落颜色分析非常敏感地检测沉默的变化(68). 我们的菌株携带ade2-1在ADE2型导致腺嘌呤类培养基上出现红色菌落的基因座；这个HMR:：ADE2等位基因被大量抑制，使细胞呈粉红色。然而，顺式-或反式-减少沉默的作用突变会导致粉红色或白色部分或完全白色的菌落，因为ADE2型基因。我们发现了CAC公司基因缺失使菌株携带HMR:：ADE2等位基因：一种粉红色和白色的斑驳外观，在一个群体中可以明显地看到各种各样的粉红色阴影（在黑白照片中显示为一个混合了黑暗和光明的群体[图。三B] ）。这表明细胞在沉默和非沉默状态之间快速转换HMR:：ADE2在里面计算机辅助计算Δ突变体，与最近检测端粒和HML公司位点(8,42). 相反，希尔Δ突变体显示出与野生型细胞相同的均匀粉红色集落颜色（数据未显示）。计算机辅助计算Δ希尔ΔHMR:：ADE2突变体呈白色（图。​（图3B），三B） 表明这两种突变在HMR公司去抑制转录，正如我们在端粒和HML公司.

这个SIR1-4标准（对于沉默信息规则）基因对于在HM公司位点（有关综述，请参阅参考文献37). 删除其中一项SIR2型,瑞士证券交易所3，或SIR4公司导致在HM公司位点(55). 相反，在sir1突变细胞，HML公司沉默是有丝分裂亚稳态的，常驻基因的转录在抑制状态和激活状态之间切换，导致遗传上完全相同的细胞群，每个细胞都存在于两种表观遗传状态中的一种(51). 这一观察结果与SIR1公司基因是有效建立沉默状态所必需的HM公司基因座，通常出现在几乎每个细胞中。sir1细胞有轻微的交配缺陷(55)（表​（表3）。三). 然而，一些单独导致无交配缺陷的突变与sir1Δ突变（参见参考文献54). 因此，sir1Δ突变体为检测沉默缺陷提供了敏化背景HM公司基因座。

测试是否计算机辅助计算Δ或希尔Δ突变增强先生Δ交配缺陷，我们量化了包含所有可能组合的菌株的交配效率SIR1公司,CAC2公司、和HIR3型基因缺失（表​（表3）。三).垫子一sir1Δ希尔3Δ突变体的交配水平与sir1Δ单元。相反，垫子一sir1Δ碳酸钙Δ细胞的交配效率比垫子一sir1Δ单元格，表示CAC2公司在里面HM公司沉默不同于SIR1公司。在垫子αsir1Δ碳酸钙Δ细胞，可能是由于HMR公司一轨迹。在HML公司α英寸垫子一sir1Δ碳酸钙Δ希尔3Δ三突变体，其交配效率约为100倍垫子一sir1Δ碳酸钙Δ双突变体。这个sir1Δ碳酸钙Δ希尔3Δ组合也减弱了HMR公司一足以减少垫子α应变约为sir1Δ碳酸钙Δ突变体。确认在sir1Δ碳酸钙Δ希尔3Δ三重突变体是由于在HM公司基因座，而不是信息素信号通路的失活，我们测试了HML公司α将恢复交配。确实，删除HML公司恢复交配垫子一sir1Δ碳酸钙Δ希尔3Δ应变（图。​（图3C），三C） ，表明一α基因是三重突变体交配缺陷的原因。总之，这些数据表明CAC公司和HIR公司基因协同削弱端粒和HM公司基因座和CAC公司和HIR公司基因与SIR1公司.

端粒染色质结构缺陷。

酵母端粒和HM公司位点导致染色质结构的改变，这是由核酸酶和甲基化酶的保护增加所揭示的(10,36,61). 测试端粒基因沉默的减少是否计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体与染色质结构有关，我们在各种酵母菌株中表达了细菌dam甲基化酶基因，并用甲基化敏感限制性内切酶对这些菌株的DNA进行了消化测试（图。​（图4）。4). DNA与URA3公司DNA探针，可以识别这两个突变体乌拉3-1正常染色体位置的基因和URA3公司基因插入染色体VIIL端粒旁。图​图4A4A表示来自两个位点的预期DNA片段大小；之前的工作已经确定，GATC序列位于URA3公司野生型中的基因在很大程度上受到甲基化保护，但没有沉默信息调控因子2Δ突变细胞，缺乏端粒沉默(10,33). 通过限制性内切酶消化来检测该序列的甲基化酶通路Dpn公司一、 这需要GATC识别序列的甲基化。相反，Dpn公司II甲基化抑制GATC序列的消化。沙特GATC序列的3AI消化对dam甲基化不敏感，因此可作为消化的阳性对照。

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图4

dam甲基化酶对端粒染色质的可及性增加碳酸钙Δ希尔1Δ双突变体。（A） 的示意图URA3公司染色体VIIL端粒附近的基因[（TG）_n个]和乌拉3-1V号染色体自然位点的基因(33,78). 的限制站点欣dIII和5′-GATC-3′序列分别用H3和Sau表示。在野生型细胞中比在先生细胞以Sau*表示。预期的限制性片段（A、B、C和端粒片段T）如示意图所示。（B） 表达细菌大坝甲基化酶的菌株为PKY300(CAC公司⁺)，PKY299(碳酸钙1Δ），PKY305(碳酸钙Δ），PKY310(碳酸钙Δ希尔1Δ），PKY311(希尔1Δ）和AJL387-5aΔsir2(沉默信息调控因子2Δ). 在琼脂糖凝胶电泳和DNA杂交之前，用四种不同的限制性内切酶组合消化每个菌株的DNAURA3公司探查。从左到右显示每个菌株：消化欣dIII单独，消化欣dIII以上Dpn公司一、 用…消化欣dIII以上Dpn公司II、 用…消化欣dIII以上沙特3AI.“DpnI保护”表示总计数在欣dIII以上Dpn公司B限制性片段中存在I区，表明端粒URA3基因内的GATC位点受到了dam甲基化酶的保护。给出的值是来自两个独立实验的数据的平均值。

定量端粒甲基化酶可及性的一个方便指标是B带信号与端粒总信号的比值欣dIII-和Dpn公司I消化样品（图。​（图4A，4A、 每组四条中的第二条车道）；完全抵抗甲基化依赖酶的消化Dpn公司我在端粒内的GATC位点URA3公司基因将导致值为0.5，因为内源性乌拉3-1已知该基因座对甲基化酶是完全可接近的(33). 我们观察到野生型和沉默信息调控因子2Δ单元。在碳酸钙1Δ和碳酸钙Δ细胞，与野生型细胞相比，该比率分别下降至0.22和0.21。相比之下希尔1Δ细胞为0.40。因此，这些菌株中甲基化酶的进入程度与端粒沉默的强度具有相同的等级顺序。与此相关，我们观察到的比率为0.12碳酸钙Δ希尔1Δ单元，远低于观察到的值计算机辅助计算Δ电池，但不低于沉默信息调控因子2Δ单元。我们还用甲基化酶敏感酶消化DNA样本Dpn公司II（每个应变的第三条车道）。端粒位点C片段的释放，反映了对甲基化酶活性的保护，在cac2Δhir1Δ和沉默信息调控因子2Δ单元。我们还注意到，所分析的突变体中没有一个在端粒长度方面表现出实质性的变化，如标记为“T”的端粒片段在HindIII-digested样本中的迁移所示（每个菌株的第一条通道）。这些数据表明碳酸钙Δ希尔1Δ细胞在形成基因沉默所需的端粒染色质结构方面存在缺陷，但能够维持野生型端粒长度。

组蛋白基因拷贝数变化对端粒基因沉默的影响。

我们考虑了两类模型来解释染色质介导的基因沉默在计算机辅助计算Δ希尔Δ和计算机辅助计算Δ第21页Δ双突变体。首先HIR公司基因和SPT21标准可以编码在CAF-I部分冗余路径中起作用的染色体组装因子，因此在这两类基因突变之前，不会观察到严重的沉默缺陷。第二种可能性是计算机辅助计算Δ突变体对这些基因的丢失很敏感，因为在没有CAF-I的情况下运行的核小体组装途径对组蛋白水平的扰动本质上很敏感。两者都有希尔Δ和第21页Δ突变导致组蛋白合成的失调：四个组蛋白基因位点中有三个在希尔Δ突变体(48,65)，而组蛋白HTA2-HTB2型和HHT2-HHF2型基因对在第21页Δ突变体(5). 因此，尽管希尔Δ和第21页Δ突变导致组蛋白基因转录在相反方向上的错误调节，这两组突变都具有改变组蛋白水平的特性，在某些情况下，还具有组蛋白化学计量学的特性(59). 请注意，提出的两个模型并不相互排斥。

为了测试组蛋白水平对TPE的影响计算机辅助计算Δ突变体，我们进行了两种类型的实验。我们首先过度表达单个组蛋白基因对(HTA-HTB公司或HHT-HHF（小时-小时）)野生型和碳酸钙Δ细胞并测量转化物中的TPE（表​（表4）。4). Northern杂交显示，在野生型和碳酸钙Δ细胞（数据未显示），再次表明CAF-I不调节组蛋白基因表达。在野生型细胞中，四个组蛋白基因对中的任何一个的过度表达都会导致TPE水平相当于仅携带载体的对照菌株的TPE水平。如前所述，碳酸钙Δ突变体显示TPE水平降低(28)（图。​（图5A）。5A） ●●●●。与野生型细胞不同，端粒沉默碳酸钙Δ突变体增加或进一步减少取决于过度表达的组蛋白类型。组蛋白H2A和H2B的过度表达平均导致三倍(HTA2-HTB2型)或者八倍(HTA1-HTB1型)端粒沉默减少。相反，组蛋白H3和H4的过表达HHT-HHF（小时-小时）基因对导致沉默的三倍刺激。此外，所有四个核心组蛋白的过度表达（使用HHT1-HHF1型和HTA1-HTB1型基因对）同时导致沉默增强四倍以上碳酸钙Δ突变体，接近这些实验中野生型菌株的沉默水平。这些数据表明，在没有CAF-I的情况下，TPE对组蛋白水平的变化更为敏感。此外，H2A-H2B与H3-H4过度表达对TPE的相反影响是碳酸钙Δ突变体进一步表明，CAF-I非依赖性途径被改变的组蛋白化学计量学选择性干扰。

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图5

组蛋白基因剂量和表达的变化影响端粒基因沉默计算机辅助计算Δ突变，但在野生型细胞中没有。端粒沉默URA3公司-VIIL报告基因按照图图例所述进行测定。​图3。三对于每个菌株，对FOA（FOA）有抵抗力的活细胞比例^R（右）)归一化为野生型菌株的值；值的平均值n个显示了实验±标准偏差，除了hhf2型Δ碳酸钙Δ应变，给出了两个实验数据的平均值。（A） 组蛋白H3和H4基因缺失。菌株PKY090（野生型[wt]），PKY107(碳酸钙Δ），PKY408[（hht1-hf1）Δ]，PKY409[（hht1-hf1）Δ碳酸钙Δ]，PKY410[（小时2小时2小时）Δ]，PKY411[（小时2小时2小时）Δ碳酸钙Δ），PKY412(hhf2型Δ）和PKY413(hhf2型Δ碳酸钙Δ）。（B） 删除HTA2-HTB2型编码组蛋白H2A和H2B的基因对。菌株PKY090（wt）、PKY106(碳酸钙1Δ），PKY499[（hta2-htb2）Δ]和PKY500（hta2-htb2）Δ碳酸钙1使用Δ]。（C） 删除HTA1-HTB1型发起人。菌株PKY090（wt）、PKY106(碳酸钙1Δ），PKY581(HTA1型Δneg）和PKY582(HTA1型Δ负碳酸钙1Δ）。

我们还测试了组蛋白基因拷贝数减少对TPE的影响。编码组蛋白H3和H4的基因对缺失或只缺失HHF2型编码组蛋白H4的基因并没有减少野生型菌株的沉默（图。​（图5A）。5A） ●●●●。相比之下，任何组蛋白H3-H4缺失如果与碳酸钙Δ删除[在以下情况下约为100倍(hht1-hf1小时)Δ碳酸钙Δ与碳酸钙Δ]; 其他组合产生了更大的影响（图。​（图5A），5A） ，类似于在计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体（图。​（图3）。三). 尽管在计算机辅助计算Δ任一缺失的应变HIR公司或H3-H4基因，没有37°C的生长缺陷与H3-H4-缺失相关，即使与计算机辅助计算Δ删除（数据未显示）。我们还确定了删除组蛋白H2A和H2B编码基因对的效果。然而，删除HTA1-HTB1型基因对在我们的菌株背景中导致致死（数据未显示），尽管相同的缺失等位基因已被用于在其他背景中构建可行的单倍体菌株(17). 其他基因对缺失，HTA2-HTB2型在其他野生型细胞中，它不是致命的，并且对端粒沉默没有统计上的显著影响（图。​（图5B）。5B） ●●●●。端粒沉默（hta2-htb2）Δ碳酸钙1Δ双突变体平均略低于碳酸钙1Δ突变，尽管这些实验中的标准偏差是重叠的。然而，这可能低估了沉默缺陷，因为剩余的剂量补偿HTA1-HTB1型基因对(43). 总之，这些数据表明，在没有CAF-I的情况下，组蛋白H3-H4表达水平的降低对端粒沉默的影响最为显著，但在有CAF-I存在的情况下则没有。

的角色HIR公司通过调节组蛋白合成沉默基因。

为什么沉默计算机辅助计算Δ对缺失敏感的突变体HIR公司基因？一种可能的解释是，Hir蛋白和CAF-I在异染色质的形成中发挥了部分冗余作用，并且这两种因子的丢失是观察沉默显著减少所必需的。因为希尔Δ突变体错误调节酵母组蛋白基因子集的表达(48,60)，第二种假设提出，在没有CAF-I的情况下，改变核心组蛋白的绝对水平或相对化学计量将对基因沉默有害。

几行证据表明，第二个假设是正确的。端粒沉默计算机辅助计算编码组蛋白H3和H4的基因的缺失会强烈减少Δ突变体，但野生型细胞中没有。​（图5A）5A） 并因H2A-H2B过度表达而适度降低（表​（表4）。4). 相反，删除HTA2-HTB2型编码H2A-H2B的基因对对计算机辅助计算Δ突变体（图。​（图5B），5B） 和TPE碳酸钙组蛋白H3和H4的过度生产增加了Δ应变（表​（表4）。4). 因此，我们还建议删除SPT21标准，这是两个表达式所必需的HTA2-HTB2型和HHT2-HHF2型(5)导致端粒沉默的协同缺失计算机辅助计算Δ突变体，因为HHT2-HHF2型基因对（图。​（图3三).

总之，这些数据表明沉默计算机辅助计算Δ突变体对组蛋白的总体水平和相对化学计量都很敏感。我们认为这反映了另一种沉默途径对组蛋白水平改变的敏感性。当CAC公司基因是完整的，端粒或HM公司沉默，所以组蛋白基因表达的改变对异染色质的形成几乎没有影响。然而，在计算机辅助计算Δ突变体，该途径在沉默中发挥着重要作用，并且很容易受到组蛋白水平或化学计量变化的干扰。因为已知人类CAF-I是组蛋白H3-H4结合和沉积因子(63,74,75)，我们期望冗余酵母途径也发挥这一功能。当组蛋白H3和H4的细胞水平低于某一阈值时HHT-HHF（小时-小时）或SPT21标准基因缺失时，该途径的功能似乎无效，类似于底物浓度远低于K（K）_米值。注意组蛋白H3和H4在计算机辅助计算Δ突变体略微改善了TPE，与假定的备用通路功能的改善一致（表​（表4）。4). 相反，组蛋白H2A和H2B在计算机辅助计算Δ突变进一步降低了端粒沉默（表​（表4）。4). 我们建议通过隔离未组装的（H3-H4）来实现这一点₂四聚体，因为H3-H4的共过量表达抑制了这种表型。组蛋白化学计量的改变也被证明会降低有丝分裂染色体的稳定性(40). 在这种情况下，H2A-H2B或H3-H4的过度生产导致染色体丢失增加，但所有四个核心组蛋白的同时过度生产并没有增加。这表明组蛋白的化学计量，但不一定是组蛋白的绝对水平，对防止染色体丢失很重要。相反，在没有CAF-I的情况下，异染色质的形成对H3-H4水平和四个核心组蛋白的化学计量都很敏感。即使在组蛋白基因表达异常的细胞中，CAF-I也能确保异染色质的形成。

我们的数据也与以下可能性相一致：CAF-I非依赖性沉默途径不是由组装蛋白介导的，组蛋白能够在DNA上正确组装，前提是它们的浓度足够高。虽然我们目前不能排除这种可能性，但我们并不赞成，因为对几种生物体的研究发现，未组装的组蛋白与其他蛋白质复合，包括与组蛋白沉积在DNA上有关的因素(2,4,20,31,75).

中的全局缺陷计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体。

除了减少异色基因沉默外CAC公司和HIR公司这些基因揭示了其他表型，表明CAF-I和Hir蛋白在染色体上具有更大的作用。计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体在30°C时表现出生长缺陷，在两个高温度（37°C）下都加剧了生长缺陷[图。2; 表​表2）2)以及低（16°C[数据未显示]）温度。组蛋白H3-H4基因对缺失与计算机辅助计算Δ突变（数据未显示），表明计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体既没有引起也没有引起异色沉默的丧失。此外，删除希尔1和HIR2型基因计算机辅助计算Δ突变体增加了30℃下的世代时间，降低了37℃下的生存能力（表​（表2）。2). 因为组蛋白基因不再被释放希尔1Δ希尔2Δ双突变体比相应的单突变体(58)这表明，合成生长表型并不仅仅是组蛋白基因表达变化的结果，尽管可能无法检测到组蛋白水平的细微影响。

异染色质的形成不需要酵母的活力；沉默信息调控因子2,sir3、和sir4型突变体完全缺乏端粒和HM公司消音(1,55)并具有野生型增长率(第54页; 另请参阅参考46). 因此，在计算机辅助计算Δ希尔Δ突变体表明染色体中存在更广泛的缺陷。这些生长表型是否由基因表达改变、染色体结构缺陷或两者兼而有之引起，尚待确定。全球缺陷也与数据一致，数据表明计算机辅助计算Δ和希尔Δ突变导致Ty转座率的协同刺激(52).

我们感谢考夫曼和奥斯利实验室的成员以及D.deBruin、R.Bacon、A.Dillin和S.Okamura对手稿的批判性审查；S.Liebman和J.Berman在出版前就结果进行沟通；J.Boeke、J.Haber、M.Grunstein、A.Lustig、J.Rine和F.Winston的菌株和质粒；和J.Chuang提供了出色的技术援助。

这项工作得到了能源部授予P.D.K.的资金支持，并根据合同DE-AC03-76SF00098通过劳伦斯伯克利国家实验室进行管理，还得到了国家卫生研究院授予的GM55712（授予P.D.K）和GM40118（授予M.A.O.）资金的支持。