自然。 作者手稿； PMC 2009年9月16日发布。
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PMCID公司： 下午2744094
NIHMSID公司： 美国国家卫生研究院130723
微RNA对蛋白质输出的影响 , 1, 2, * , 三， * , 1, 2, * , 1 , 三 和 1, 2
大云白 1 美国马萨诸塞州剑桥市剑桥中心9号怀特海生物医学研究所，邮编：02142
2 美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学院和生物系，邮编：02139
朱迪特·维伦 三 美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院龙伍德大道240号细胞生物学系，邮编：02115
Chanseok Shin先生 1 美国马萨诸塞州剑桥市剑桥中心9号怀特海生物医学研究所，邮编：02142
2 美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学院和生物系，邮编：02139
费尔南多·卡马戈 1 怀特黑德生物医学研究所，9剑桥中心，剑桥，马萨诸塞州，02142，美国
史蒂芬·P·吉吉 三 美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院龙伍德大道240号细胞生物学系，邮编：02115
大卫·P·巴特尔 1 美国马萨诸塞州剑桥市剑桥中心9号怀特海生物医学研究所，邮编：02142
2 美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学院和生物系，邮编：02139
1 美国马萨诸塞州剑桥市剑桥中心9号怀特海生物医学研究所，邮编：02142
2 美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学院和生物系，邮编：02139
三 美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院龙伍德大道240号细胞生物学系，邮编：02115
* 这些作者为这项工作做出了同等贡献。
作者贡献 前三位作者的排列顺序是任意的。 C.S.和F.C.对细胞和动物进行了实验研究。 J.V.进行了质谱分析和相关计算分析。 D.B.进行了靶向的计算分析。 所有作者都为研究的设计和手稿的准备做出了贡献。
补充资料 补充1。
编号：1241B0BA-B08A-4B68-80DF-93BC8F063ABD
补充2。
GUID:8E56AA8C-E32A-489B-85AB-3B84E7617D03
补充3。
GUID:15065389-6B90-44DD-A511-645A89F6471C
摘要 微RNA是内源性～23-核苷酸RNA，可与蛋白质编码基因信使RNA中的位点配对，以下调这些信息的表达。 众所周知，微RNA会影响许多mRNA的进化和稳定性，但它们对蛋白质输出的全球影响尚未得到研究。 在这里，我们使用定量质谱法来测量数千种蛋白质在将microRNA引入培养细胞和删除microRNA后的反应 mir-223型 在小鼠中性粒细胞中。 反应蛋白的一致性表明，靶向主要是通过位于3′非翻译区有利预测上下文中的种子匹配位点。 数百个基因被单个microRNAs直接抑制，尽管每个基因都有一定程度的抑制。 虽然一些靶点被抑制而没有检测到mRNA水平的变化，但那些被翻译抑制三分之一以上的靶点也表现出可检测到的mRNA失稳，并且对于受抑制程度较高的靶点，mRNA失稳定通常是抑制的主要成分。 微RNA对蛋白质组的影响表明，在大多数相互作用中，微RNA充当变阻器，对蛋白质输出进行精细调整。
研究microRNAs（miRNAs）调节作用的大规模方法揭示了对目标识别和功能的重要见解。 这些方法包括在进化过程中选择性维持或避免miRNA互补位点的计算分析 1 - 8 以及在存在miRNA的情况下，对不稳定或优先与argonaute蛋白相关的信息进行实验性鉴定 7 - 15 尽管它们很有用，但没有一种方法可以直接测量miRNA对蛋白质输出的影响，而蛋白质输出是其调节作用的最相关读数。 相反，miRNAs对蛋白质输出的影响仅限于单一蛋白质分析，主要是免疫印迹和报告分析，以及检测504个蛋白质的中型蛋白质组学分析 16 .
添加miRNAs的蛋白质组学后果 为了获得足够的数据来研究miRNA调节对蛋白质组的影响，我们使用SILAC（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）应用了基于定量质谱的方法 17 研究特异性miRNAs对许多蛋白质水平的影响( 补充图1和2 ). 我们首先测量了将miR-124（一种脑特异性miRNA）引入HeLa细胞的效果。 为了包括广泛表达谱中的蛋白质，本实验重点关注核定位蛋白质。 在检测到的2120个蛋白质中，分析考虑了1544个映射到我们的非冗余mRNA数据集，并且每个蛋白质都通过至少两个独立的测量值进行了量化，这些测量值都超过了我们的质量阈值( 补充数据1 和5）。
因为本次和所有后续的SILAC分析都是用两个技术复制品进行的，并且因为来自相同蛋白质的不同肽和来自相同肽的不同电荷状态也提供了独立测量的机会， 大多数蛋白质通过两次以上的独立测量进行定量（1544个定量蛋白质的中位数为12）。 比较技术复制品和比较代表相同蛋白质的不同肽时的高再现性说明了定量准确性( 第页 2 Spearman相关系数分别为0.72和0.65； 补充图3 ).
与模拟转染对照组相比，降低幅度最大的蛋白质的信息与其他量化蛋白质的信息（截止值，第85百分位）进行比较，寻找在其开放阅读框（ORF）或非翻译区域（UTR）中过度表达的基序。 当考虑所有16384个可能的7-核苷酸基序和mRNA的不同区域时，Bonferroni校正多假设检验后唯一显著富集的是G 无人值守地面控制单元 3′UTR中的七核苷酸( P（P） < 10 -7个 ，费希尔精确测试）。 这个七核苷酸基序包含与miR-124种子的6核苷酸匹配（带下划线），并辅以与miRNA核苷酸8的匹配，被命名为7mer-m8种子匹配位点( ). 引入miR-124后，与失稳消息的3′UTR最相关的是同一个基序（参考文献。 9 ). 其他与miRNA导入后的优先保护和mRNA失稳相关的位点被命名为6mer、7mer-A1和8mer种子匹配位点 2 , 7 , 8 ( ). 对种子匹配位点的更直接搜索显示，大多数被强烈抑制的蛋白质来自至少有一个7-8mer 3′-UTR位点的信息( ). 例如，在被至少50%抑制的40种蛋白质中，有24种至少有一个7-8mer 3′-UTR位点，其中只有3种是偶然的( ，压制切断50%）。 较不严格的阻遏截断从含有7-8肽位点的信息中产生了许多额外的蛋白质，即使是在减去了那些偶然出现的蛋白质之后。 下调蛋白信息中种子匹配位点的总体富集表明，miR-124对mRNA的识别用于抑制蛋白输出，比3′UTR中任何其他类型的种子匹配位点都要多。
转染miRNAs对蛋白质输出的影响 一 ，典型miRNA种子匹配位点 2 . b条 ，来自具有miR-124 3′-UTR位点的信息的受抑制蛋白质的比例（填充橙色条）。 在每个阻遏截止点，使用来自没有3′-UTR位点的消息的被阻遏蛋白的数量（在开条中显示）来计算偶然出现位点的额外部分（虚线，虚线下方显示相应的被阻拦蛋白数量）。 虚线上方是从带有位点的信息中获得的被抑制蛋白质的剩余数量。 c ，单个miR-124 3′-UTR位点信息的蛋白质反应。 标绘的是蛋白质部分，其变化至少达到 x个 轴。 不考虑来自具有多个3′-UTR位点的信息的蛋白质。 属于较大位点的6mer位点不包括在6mer分布中，属于8mer的7mer位点也不包括在7mer分布内。 d日 ，当汇集miR-124、miR-1和miR-181转染数据时，单个3′-UTR位点的疗效，如图所示 c . e（电子） ORF和3′-UTR靶向疗效。 绘出的是ORF中至少含有一个8mer的消息中定量蛋白质的蛋白质和相应mRNA的平均变化（±标准误差）( n个 =83）或3′UTR( n个 =87）对应于转染的miRNA（不包括ORF和3′UTR位点的信息）。
为了调查不同种子匹配位点的功效，我们绘制了具有单一位点的3′UTR信息中蛋白质的反应( ). 与没有3′-UTR位点的信息相比，来自具有单一7-8肽位点的信息的蛋白质有显著的下调倾向( P（P） =0.02、0.0008和0.02，分别适用于8mer、7mer-m8和7mer-A1，Kolmogorov-Smirnov试验）。
我们用另外两种miRNA进行了类似的SILAC实验：miR-1和miR-181，分别有2312和1774个蛋白质映射到我们的非冗余mRNA数据集，并通过了我们的定量质量截止值( 补充数据2 、3和5）。 与大多数下调蛋白的信息相关的基序与miR-124中观察到的基序相一致； 对于miR-1，7mer-m8匹配是下调蛋白3′UTR中最有把握富集的庚核苷酸基序( P（P） =0.0004），对于miR-181，7mer-A1匹配是前两个基序之一( P（P） =0.007），与不相关的基序CUGCCCC相比，略微缺乏自信( 对 =0.006，Fisher精确测试（带Bonferroni校正）。
当汇集所有三个miRNA转染的数据，从而结合5630个独立的蛋白质定量时，来自与同源miRNA匹配的单个7mer或8mer位点的信息的蛋白质有显著的下调趋势( , P（P） < 10 -14 总的来说， P（P） < 10 -4 对于每个现场，分别进行Kolmogorov-Smirnov测试）。 从no-site分布的垂直位移表明，来自具有单个7-8mer 3′-UTR位点的信息的至少16%的蛋白质对miRNA有反应( ). 蛋白质对带有6聚体位点的信息的反应与无位点信息的反应密切相关，这表明在这个系统中，6聚体识别通常不足以检测到蛋白质的下调( ).
对位点保守性、位点耗竭、argonaute下拉和报告分析的分析都表明，靶向可能发生在蛋白质编码区 2 , 5 , 13 , 18 对信使核糖核酸不稳定的分析一致认为靶向发生在编码区，但表明这些位点通常比3′UTR中的位点有效得多 7 然而，如果与mRNA失稳相比，这些位点由于落入核糖体路径，对翻译产生不成比例的影响，那么监测mRNA失稳定将低估编码区中位点的影响。 为了解决这种可能性，我们检查了监控蛋白质输出的数据，发现编码区的位点通常不如UTR中的位点有效( ).
干扰的蛋白质组学后果 mir-223型 测量异位miRNA添加的影响可以为miRNA靶点识别提供一般性见解，但反应蛋白不一定是内源性靶点，mRNA和蛋白质变化的幅度和动力学预计与内源性靶向的变化不匹配（补充讨论）。 为了获得与内源性miRNA-靶相互作用相关的数据，以及抑制程度的相关信息，我们检测了 mir-223型 小鼠中性粒细胞的基因敲除。 mir-223型 优先在髓系造血细胞中表达，在中性粒细胞及其祖细胞中高表达 19 , 20 为了获得适合定量蛋白质组学实验的标记样品，我们从野生型和 mir-223型 -缺陷小鼠 21 并制定了在SILAC培养基中增殖并分化为成熟中性粒细胞的方案 在体外 ( 和 补充图4a、b ). 到第8天，存活的细胞已经从在SILAC培养基存在下经历多次细胞分裂的祖细胞中下降( 补充图4c )导致重同位素掺入>99%。 RNA印迹证实，祖细胞和分化中性粒细胞均表达 mir-223型 ( ). 阵列实验表明，miR-223对同源位点信息的影响与直接从小鼠分离的中性粒细胞的作用类似，尽管有点弱( )可能部分是因为中性粒细胞分化 在体外 累积～35%少miR-223( ).
删除的蛋白质组影响 mir-223型 小鼠中性粒细胞 一 ，中性粒细胞标记和分析示意图。 造血祖细胞是从野生型（WT）或 mir-223型 -/Y（Y） （KO）雄性小鼠，在含有粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和干细胞因子（SCF）的SILAC培养基中培养6天。 为了增强分化，在接下来的42小时内提取SCF。混合成熟的中性粒细胞，并对蛋白质进行分级以进行定量MS分析。 还从培养物和直接从小鼠中收集mRNA用于表达谱分析。 b条 , mir-223型 用RNA印迹探针检测miR-223的表达。 一个印迹分析了来自培养的细胞的分类亚群的总RNA 在体外 （左，排序配置文件显示在最左侧）。 另一个杂交分析了培养细胞的总RNA 在体外 8天，从骨髓中直接分离出的中性粒细胞（右）。 作为负荷控制，对U6小核RNA进行了重复印迹。每个印迹下面是相对表达水平，使用负荷控制进行了标准化。 还显示了放射性标记的RNA标记（M）。 c ，直接从小鼠分离的中性粒细胞分析（左） 在体外 从造血前体细胞（右），监测miR-223缺失对其3′UTR中具有单个miR-222位点的信息的影响。 Plotted是至少更改到 x个 轴，否则如 . d日 ，来自miR-223 7-8分子3′-UTR位点信息的上调蛋白的比例，如图所示 . e（电子） ，删除的影响 mir-223型 在中性粒细胞蛋白质上，考虑到来自消息的蛋白质在其3′UTR中具有单个miR-223位点，如图所示 . （f） ，ORF的靶向功效( n个 =69）和3′UTR( n个 =50），按 . 克 ，单个7-8个位点和多个位点的疗效，如图所示 （f） .
核和细胞质组分的质谱分析为5019个蛋白质提供了定量信息，其中3819个蛋白质映射到我们的mRNA数据集，并通过了我们的质量截止值（补充数据4和5）。 去除内源性miR-223对中性粒细胞蛋白水平的影响基本上与体外添加单个miRNAs时观察到的影响相反，但更多的靶向趋势具有统计学意义，可能是因为量化了更多的蛋白质。 例如，来自消息的去压制蛋白在3′UTR（但不是5′UTR或编码区）中对6-8 mer种子匹配基序具有强富集性，即使在Bonferroni校正后，对所有四种位点类型都具有高置信度( 补充表1 ). 具有3′-UTR位点的信息中响应蛋白的比例( )与异位miR-124递送相似( ). 来自具有单个7-8聚体位点的信息的蛋白质往往被去压制( , P（P） < 10 -5 , P（P） < 10 -6 和 P（P） < 10 -4 分别用于8mer、7mer-m8和7mer-A1，Kolmogorov-Smirnov试验）。 监测蛋白质输出时观察到的部位功效的明显层次( ，8mer>7mer-m8>7mer-A1>6mer）与监测mRNA效应时获得的结果相匹配 7 , 8 再次观察到适度ORF靶向的证据( ). 来自具有多个位点的信息的33个量化蛋白质往往更具响应性( )但增加的产量并没有超过每个独立经营场所的预期产量。 这种独立的、非合作的反应与mRNA失稳监测和报告者分析的结果一致，这表明位点的合作作用往往只发生在相互间位于8-40个核苷酸范围内的位点上 7 总之，我们的结果通过实验证明，从异位添加的miRNA中阐明的靶向原理也适用于内源性miRNA靶向，特别是在蛋白质下调水平上的内源性靶向。
预测miRNA靶点的内源性反应 内生目标的扰动提供了测试目标预测集的机会。 考虑miRBase目标的当前预测时 22 ，米兰达 23 , 24 、PicTar 4 , 25 、PITA 26 和TargetScan 2 , 7 所有这些方法都将场地保护作为预测标准，而TargetScan和PicTar的方法表现最好( ). TargetScan和PicTar的预测主要是哺乳动物中至少有一个3′-UTR7-8mer位点保守的信息，操作上定义为保存在人类、小鼠、大鼠和狗UTR同源位置的位点 2 , 4 。与任何3′-UTR 7-8分子位点的消息集相比，它们的增强性能表明，考虑站点保护不仅丰富了具有假定功能作用的位点，也丰富了那些更有效的位点。 所有其他算法都包括许多与种子至少有一个不匹配或抖动的站点，这似乎已经影响了它们的性能。 例如，miRBase Targets的预测是使用miRanda算法生成的 23 使用更新的参数，搜索具有更严格的种子配对但仍允许一个失配或摆动到种子的保守位点 22 。对种子匹配和种子不匹配预测的分析表明，在寻找遗址保护过程中获得的任何益处都被许多表现不佳的预测与种子不匹配所抵消( 补充图5a ). 尽管TargetScan和PicTar相对成功，但三分之二的预测靶点似乎对中性粒细胞中miR-223的丢失没有反应，这表明在根据miRNA靶点的机会守恒估计推断的范围内存在假阳性率( 补充图5b ).
计算目标预测与观察到的蛋白质变化之间的对应关系 使用转染数据集观察到类似的结果( 补充图8 ). 一 、执行考虑场地保护的计划。 标绘的是具有≥1个保守或非保守7-8mer 3′-UTR位点（灰色）的基因和预测为miR-223靶基因的平均蛋白去表达（±标准误差）。 括号中是每组定量蛋白质的数量。 b条 ，与miRNA第一个核苷酸相反的腺苷（A）的识别。miR-181转染后蛋白质变化的累积图将来自没有种子匹配的3′-UTR位点的消息的蛋白质与来自具有指示的单个3′-UTR位点的消息的蛋白质进行比较。 c 、预测靶点得分与蛋白质去抑制的关系。 根据预测质量或抑制程度的建议分数，将对应于量化蛋白质的预测分为三个大小相等的箱子。 最后三分之一和前三分之一之间的统计显著差异被指出（星号， P（P） <0.01，曼希特尼 U型 -测试）。 d日 ，每个算法前29个预测的响应，如所示 一 . e（电子） ，执行不考虑场地保护的程序，如所示 一 和 c 还显示了仅包含非服务7-8聚体3′-UTR位点的消息中量化蛋白质的响应，并通过总上下文得分进行了分类。
PicTar和TargetScan在以U开头的miR-223中的性能与预期类似，但对于那些不以U开头、TargetScen在位置1的对面奖励a的miRNAs可能没有预期到这两种算法 三 , 27 )在此位置奖励Watson-Crick比赛。 因此，对于以A、C或G开头的miRNAs，两个庚核苷酸匹配中只有一个（7mer-m8）与算法相同 2 , 4 并且因此预计大约一半的预测目标是不同的。 为了研究哪种类型的庚核苷酸匹配与蛋白质输出减少最相关，我们检查了转染miR-181实验的蛋白质组学数据，这不是从U。 绘制单位点信息的蛋白质反应图显示，7mer-A1匹配比Watson-Crick 1-7匹配更有效( , P（P） =0.009，Kolmogorov-Smirnov试验）。 此外，沃森-克里克1-7比赛的效果并不比位置1对面G或C不匹配的6人场地好( ). 我们的结论是，从miRNA核苷酸1中识别出A，有利于miRNA-介导的蛋白质下调，这解释了A在此位置的优先保守性，即使它不能参与Watson-Crick相互作用 2 .
目标预测集通常会进行排名，并断言得分越高的预测越有可能真实或有效。 最近的TargetScan预测（第4版）根据“总上下文得分”进行排名，该得分基于站点类型、站点编号和站点上下文 7 这一排名与蛋白质下调相关，排名前三的人比排名后三的人反应更灵敏( ). 对于其他算法，得分在前三分之一的预测并没有比得分在后三分之一中的预测更具响应性( , P（P） >0.05，曼希特尼 U型 -测试）。 尽管整体性能较差，但当仅考虑其前几项预测时，更具包容性的算法可能仍然有用。 为了研究这种可能性，我们只考虑了每种算法的前29个预测，选择了29个，因为最严格的集合（PicTar的集合）包括了这个数量的预测。 在这个严格的截止点，更具包容性的算法的性能接近PicTar（导致差异不再具有统计意义， P（P） >0.05），但仍低于TargetScan( P（P） < 0.05, ). 有趣的是，仅根据3′UTR的总上下文得分排名的前29个量化蛋白质，在不考虑位点保守性的情况下，至少与前29个TargetScan预测的反应相同( ).
对miRNAs进化影响的分析和对miRNA缺乏动物上调信息的分析都表明，许多非服务位点介导了抑制作用 体内 5 , 6 , 10 , 11 我们还发现了天然miR-223靶相互作用中广泛存在的非靶向性靶向性的证据。 为了预测非服务目标，RNA22（参考。 28 )以及更宽松的PITA版本 26 不要考虑场地保护。 当使用我们的miR-223数据进行评估时，这些算法的性能并不比简单搜索具有7-8个seed-matched站点的消息好( ). 一个更有效的工具是总上下文得分，当只考虑那些非服务7-8分子位点（即人类、大鼠或狗3′UTR的直系位置缺失或突变的位点）的信息时，总上下文得分与去表达相关，非服务预测的前三分之一明显比后三分之一更有效( ). 事实上，排名前三的非公开预测( ，上下文得分）似乎与保守预测中的后三分之二有效( ，TargetScan），并且由于来自非服务预测的蛋白质数量比来自保守预测的蛋白质多6比1，因此具有良好上下文评分的非服务预测是生物目标的丰富来源。
在对保守预测和非保守预测进行排名时，总上下文得分的成功部分归功于其对站点类型的考虑( )以及站点数量( ). 为了分离其第三组分（位点上下文），我们只考虑了那些来自具有单个7mer-m8 3′-UTR位点的信息的量化蛋白质，并且仍然观察到上下文评分与蛋白质反应之间的显著相关性( P（P） =0.001，斯皮尔曼相关检验）。 据报道，预测的3′-UTR结构和场地环境的其他特征会影响场地可及性和疗效 7 , 8 , 26 , 27 , 29 - 31 上下文评分结合了其中一些特征，包括较高的局部AU核苷酸组成（解释了预测的3′-UTR结构对位点可及性的影响），接近可与miRNA核苷酸13-16配对的残基，以及远离长UTR中心的位置 7 如mRNA失稳数据分析所预期 7 ，最有影响的成分是局部AU成分，当分离检测时，其与蛋白质反应显著相关( P（P） =0.01，斯皮尔曼相关检验）。
蛋白质与mRNA的反应比较 由于以前使用的高通量方法无法确定蛋白质阻遏的数量，因此在miRNA-介导的调控过程中，mRNA失稳和翻译阻遏相对的贡献一直备受关注。 我们的miR-223数据为解决这一问题提供了信息，因为它在mRNA和蛋白质水平上检测了去除内源性miRNA的反应，而没有受到由外源性miRNA介导的外源性靶向的混淆影响。 我们的miR-223系统的接近稳态性质也避免了瞬时转染固有的定量警告， 例如可变的转染效率和前稳态复杂度，在比较mRNA和蛋白质对mRNA的影响时尤其明显，因为信息及其蛋白质可能具有非常不同的内在稳定性。 注意，我们的mRNA量化使用标准阵列平台，其中包括检测期间的寡核苷酸（dT）启动，因此我们观察到的mRNA失稳包括将消息转换为不适合翻译的形式，因为它缺少聚（a）尾。
为了在对单个蛋白质的分析中实现更高的量化准确性，我们将重点缩小到2773个蛋白质，这些蛋白质通过≥6个独立测量进行量化。 将蛋白质变化绘制为mRNA变化的函数表明，与7mer或8mer 3′-UTR位点的信息具有很强的正相关性( ; 第页 2 =0.45和0.63， P（P） < 10 -33 和 对 < 10 -12 （分别是），而对于没有站点的消息，相关性较弱( ; 第页 2 = 0.15, P（P） < 10 -11 皮尔逊相关检验）。 两个图中的蛋白质在原点周围都有一些分散； 然而，当对没有站点的消息进行标准化时，由于miR-223的丢失，更多来自有站点消息的消息的数量增加了( 和 补充图6 ). 免疫印迹法检测三种反应性更强的蛋白质，证实在 mir-223型 -/Y（Y） 中性粒细胞分化 在体外 以及直接从小鼠中分离出来的那些( 补充图7 ).
miR-223缺失时蛋白质和mRNA变化的比较 一 ，定量蛋白质的蛋白质和mRNA变化来自至少有一个8 mer 3′-UTR位点（蓝色， n个 =55）或至少一个7mer（橙色，额外250个蛋白质）。 图中显示了最适合第8个月数据的最小二乘法（蓝线），以及斜率均为1.0的参考线（灰色）。 垂直误差条表示蛋白质变化独立测量的第25和75个百分位。 水平误差条表示三个生物复制品的mRNA变化的标准误差，其中一个也用于SILAC实验。 b条 ，来自无7-8mer 3′-UTR位点信息的定量蛋白质的蛋白质和mRNA变化，如图所示 一 这里绘制了七个随机队列中的一个； 其他六个在 补充图6 . c 根据培养的中性粒细胞的阵列信号，所示参考mRNA和定量蛋白在mRNA表达方面的分布。 d日 定量蛋白质及其各自的mRNA对 mir-223型 删除，考虑到那些具有7-8分子3′-UTR位点的信息，按mRNA表达分组。
三种反应最灵敏的蛋白质中的两种来源于单一、非服务的7分子信息( )-网站本身不会做出如此有力的回应。 先前的研究表明，位于共同表达miRNAs位点的8-40个核苷酸内的位点通常协同作用，这增加了特定位点失去相互作用的影响 7 我们进行高通量测序，以确定培养的中性粒细胞中共同表达的miRNAs( 补充表2 )并发现这两个高度反应的7mer都接近与共表达miRNA相匹配的位点，位点间距有利于协同反应( ). 中的站点 Ctsl公司 位于miR-26家族的一个位点附近，五个家族中有一个的测序频率高于miR-223，而该位点位于 Gns公司 落在miR-103/107家族的一个位点附近，测序频率约为miR-223的三分之一( 补充表2 ).
表1 来自具有至少一个7-8 mer 3′-UTR位点的信息的最敏感蛋白质
蛋白质 * 折叠更改（原木 2 )英寸 mir-223型 -/Y（Y） 细胞与野生型 折叠更改（原木 2 )中性粒细胞分化过程中mRNA的表达 † 3′-UTR站点 共表达miRNA家族 ‡ 具有协作间隔的站点 中性粒细胞培养（8天） 分类培养细胞 蛋白质（第25-75个百分位数） mRNA（±标准误差） 前体mRNA 中性粒细胞mRNA Ctsl公司 § 2.40 (2.18-2.80) 1.21 ± 0.07 0.79 1.03 1.71 7个月 miR-26，8个月 第9部分 § 1.99 (1.80-2.06) 1.20 ± 0.05 0.43 1.07 1.55 8个月 Gns公司 1.47（1.43-2.19） 1.07 60.04 0.51 1.01 1.30 7个月 miR-103/107，7个月 ∥ 拉萨1 1.06（0.87-1.18） 0.56 ± 0.12 0.27 0.62 -0.22 8个月 ∥ Acsl3公司 § 1.04 (0.92-1.56) 0.37 ± 0.19 0.44 0.50 -1.49 8个月 ¶ 免疫球蛋白1r § 0.94（0.78-1.06） 0.22 ± 0.13 0.01 -0.03 0.03 8个月 ∥ ，7个月 高尔特7 0.87 (0.58-1.06) 0.91 ± 0.14 0.40 0.89 -0.15 8个月、7个月 miR-103/107，7个月 ∥ Myo1c公司 § 0.85 (0.64-1.02) 0.20 ± 0.07 0.40 0.29 0.55 7个月 Gm885型 0.81 (0.76-0.88) 0.52 ± 0.03 0.07 0.27 1.63 7个月 涂抹1 0.74 (0.53-0.94) 0.50 ± 0.09 0.24 0.41 -0.11 8百万 ∥ 最有价值球员 0.73 (0.63-0.82) 0.60 ± 0.01 0.25 0.48 2.07 7个月 1110019N10瑞克 0.73 (0.28-1.05) 0.84 ± 0.07 0.66 0.88 -0.61 7个月 Ipo9公司 0.71 (0.65-0.88) 0.28 ± 0.10 0.19 0.33 -0.72 7个月，7个月 Ctsz公司 0.71 (0.65-0.81) 0.42 ± 0.09 0.41 0.70 -0.26 7个月 miR-27，7个月 第2b1页 0.67 (0.51-0.83) 0.32 ± 0.14 -0.01 -0.01 0.71 8月1日 Prkcb1型 0.66 (0.54-0.76) 0.57 ± 0.09 -0.47 0.37 2.97 7个月，7个月 卢比2 0.64（0.61-0.70） 0.56 ± 0.01 0.30 0.60 -0.49 8个月 miR-27，7个月 安克尔13a 0.64 (0.58-0.87) 0.29 ± 0.08 0.10 0.23 0.05 7个月 尤哈（Ywhah） 0.61 (0.39-0.66) 0.44 ± 0.03 0.14 0.56 0.33 8个月 miR-142-5p，7个月 ∥
如果蛋白质的变化仅仅反映了mRNA的变化，在翻译水平上没有额外的抑制，那么这些点就会落在对角线上( ，灰线）。 尽管许多都在对角线上或非常接近对角线，但最小二乘线性回归得出的结果是正的 年 -截距（7mer和8mer数据分别为+0.053和+0.079）。 这些适度但在统计上显著阳性 年 -截距值( P（P） =0.0002和 P（P） = 0.042, t吨 -test）表明，一组基因在蛋白质水平上被适度释放，而在mRNA水平上几乎没有变化。 这些基因的信息都是仅在翻译水平上受影响的靶点的良好候选，尽管一些可能来自于经历非miRNA-介导的转录抑制的基因，作为对miR-223靶点丢失的补偿反馈反应。
尽管有证据表明存在一些仅翻译抑制，但所有蛋白质的去抑制率都超过50%（log 2 >0.58）来自显示可检测到的增加的消息( 和 ). 此外，只有5个点超过0.58个单位（log 2 )对角线以上( ，上部虚线； ，用§）表示。 请注意，miR-223对野生型中性粒细胞的33%抑制相当于50%（+0.58 log 2 )突变中性粒细胞的去表达。 因此，在野生型中性粒细胞中，来自7-8聚体3′-UTR位点信息的305个量化蛋白中，只有5个出现了超过33%的翻译抑制。 我们的结论是，尽管在某些情况下，翻译抑制产生大量内源性miRNA-介导的抑制，但在许多推测的靶点中，这一现象发生得出奇的少。 实质性翻译抑制很少出现，因为仅在翻译水平被抑制的目标被适度抑制（<33%）； 对于受到更强烈抑制的靶点，抑制的主要成分通常是mRNA失稳( ). 需要进一步的研究来确定那些经历miRNA-介导阻遏的mRNA分子是否会经历翻译阻遏，作为失稳的前奏，但我们的结果表明，mRNA失稳可以解释大多数内源性miR-223介导的阻遏。
我们的蛋白质组学数据仅限于可靠量化的蛋白质，预计这些蛋白质在中性粒细胞中可溶且高表达。 为了考虑表达偏差可能对我们的结果产生的影响，我们绘制了mRNA的分布图，并根据中性粒细胞中mRNA表达的功能量化了蛋白质，同时考虑了我们非冗余数据集中的所有mRNA（包括那些未检测到表达的）以及那些具有3′-UTR位点的mRNA( ). 具有保守或非保守3′-UTR位点的信息显示了完整的表达值范围，分布与更普遍的信息相匹配。 正如预期的那样，更多量化的蛋白质来自高度表达的信息( ). 然而，来自带有位点（保守或非保守）的消息的量化蛋白质的分布与那些没有位点的消息的分布紧密匹配。 此外，我们没有发现任何证据表明，来自更高表达信息的蛋白质的更大代表性代表了miRNA对蛋白质输出的影响； 如果有什么不同的话，来自高表达信息的蛋白质往往比来自低表达信息的蛋白反应更强烈( ). 利用基因本体术语进行分析 32 得出类似结论（数据未显示）。 因此，尽管我们的实验仅监测了对中性粒细胞蛋白质组的一部分的影响，因此错过了许多miR-223靶点（包括一些保守靶点，如Mef2c；参考文献 2 , 21 )，我们没有理由怀疑未检测到的目标反应更为强烈。
来自最不丰富的mRNA的蛋白质似乎对未检测到的mRNA变化作出反应( ，≤6.5箱）。 翻译成分的明显优势可能是这些消息的不太可靠的阵列信号的结果，其中许多属于未按下消息的背景信号。 一个更有趣的可能性是，这些信息的高效翻译（根据从这些低表达信息中量化蛋白质的能力推断）使它们更容易受到更大的翻译抑制。
miR-223的调节功能 miR-223位点信息中的一些最强烈的去表达蛋白为观察到的促炎症表型提供了潜在的解释 mir-223型 -/Y（Y） 中性白细胞 21 组织蛋白酶L和组织蛋白酶Z（Ctsl和Ctsz，在 )半胱氨酸蛋白酶是否与慢性炎症有关，在慢性炎症中它们可以作为组织破坏的介质 33 , 34 另一个潜在的相关靶点，胰岛素样生长因子受体1（Igf1r，排名第六），对成熟中性粒细胞的启动和激活至关重要 35 , 36 .
为了检查抑制是否在中性粒细胞成熟之前开始，我们分析了分选的祖细胞和中性粒细胞中的mRNA水平（补充数据4）。 大多数高反应蛋白的信息在祖细胞阶段就已经被释放了，尽管通常比中性粒细胞的程度更低，中性粒细胞积累了更多的miR-223( 和 ).
miR-223缺陷祖细胞和中性粒细胞的特征提供了一个机会，可以在没有miR-222的情况下检查假定的miR-223靶点的调节，以确定miR-223-mediated阻遏是否主要与作用于这些基因的其他基因调节过程一致（即，方向相同）。 在从祖细胞向中性粒细胞分化的过程中，假定的靶点数量增加或减少( 和补充数据4）。 这一结果揭示了非相干调控关系的比例大于其他miRNA的比例 5 , 6 , 11 但与miR-223功能丧失表型一致； 这种表型表明miR-223抑制祖细胞增殖和中性粒细胞分化及活化 21 -与预期的一致调节相互作用相反的功能，涉及中性粒细胞中优先表达的miRNA。
由于miR-223蛋白质组学实验检测到其他高通量方法可能会遗漏靶向性，特别是在翻译水平上受影响（尽管适度）的非靶向性靶点，因此它提供了迄今为止内源性miRNA靶向性的范围和大小的最清晰图像。 从中的no-site分布的垂直位移 表明，来自7-8mer 3′-UTR种子匹配位点的426个蛋白质中，至少有18.4%的蛋白质输出因这些位点而增加，因此3819个量化蛋白质中至少有78个蛋白质的信息是直接靶点。 这78种蛋白质中，约33%来自具有保守3′-UTR位点的信息，约16%来自具有非保守3′-UTR位点的信息。 假设只有约三分之一的蛋白质组被量化，我们估计miR-223在中性粒细胞（3×78）中有>200个靶点。 这些不包括任何进行故障安全调节的靶点（针对中性粒细胞中通常不表达的蛋白质的信息），这些靶点在去抑制实验中是不可见的。 尽管miR-223的靶向范围很广，但即使在蛋白质水平上观察到，每一种相互作用也只有适度的效果。 许多miR-223应答靶点也有其他miRNAs的位点，其中一些也在中性粒细胞中表达，因此，miRNAs对这些靶点的总影响可能大于仅观察到的miR-223。 尽管如此，其他miRNAs的靶向作用预计不会掩盖去除miR-223的效果，因为多个非重叠位点共同表达的miRNAs通常独立作用 7 , 8 ，在极少数情况下，它们不是独立作用的，而是协同作用的，这将增强而不是减少失去单个miRNA的影响 7 内源性miR-223介导的阻遏作用范围广泛，但幅度较低，表明这种miRNA经常充当调节蛋白质输出的变阻器。
方法总结 HeLa细胞在含有常规（轻）Lys和Arg或 13 C类 6 -用miRNA转染标记的（重）Lys和Arg.轻细胞，模拟转染重细胞。 24小时后，采集一些细胞进行mRNA表达谱分析。 48小时后，收集剩余的细胞，将两个群体中相同数量的细胞混合并富集可溶性核蛋白。 中性粒细胞培养如 通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物，并用胰蛋白酶消化级分。 通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析肽，鉴定肽并量化同一肽的同位素对的相对数量。 为了防止任何靶向相互作用的重复计算，肽被映射到非冗余互补DNA数据集（补充数据5），靶向分析与之前对mRNA失稳数据进行的一样 7 为了与目标预测算法进行比较，TargetScan（4.1版）的预测 2 , 7 、PicTar（人类、黑猩猩、老鼠、老鼠、狗） 4 , 25 ，miRanda（2008年1月发布） 23 , 24 ，miRBase目标（版本5） 22 ，RNA22（参考。 28 )和PITA 26 使用截至2008年3月公开的最新预测，从各自的网站上获得。
致谢 我们感谢S.-J.Hong、T.Brummelkamp和S.Stehling-Sun的讨论，感谢C.Bakalarski编写并实现了用于自动蛋白质定量的Vista算法，感谢W.Johnston的技术援助，感谢P.Wisniewski的细胞分类。 这项研究得到了Damon Runyon博士后奖学金（C.S.）和NIH（D.P.B和S.P.G）的资助。 D.P.B.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
附录 方法
转染实验 HeLa细胞（ATCC，CCL-2）在补充有Pro（10 mg l）的SILAC DMEM培养基（Invitrogen）中生长 -1 )并且含有天然存在的Arg和Lys同位素（50 mg l -1 每个）或重型( 13 C类 6 )-标记的精氨酸和赖氨酸（50 mg l -1 剑桥同位素实验室）。 通过质谱分析蛋白质中的重同位素掺入（>99%Arg，>98.5 Lys）。 在重氨基酸中生长的细胞用脂质体2000（Invitrogen）进行模拟转染，而在轻氨基酸中培养的细胞则用前面描述的miRNA双工体进行转染 7 , 9 使用脂质体2000，25 nM双链，并补充OPTI-MEM（Invitrogen）。 6小时后，用SILAC DMEM替换模拟和miRNA转染的培养基。 转染24小时后，收获一些细胞，并纯化mRNA（RNeasy Plus，Qiagen）用于表达谱分析（安捷伦人类4×44K微阵列）。 转染48小时后，收集剩余细胞，混合等量的miRNA和模拟转染细胞。 纯化可溶性核蛋白（NEPER核和细胞质提取试剂，Thermo Fisher Scientific），并通过SDS-PAGE分离成十个组分，用于质谱分析。
作为靶向特异性的额外控制，重复分析转染结果，比较带有位点的信息中的蛋白质对同源miRNA的反应与转染非同源miRNA时相同蛋白质的反应。 这组对照分析的总体结论与所提供的分析相同，表明结果取决于转染的miRNA的特性，而不是模拟和miRNA转染细胞之间的其他差异，例如转染中氨基酸的质量或OPTI-MEM的存在。
中性粒细胞培养和分化 所有动物实验都得到了麻省理工学院动物护理委员会的批准。 骨髓取自三只3个月龄野生型雄性小鼠和三只3月龄小鼠 密尔-223 -/Y（Y） 老鼠 21 ，骨髓造血祖细胞分离如下。 收集每种基因型的三只小鼠的骨髓，并使用生物素结合Ter 119、Mac-1、Gr-1、B220和CD3e抗体（eBioscience）和抗生物素微球（Miltenyi Biotech，Inc.）的混合物去除悬浮细胞中的成熟细胞，然后进行磁细胞分选（MACS，Miltenyi-Biotech公司）。 收集剩余细胞，并在补充有Pro（10 mg l）的SILAC IMDM培养基（Invitrogen）中培养 -1 )并含有G-CSF（100 ng ml -1 和SCF（50 ng ml -1 （PeproTech）。 含有轻精氨酸和赖氨酸的培养基（50 mg l -1 每个）用于来自野生型小鼠的细胞，以及含有 13 C类 6 -Arg和 13 C类 6 -赖氨酸（50毫克升 -1 每个）用于 密尔-223 敲除细胞。 每两天更换一次培养基，六天后取出SCF以阻止增殖并诱导额外分化。 42小时后，收集细胞，并去除死细胞（死细胞去除试剂盒，Miltenyi Biotech）。 用PE结合抗鼠c-Kit抗体（eBioscience）、APC结合抗鼠Gr-1抗体（eBioscience）和碘化丙啶染色后，通过流式细胞术（FACSCalibur，BD Bioscienses）分析中性粒细胞成熟度和存活率( 补充图4a ). 在对中性粒细胞进行Wright-Giemsa染色后，通过显微镜检查细胞群的均匀性( 补充图4b ). 质谱证实，在培养自miR-223缺陷小鼠的细胞中，重精氨酸和赖氨酸几乎定量（>99%）掺入。
每个细胞群的一部分用于纯化mRNA（RNeasy Plus，Qiagen）以进行表达谱分析（Affymetrix小鼠430 2.0微阵列， ). 混合来自每个群体的等量细胞，用SDS-PAGE分离可溶性核蛋白和细胞质蛋白制剂，并用LC-MS/MS进行独立分析。其他生物复制品（每个复制品从额外一到四只小鼠的骨髓开始） 从野生型和敲除小鼠中制备，并用于mRNA表达谱分析、RNA印迹和免疫印迹。 使用FACSAria（BD Biosciences）和PE结合的c-Kit抗体和APC结合的Gr1抗体对这些额外的复制品进行分类，以生成用于监测miR-223表达的亚群( )，用于监测额外培养后的命运( 补充图4c )和用于mRNA分析( 和补充数据4）。 为了进行比较，使用生物素缀合的Gr-1抗体和MACS（每个生物复制汇集来自三只小鼠的细胞）直接从野生型和突变小鼠中分离的中性粒细胞，使用表达谱、RNA印迹和免疫印迹进行检测。
质谱分析 蛋白质（50μg）被还原（在50 mM碳酸氢铵中5 mM DTT，pH 8.2，56°C，30 min）和烷基化（15 mM碘乙酰胺，在室温20-22°C，25 min，黑暗中50 mM碳酸氢铵中），然后通过SDS-PAGE分离成10个组分（HeLa样品）或16个组分。 用胰蛋白酶（5 ngμl）对每个组分进行凝胶内消化 -1 在pH 8.2的50 mM碳酸氢铵中，37°C，16 h）。 在50%乙腈（ACN）和5%甲酸（FA）中提取肽，然后干燥并通过反相脱盐（C18 StageTip）。 将肽混合物重新悬浮在5%ACN和4%FA中，并用LC-MS/MS对每种混合物的20%进行两次分析。 在装有C18反相材料（Magic C18AQ，5μm颗粒，200μm孔径，Michrome Bioresources）的微毛细管（125μm×17 cm）柱中，在0.1%FA中以7%至30%ACN的55min梯度分离肽，并在混合线性离子阱轨道器（LTQOrbitrap，ThermoElectron）上在线分析 质谱仪。 对于每个循环，以高质量分辨率（400时为60000）采集一次全质谱扫描 米/z ，AGC目标=1×10 6 轨道探测器分析仪中的最大离子注入时间=1000 ms），然后是线性离子阱上的10 ms/ms光谱（AGC靶=5×10 三 ，最大离子注入时间=120 ms）。 在35 s内动态地将碎片化前体离子排除在进一步选择之外。如果离子的电荷小于2或未分配，则也将其排除在外。
蛋白质数据库搜索和肽量化 使用Sequest算法根据IPI蛋白质序列数据库搜索MS/MS光谱。 使用target-decoy数据库策略，并使用质量偏差（以p.p.m.为单位）、Sequest Xcorr和dCn得分作为过滤器，将肽匹配筛选为<1%的假发现率，并排除同时含有Lys和Arg残基的重版本和轻版本的序列。 使用内部Vista软件定量肽 37 , 38 通过峰面积积分，计算重/轻肽比值。 在为每种蛋白质保留的一组独立测量值中，重/轻比率的中位数被定义为蛋白质折叠变化( 补充数据1 -4). 质量截止值如下：所有测量均要求Vista置信分数≥75，信噪比( 序号 )≥6.0，其中 序号 参数计算为 序号 沉重 和 序号 灯光 .仅用一种肽量化的蛋白质的测量需要通过更严格的 序号 截止10.0。 对于用多肽定量的蛋白质，单个肽的独立测量不允许超过独立测量总数的一半 序号 ); 这确保了对一个以上肽的测量会影响中位数。
为了将蛋白质折叠变化与我们的参考cDNA集联系起来，IPI数据库中蛋白质的基因组坐标 39 需要蛋白质基因组坐标和参考cDNA之间≥50个核苷酸重叠。 为了校正重和轻群体的整体位移（可能是由细胞混合稍不均匀引起的），我们鉴定了来自没有6-8分子种子匹配的3′-UTR位点的信息的蛋白质子集，计算了重峰和轻峰的中位数差异， 并通过此差异抵消所有fold-changes（包括来自带有站点的消息的fold-cranges）。 这种标准化导致我们报告的没有种子匹配位点的蛋白质折叠变化分布集中在零。
非冗余5′-UTR、ORF或3′-UTR序列的cDNA数据集 我们从RefSeq中获得了人类全长cDNA 40 和H邀请赛 41 数据库，并将其与人类基因组进行比对 39 使用BLAT 42 如前所述，富集功能性cDNA 43 丢弃那些没有内含子的，以及那些比对质量低、与人类基因组多重高得分匹配、过早终止密码子或不完整编码序列的。 如果cDNA具有重叠的3′UTR，则选择从RefSeq数据库获得的cDNA。 如果保留一个以上的cDNA，则保留具有最长3′UTR的cDNA。 由此产生的非冗余cDNA集被指定为“参考cDNA”（补充数据5）。 如果单个基因的3′UTR的基因组坐标彼此不重叠，则允许使用多个参考cDNA。 然而，在分析ORF或5′UTR中的位点时，仅从RefSeq cDNA中任意选择一个cDNA来表示该基因，以防止重复计算单个位点的贡献。 使用相同的标准选择一个唯一的参考cDNA来匹配每个定量蛋白质。 为了搜索miRNA种子匹配位点，使用参考cDNA的基因组序列（去掉内含子）代替cDNA序列本身。 对来自RefSeq和FANTOM DB的小鼠全长cDNA重复类似程序 44 数据库，与小鼠基因组对齐（补充数据5）。
微阵列数据处理 使用BLAT将安捷伦4×44K微阵列的60个核苷酸探针序列与人类基因组对齐。删除任何与人类基因组不完全匹配或多个完全匹配的探针。 安捷伦特征提取软件产生的mRNA折叠变化和相应的错误通过类似于前面描述的SILAC数据的方法与我们的参考cDNA集相关联( 补充数据1 -3). 类似地，来自Affymetrix小鼠430 2.0微阵列的一组探针“一致序列”与小鼠基因组对齐。 任何BLAT比对得分<100或与基因组有多个高分匹配的探针共有序列（即，其与基因组的前两个比对在同一性百分比上的差异<1%）都被删除。 对于每个探针一致序列，野生型和 mir-223型 -/Y（Y） 使用RMAExpress软件对来自多个芯片的表达数据进行分位数规范化后，计算其标准误差 45 （补充数据4）。 当将安捷伦探针和Affymetrix探针共识序列映射到我们的参考cDNA集时，探针和参考cDNA之间的基因组坐标需要重叠≥15个核苷酸。
目标站点分析的注意事项 根据累积分布计算对miRNA作出反应的最小基因比例，确定分布之间的最大累积差异，并校正分布颠簸，如前所述 7 为了防止少数异常值的不当影响，在计算平均对数变化之前，将折叠变化截断为±2.0。 为了评估人类参考cDNA的序列保守性，从UCSC基因组生物信息学站点获得的28条脊椎动物基因组比对（与人类基因组比对）中提取了人类、小鼠、大鼠和狗的比对 46 。如果在其他三个基因组的同源位置也发现了一个位点，则该位点被认为是保守的，允许该位点的水平位移（由假定的人工制品或比对中的模糊性引起），前提是两个比对列（每列为比对中一个位置的宽度） 四个物种的位置都重叠。 类似地，从30个脊椎动物基因组比对（与小鼠基因组比对）中提取出四个哺乳动物序列，以评估小鼠参考cDNA的序列保守性，并确定保守的靶点。
目标预测工具比较 TargetScan预测的miRNA靶点列表（4.1版） 2 , 7 、PicTar（人类、黑猩猩、老鼠、老鼠、狗） 4 , 25 ，miRanda（2008年1月发布） 23 , 24 ，miRBase目标（版本5） 22 ，RNA22（参考。 28 )和PITA 26 使用截至2008年3月公开的最新预测，从各自的网站上获得。 其中大多数包括基因符号、全长cDNA的序列鉴定和/或分数。 为了将这些预测映射到人类或小鼠基因组，从UCSC基因组生物信息学站点获得RefSeq、Ensembl和UCSC基因的基因组比对 46 ，并使用了每个预测工具的最具信息量的比对集。 为了防止重复计数，对具有多个冗余预测的基因任意选择单个预测。
Small-RNA测序、RNA印迹和蛋白质印迹 小RNA在Solexa平台上使用修改过的协议进行测序 47 .RNA印迹分析了每道5μg总RNA，并使用碳二亚胺介导的膜交联 48 使用以下抗体稀释液检测蛋白质印迹：抗Cstl山羊单克隆抗体（R&D系统），1:1600； 抗Igf1r兔多克隆抗体（圣克鲁斯生物技术），1:1000； 抗Cbx5（HP-1α）小鼠单克隆抗体（Millipore），1:2500； 抗肌动蛋白小鼠单克隆抗体（Abcam），1:25000； 和抗肌动蛋白兔多克隆抗体（细胞信号），1:10000。
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