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RNA。2007年8月；13(8): 1198–1204.
doi（操作界面）：10.1261/rna.563707
预防性维修识别码：项目编号1924889
PMID：17592038

miRNP免疫纯化法分离microRNA靶点

乔治·伊索， 奥雷里奥·泰勒曼，和史蒂芬·M·科恩
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

microRNAs（miRNAs）通过引导效应复合物（miRNPs）靶向RNA，充当基因表达的转录后调节器。虽然在识别miRNA靶点的计算方法方面取得了相当大的进展，但对其体内功能的评估相对有限。在这里，我们描述了一种基于生化方法的miRNA靶点识别的替代方法，该方法用于纯化miRNP与相关miRNAs和结合mRNA靶点的复合物。微阵列分析显示miRNP相关mRNA的3′UTR中miRNA互补位点高度富集。通过比较野生型苍蝇和缺乏miRNP的突变苍蝇中的miRNP-相关mRNA，鉴定出与单个miRNA特异相关的mRNAmiR-1，miRNA对它们的调控得到了验证。这种方法提供了一种基于体内物理相互作用来识别功能性miRNA靶点的方法。

关键词：果蝇属、RISC、Argonaute、AGO1

简介

最近，microRNAs（miRNAs）被认为是转录后水平基因表达的重要调节因子。miRNAs作为引导分子，将miRNP效应复合物（包括精氨酸）和多种其他蛋白质招募到目标RNA中(Hutvagner和Zamore 2002;Zamore和Haley 2005). miRNP关联可导致翻译抑制、mRNA不稳定或mRNA断裂（有关综述，请参阅巴特尔2004;Jackson和Standart 2007;Wang等人，2007年). 在植物中，miRNAs与其靶mRNAs具有广泛的互补性并介导分裂；而在动物中，它们的互补性通常是有限的，信使核糖核酸的翻译被阻断(Du和Zamore 2005;Pillai等人，2005年;Schwab等人，2005年;Jones-Rhoades等人，2006年;Zhang等人，2007年). 尽管动物miRNAs很少进行位点特异性切割，但miRNP结合可导致靶mRNA的死亡和失稳(Giraldez等人，2006年;Wu等人，2006年).

了解miRNAs生物学作用的一种方法是确定其靶点。对miRNA靶标关系的实验分析表明，miRNA只需要有限的配对就可以实现调控(Doench和Sharp 2004;Kiriakidou等人，2004年;Brennecke等人，2005年). 各种各样的计算方法，有些基于实验验证的miRNA靶对的规则，已经成功地预测了miRNA靶关系(Grun等人，2005年;Krek等人，2005年;Lewis等人，2005年;Robins等人，2005年;Stark等人，2005年;Xie等人，2005;Lall等人，2006年). 然而，关于可能影响体内靶位点功能的因素，还有很多需要了解（最近的综述，请参阅拉杰夫斯基2006).

虽然siRNA-介导的靶裂解与含Ago蛋白复合物与靶mRNA的短暂结合相容，但miRNA-中介导的翻译抑制可能依赖于miRNP与靶mRNA之间的稳定物理结合。这为利用这种相互作用识别体内发生的miRNA靶相互作用提供了可能性。在此，我们提出了一种基于miRNA与含精氨酸蛋白miRNP中miRNA的物理关联来识别miRNA靶点的方法，并表明该方法可以用于识别新的miRNA靶。

结果和讨论

这两个果蝇属精氨酸蛋白具有不同的功能，Ago1在miRNA-介导的翻译抑制中发挥作用，Ago2特别参与mi/siRNA介导的靶mRNA的切割(Okamura等人，2004年;Behm-Ansmant等人，2006年;Rehwinkel等人，2006年). 我们在Ago1蛋白的N末端引入了一个FLAG标签和一个HA表位标签(Meister等人，2005年)并产生稳定转化的施耐德SL2（S2）细胞系，表达该蛋白和转基因果蝇属菌株。标记的Ago1蛋白的功能通过使用该转基因来完全挽救前1突变株，从而用表位标记版本替换内源性Ago1蛋白（数据未显示）。

用抗HA抗体对含有Ago1的蛋白质复合物进行免疫纯化(图1A). 免疫印迹分析免疫沉淀物的蛋白质含量表明Ago1得到纯化，miRNP复合体中不存在的蛋白质（如微管蛋白）被耗尽(图1B). Northern blot分析显示，在标记的Ago1表达细胞的纯化组分中存在成熟形式的miR-2b和bantam miRNAs，但在未转染对照细胞的纯化样品中没有(图1C). 纯化组分中未回收相应的前miRNA。因此，免疫纯化的Ago1复合物含有成熟的miRNAs。为了询问这些复合物是否也含有miRNA相关的靶RNA，我们进行了定量RT-PCR以比较来自S2细胞的已知miRNA靶的水平，收割机(Stark等人，2003年)S2细胞表达的mRNA CG1969不是S2细胞中表达的miRNAs的预测靶点。收割机与对照免疫沉淀相比，从Ago1免疫沉淀中提取的总RNA中增加了mRNA，但CG1969没有(图1D，级别标准化为rp49）。这些数据表明，在纯化的Ago1复合物中，mRNAs可以通过与miRNAs的结合而得到富集。

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miRNP复合物纯化。(一个)净化方案示意图。F/H-dAgo1表示果蝇属Ago1蛋白在N末端标记有一个FLAG表位和一个HA表位。虽然Ago-1结构中包含了两个表位标签，但我们发现，使用两步纯化法，含Ago复合物和miRNAs的特异性富集没有显著改善。(B类)免疫印迹法显示F/H-dAgo1纯化。标记为+的通道包含来自稳定转染表达F/H-dAgo1的细胞的样本。标有−的通道包含来自未转染S2细胞的样本。输入和洗脱液样品来自同一凝胶，但未显示中间通道。首先用抗HA探针检测印迹，然后用抗微管蛋白重复印迹。(C类)Northern blot检测以可视化矮脚鸡miRNA和miR-2b。Ago1表示F/H-dAgo1转染细胞的洗脱液；cont.表示未转染细胞的洗脱液。(D类)定量RT-PCR检测收割机洗脱液部分中的（rpr）和CG1969 mRNA，归一化为rp49。“1”和“2”是独立的提纯。

然后用Ago1纯化的总RNA来探测cDNA微阵列，以评估miRNP-相关mRNA库的复杂性。分析来自Ago1转染细胞和未转染对照细胞的三种独立纯化的RNA样品。每一种都与0至24小时胚胎总RNA的参考样品进行比较。与对照组相比，89个RNA在Ago1样品中表现出可重复的富集，表明该方法持续纯化细胞mRNA的一个子集（补充表S1）。先前的研究表明，miRNA 5′端的序列是靶向特异性的主要决定因素(Lewis等人，2003年，2005;Doench和Sharp 2004;Brennecke等人，2005年;Grun等人，2005年). 为了评估观察到的89个mRNA的富集是否可以归因于与miRNAs的关联，我们搜索了与果蝇属miRNA。

比较免疫纯化mRNA集和整个转录组的UTR的每千碱基3′UTR序列的miRNA种子匹配数。该比率提供了一个浓缩值，用于校正整个UTR长度和整个数据集中种子匹配的频率。值为1表示序列在实验数据集中的表示频率与在整个转录组中的表示频率相同。补充图S1A中提供了整套miRNA的富集值。我们选择关注少量miRNAs，其富集度大于2，并且在S2细胞中表达(图2A). miR-184在S2细胞中高度表达，与其种子区互补的序列在富集的mRNA中的表达高于其在整个细胞中的表达果蝇属转录组。尽管在整个mRNA数据集中可以看到miR-184种子匹配的双重富集，但如果分析仅限于3′UTR，则富集程度要高得多。在miR-7和miR-314中观察到UTR位点的类似富集模式。miR-1在S2细胞中不表达，用作对照。miR-1互补序列未发现富集。在对完整miRNA集的分析中，miR-124非常突出，因为尽管在S2细胞中不表达，但它仍会发出富集信号。在这种情况下，富集信号可归因于具有miR-184位点的五个UTR中的三个UTR中miR-124位点的共存（补充图S1B）。

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Ago1免疫沉淀物中miRNA种子互补序列的富集。(一个，顶部)Northern印迹检测S2细胞总RNA中的miR-1、miR-184、miR-7和miR-314。(底部)与Ago1免疫纯化的信使RNA中所示miRNAs的2-8位互补的7聚体序列的相对富集。mRNA表示在整个转录本中发现的序列匹配。ORF表示在编码序列中找到的匹配项。UTR表示在3′UTR中发现的序列匹配。丰度标准化为mRNA、ORF和UTR数据集中序列的总出现频率。(B类，顶部)CG5704和CG1857 ORF中预测的miR-184位点(顶部，链mRNA；底部，链miR-184）。箭头表示突变结构中的残基发生改变，以中断与miR-184的配对，同时保留mRNA中的ORF。野生型和突变型CG5704和CG1857的ORF是用萤火虫荧光素酶在框架中克隆的。(底部)荧光素酶分析比较内源性miR-184对转染表达ORF-荧光素素酶融合蛋白的S2细胞的调节。将级别标准化为野生型构造。突变体结构中活性升高表明miR-184介导的抑制作用减轻。(C类)用于调节报告构建体的萤光素酶测定，如左边miR-278。SV40和扩展表示3′UTR的起源。彩色箭头表示引入的miR-278位点。盒子位于正确的显示这些位点：“ex”表示扩增的3′UTR中的内源性miR-278位点；黑色三角形显示合成miR-278；绿色和红色三角形表示荧光素酶ORF的改变，以产生与miR-278种子区域匹配的位点。

我们注意到一些已知在S2细胞中表达的miRNAs未能给出明确的富集信号。由于富集信号反映了纯化组中有一个位点的mRNA的出现，而不是整个转录组中的频率，因此对mRNA的丢失非常敏感。例如，由于与miRNP的不稳定结合而导致的靶RNA的丢失可能会导致信号的丢失，即使其他靶被回收。低目标RNA水平，可能是由于miRNP关联导致的低内源性表达或目标RNA的不稳定，可能会使其难以检测，导致即使存在富集信号也会丢失。这些观察结果表明，虽然该方法可能无法捕获所有miRNA靶关联，但捕获稳定的一个子集可能是有用的。

虽然3′UTR位点似乎对大多数观察到的富集有贡献，但一些miR-184相关的mRNA在编码区有位点。先前的研究表明，miRNAs有可能作用于mRNA编码区的靶位点(Lewis等人，2005年;Nakamoto等人，2005年). 为了询问潜在的miR-184 ORF位点是否有助于调控，我们选择了两个缺乏3′UTR位点的mRNA进行进一步分析(图2B). 利用萤火虫荧光素酶在框架内克隆了CG5704和CG1857 mRNA的ORF。在类似的结构中，假定靶位点中的两个C残基被改变为G，从而在破坏miR-184种子的互补性的同时维持ORF(图2B). 这些结构在S2细胞中表达，并与雷尼利亚测定荧光素酶对照和标准化荧光素酶水平。在这两种情况下，种子互补性的破坏导致荧光素酶活性适度但可复制的增加。这表明编码序列中的位点可以参与体内miRNA-介导的调控。然而，ORF位点的有限富集总体上表明，与位于3′UTR的位点相比，它们对mRNAs与miRNP关联的贡献较小。

为了进一步探索编码序列中位点的功能潜力，我们基于实验验证的miR-278靶点构建了一系列荧光素酶报告子扩大(Teleman等人，2006年). miR-278的单个位点是在荧光素酶的ORF中产生的，通过改变摆动位置同时保留荧光素酶的编码序列。可能有两个这样的位点，在miR-278存在的情况下引入一个（结构2）或两个（结构3）的荧光素酶活性略有降低(图2C). 当置于3′UTR（结构体5和6）的环境中时，这些位点是活跃的，产生与最佳miR-278位点（结构体4）相似的抑制作用。同样，对于含有扩增的3′UTR的荧光素酶构建物（具有内源性miR-278位点），向荧光素酶ORF添加位点没有影响（构建物7-9）。这些观察结果表明，编码区中的miRNA位点可以进行调控，但与3′UTR中的位点所进行的调控相比，它们的作用微乎其微。因此，我们所有的进一步分析都集中在3′UTR位点上。

接下来，我们评估了表达一种新的miRNA对S2细胞中与Ago1相关的靶RNA谱的影响。通过将表达载体瞬时转染到S2细胞中表达miR-1，S2细胞被选为稳定表达F/H-Ago1的细胞(图3A，左）。Ago1纯化后进行微阵列分析显示，与未转染Ago1表达细胞相比，miR-1转染的F/H-Ago1细胞中miR-1互补序列的富集倍数为3倍(图3A，右侧），而S2细胞的整体富集情况相对不变（补充图S2）。例如，没有发现与另一个miRNA miR-92b互补的序列富集，该miRNA在S2细胞中不表达。这表明miR-1在S2细胞中表达时被并入含Ago1的复合物中，并且能够通过免疫纯化富集潜在的miR-1靶RNA。

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通过添加或删除miR-1改变Ago1-associated RNA的结构。(一个，左边)Northern blot比较未转染（−）和转染（+）S2细胞中miR-1的表达。(对)与Ago1共纯化RNA中miR-1或miR-92b的2-8位互补的7聚体序列的富集。(B类)在与对照组或miR-1型突变胚胎。miR-1（1）表示位置1-7的互补性；mir-1（2）至位置2-8。GU（#）表示序列与所示位置的GU碱基对匹配。

为了研究体内耗尽miRNA对Ago1相关mRNA谱的影响，我们使用表达表位标记的Ago1转基因的转基因果蝇，并将其引入miR-1突变背景(Sokol和Ambros 2005). 通过与Ago1结合在18至24小时对照组和miR-1型对突变胚胎进行了比较。微阵列分析显示，来自表达Ago1的对照胚胎的免疫纯化mRNAs的3′UTR中，与miR-1种子互补的6和7聚体序列富集，而来自表达Ago 1的对照胚的免疫纯化的mRNAs3′UTRs中没有富集miR-1型突变胚胎(图3B; 补充表S2）。在免疫纯化样品中差异回收的108个mRNA中，32个与miR-1的位置2-7或3-8有6个单体种子匹配，这与之前的证据一致，即位置2-8是miRNA特异性的主要决定因素(Brennecke等人，2005年). 与总mRNA库中这些种子匹配的发生率相比，这表明免疫纯化RNA中潜在miR-1靶点的显著过度表达(P（P）= 8 × 10−5)（分析见补充表S2）。图3B结果表明，7mer种子匹配的最强富集对应于miR-1突变体中的位置2-8。对于在miR-1种子的任何可能互补位置需要G:U碱基对的序列匹配，未发现过度表达，这与之前的发现一致，即GU碱基配对虽然与miRNA过度表达情况下的调节兼容，但总是有害的(Doench和Sharp 2004;Brennecke等人，2005年).

通过对野生型动物的miRNP进行差异免疫纯化，并与对照组进行比较，确定了32个具有潜在miR-1靶点的基因miR-1型突变体（表S2）。为了进一步分析，我们选择了11个7个基因与位置2-8匹配(表1). 为了测试这些mRNA是否可以被miR-1调节，制备了含有11个基因的3′UTR的萤光素酶报告子，并在有或没有miR-1共表达的S2细胞中表达。当miR-1同时表达时，所有11个结构体的荧光素酶活性均降低，尽管程度不同(图4A). 它们与含有miRNP的miR-1的结合以及它们在S2细胞中被miR-1转录后调节的潜力表明，这11个mRNA很可能是体内miR-1靶点。对于其中一个基因，可以获得编码蛋白的抗体，并且胚胎裂解物的免疫印迹分析显示miR-1型突变样本与野生型胚胎的比较(图4B). 我们注意到，在11个新验证的miR-1靶RNA中，只有5个之前通过一种以上的方法进行了预测，另外两个还没有通过任何方法进行预测。对多个miRNAs体内存在的miRNA-靶关系进行更广泛的分析可能会提供新的工具来提高靶预测的特异性和敏感性。

表1。

与miR-1结合差异纯化的mRNA

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mRNA在对照组和miR-1型突变胚胎。(一个)显示miR-1调控荧光素酶报告子的直方图，该报告子包含11个mRNA的3′UTRs，这些mRNA有助于面板的富集信号B类与对照细胞相比，所有这些在转染以表达miR-1的细胞中均下调。一个雷尼利亚将带有sv40 3′UTR的荧光素酶构建物共转染，以提供标准化对照。(B类)18至24小时对照胚胎（wt）和小核糖核酸-1个突变胚胎（miR-1击倒对手)，用Nedd4的抗体探测，然后用抗驱动蛋白重新处理作为负载对照。

在这项分析中，我们假设我们检测到的miRNA-靶关联反映了miRNA表达细胞中存在一种复合物，该复合物足够稳定，能够在免疫纯化方案中生存。我们不能排除在免疫纯化过程中裂解液中发生某些平衡的可能性，因此在纯化过程中，通常不与miRNA共表达的靶RNA可以结合。尽管如此，对照样品和突变样品中mRNA的差异回收允许我们得出结论，回收是由于与特定miRNA的关联，即使其中一些关联发生在裂解后。因此，如果与miRNA共表达，差异回收的mRNA是很好的靶点候选者。例如miR-1型如果Nedd4是miR-1表达细胞的真正靶点，则最容易解释突变胚胎。

以前的报告表明，miRNAs可以降低一些目标转录物的水平(Lim等人，2005年;Giraldez等人，2006年;Rehwinkel等人，2006年;Teleman等人，2006年; 有关查看信息，请参阅Jackson和Standart 2007). 11 miR-1相关靶基因的转录水平在野生型和miR-1型突变胚胎，在大多数情况下小于上下两倍，这些差异很少有统计学意义(表1，最后两列）。miRNA-介导的这些基因的调控似乎并不涉及其mRNAs的显著不稳定。预先看来，通过与Ago1复合物的稳定结合而鉴定的mRNA不太可能包括那些在RNA水平上受到miRNA强烈影响的mRNA。这些靶点更有可能反映在miRNA表达细胞中大量表达的mRNA，而miRNA在限制或缓冲表达水平方面发挥作用，可能“调节”靶活性水平(巴特尔和陈2004)而不是将其降低到无关紧要的程度。

材料和方法

分子克隆

FLAG/HA表位标签由两个寡核苷酸5′CATGGACTACAAGACGACAGAGAGAGACAGTCGATGGATCGATCGAGCGACCCTACCTACGACGTGCCACTACGGAGGC和5′GGCGCCTCCGGCGTTAGTCGGGCGCGAGTCGGGGCTATCCATCGAGGTCATCGTCGTGTAGTCCATGGTTAGTCATGGTAC退火而成。用KpnI和NotI消化产生的双链，并连接到含有微管蛋白启动子的P元件载体的KpnI/NotI位点(Lecuit等人，1996年). Ago1序列来自EST克隆LD09501(Kataoka等人，2001年). 用引物5′AAGGAAAAAGCGGCCATGTATCCAGTGGACACAGCTC和5′GTTGCGGGCAATCTGTGTGTG引物PCR扩增出Ago1的300-bp片段，引入NotI位点，克隆了NotI/MfeI片段和包含Ago1 cDNA剩余部分的MfeI/XhoI片段，转化为NotI/XhoI消化的pCaSpEr4-Tub>FLAG/HA，使Ago1 cDNA位于HA下游和框架内。该质粒用于产生转基因果蝇。对于细胞培养分析，将Tub>FLAG/HA-Ago1片段重新插入改良的pRmHa载体（经工程设计以包含Puramycin抗性基因）。

荧光素酶3′UTR报告子结构和miRNA质粒在Tubulin启动子下表达，如Teleman等人（2006年）). 应要求提供的所有构造的详细信息。

细胞培养

根据制造商的方案，通过将施耐德S2细胞转染到含有1μg质粒和Cellfectin（Invitrogen）的六孔板中，生成表达F/H-Ago1的稳定细胞系。从转染后48 h开始，使用10μg/mL嘌呤霉素筛选质粒。用抗HA抗体免疫印迹法检测耐嘌呤霉素细胞群中F/H-Ago1的表达。稳定系扩增至～1010细胞，相当于1 L悬浮培养液用于提取物制备。

免疫印迹法

免疫印迹样品通过SDS-PAGE分离，并使用半干技术转移到硝化纤维素膜上。使用的主要抗体是抗HA（罗氏）、抗微管蛋白（西格玛）、抗驱动蛋白（细胞骨架）和抗Nedd4(Sakata等人，2004年). 根据制造商的方案（Amersham-Biosciences），使用过氧化物结合二级抗体，并通过ECL系统观察结合抗体。

细胞提取物和胚胎裂解物

S2细胞提取物按规定制备(Dignam等人，1983年;Rigaut等人，1999年;Puig等人，2001年;Meister等人，2004年)经过某些修改；0.5–1 × 1010通过离心法收集细胞（200克，15分钟）。细胞颗粒用PBS洗涤两次，再悬浮在3体积的低渗缓冲液中（20 mM HEPES，pH 7.9，2 mM MgCl2，10 mM KCl，2%完全蛋白酶抑制剂混合物[Sigma]，100 U/mL RNasin[Promega]），并在冰上培养20分钟。使用Dounce均质器对细胞进行裂解。在10000下通过离心法去除细胞核克将上清液调节为150 mM KCL，20%甘油，总蛋白浓度为5 mg/mL果蝇属胚胎，建立大规模野生型胚胎采集，试管>F/H-Ago1、和miR-1/CyOKr-GFP公司;浴缸>f/h-ago1苍蝇。收集胚胎6小时，老化17小时。纯合子miR-1型通过分离表达GFP的胚胎（携带CyOKr-GFP公司来自GFP阴性的平衡染色体miR-1型使用Copas Select胚胎分选仪（Union Biometrica）进行突变。胚胎在低渗缓冲液中再次悬浮之前，在液氮中清洗和压碎。其余步骤与细胞提取物相同。

免疫净化

用0.1 M甘氨酸-HCl（pH 2.5）清洗10微升单克隆抗-HA结合琼脂糖珠（Sigma）一次，并用0.2 M Tris-HCl（pH 8）平衡。然后在4°C下，在含有0.2 mg/mL肝素的洗涤缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，150 mM KCl，20%甘油，0.5%吐温-20）中旋转封闭珠子2小时。在10000℃下通过离心法清除裂解产物克10分钟，然后在4°C下与珠子孵育1小时。收集珠子，并使用含有150 mM、200 mM和75 mM以及200 mM KCl的缓冲液依次清洗珠子10 min。通过在室温下用50μL含有50μg/mL HA肽（Sigma）的洗涤缓冲液剧烈摇动珠粒30分钟来洗脱结合的复合物。重复洗脱步骤，将洗脱液混合。

RNA提取和微阵列分析

洗脱液为蛋白酶K消化液，并使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取RNA。添加10微克酵母tRNA作为乙醇沉淀的载体，并将RNA颗粒重新悬浮在10微升水中。微阵列实验按照Teleman等人（2005）含有INDAC寡聚体的阵列代表Flybase 4.0版基因组转录本。细胞培养实验用于探测含有DGC1和DGC2基因集的阵列。Cy5标记的0至24小时胚胎总RNA用作参考样品。从免疫纯化中提取的RNA被Cy3标记。在每个病例中测量三个生物重复，代表独立的免疫纯化。log2比值中位数>0.6和q值<0.05（<5%假阳性）被认为是可靠的富集。提取3′UTR和编码序列数据库http://flybase.bio.indiana.edu/和的miRNA序列果蝇属来自http://microrna.sanger.ac.uk/.

RNA分析

miRNAs的Northern印迹按照Brennecke等人（2003年）对于Q-PCR，使用从免疫纯化样品中提取的总RNA，使用StrataScript RT（Stratagene）生成用寡核苷酸（dT）引物的第一链cDNA。使用SYBR Green（ABI）和ABI Prism 7000或7500序列检测系统进行定量PCR。所有测量重复进行，并归一化为rp49。

报告者分析

我们转染了0.1μg萤火虫荧光素酶报告质粒，0.1μg雷尼利亚荧光素酶表达质粒（转染控制）和1μg miRNA-表达质粒或空载体进入S2细胞。转染分三次进行。根据制造商的说明，转染后3d使用双荧光素酶检测系统（Promega）。

补充数据

补充数据可在http://www.tll.org.sg/stephen.asp网站.

致谢

我们感谢Ann-Mari Voie准备转基因果蝇。这项工作得到了欧盟FP6拨款LSHG-CT-2006-037900的部分支持；www.sirocco-project.eu.

脚注

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.rnajournal.org/cgi/doi/10.1261/rna.563707.

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