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.2007年11月；13(11):1894-910.
doi:10.1261/rna.768207。 Epub 2007年9月13日。

内源性和外源性microRNAs和siRNAs靶向性的决定因素

Cydney B Nielsen公司 1, 诺姆·肖姆龙, 里卡德·桑德伯格, 埃兰·霍恩斯坦, 雅各布·基茨曼, 克里斯托弗·B·伯格
附属公司

内源性和外源性microRNAs和siRNAs靶向性的决定因素

Cydney B Nielsen公司等。 核糖核酸. 2007年11月.

摘要

脊椎动物mRNAs经常通过3'UTR种子匹配与miRNAs 5'末端碱基配对的机制，被microRNAs（miRNA）靶向转录后抑制。通过对miRNA或siRNA过度表达或抑制后的表达阵列数据进行分析，我们发现mRNA折叠变化随着种子匹配数的增加而成倍增加（即对数相加），并且一个8 mer种子匹配与两个7 mer种子匹配相比调节下调。我们确定了几个增强种子匹配相关mRNA抑制的靶向决定因素，包括腺苷对miRNA碱基1和腺苷或尿苷对miRNA-碱基9的存在，与siRNA/miRNA的互补性无关。约50个碱基5'和3'的种子配对中序列保守性的增加和3'AU含量的增加均与mRNA下调的增加独立相关。所有这些决定簇在保守的miRNA种子匹配附近富集，支持其内源性miRNA靶向活性。总之，我们的结果能够改进siRNA的离靶预测，对保守和非保守的miRNA靶点进行综合排序，并表明内源性和外源性miRNAs/siRNAs的靶向涉及相似或相同的决定因素。

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数字

图1。
图1。
种子匹配类型和保存对miRNA和siRNA mRNA抑制的影响。(一个)种子匹配类型和编号系统，如miR-1所示。miRNA中的位置编号为5′-3′。（种子匹配6 mer）miRNA碱基2–7的WC反向补体；（A1）存在与miRNA碱基1相对的腺苷；（M8）WC与miRNA碱基8匹配。(B类)LFC的CDF（累积分布函数）（对数2转染miR-124后，对于含有指示miR-124-种子匹配类型（彩色线和标签）或没有miR-124/种子匹配（灰色线）的mRNAs。（实心垂直灰色线）LFC，97.5%的非匹配mRNA集位于LFC之上。(插入条形图）nLFC（标准化对数2折叠更改）每个种子匹配类型的值，带有指示标准错误的错误条。面板数据B类–E类来自Lim等人（2005）。图中仅包含包含一个miR-124种子匹配的mRNA，因此种子匹配类型集是互斥的。mRNA表达值的分布在种子匹配类型集之间没有显著差异(P（P）>秩和检验0.05）。除6 mer外，所有种子匹配类型的分布都与非种子匹配类显著不同(P（P）<0.005（通过秩和检验）。(C类)包含miR-124保守（红色）或非保守（蓝色）扩展种子匹配或无种子匹配（灰色）的互斥mRNA集的LFC CDF；守恒集和非守恒集有显著差异(P（P）<0.001（通过秩和检验）。“非保守”mRNA集合只包含非保守的种子匹配；“保守的”mRNA也可能包含非保守的种子匹配。对非保守集进行采样，以匹配种子匹配类型和计数、总体UTR保护和初始mRNA表达水平方面的保守集（补充图S2）。(D类)与相同B类用于miR-1。所有种子匹配类型类与无种子匹配类都有显著差异(P（P）< 10−4通过秩和检验）。(E类)与相同C类用于miR-1。保守和非保守mRNA集的CDF显著不同(P（P）秩和检验<0.01）。(F类)与相同B类以非U碱基开始的33个“有效”siRNA集合（补充材料）。显示了包含M1的其他种子匹配类（三角形）。所有种子匹配类型的分布与无种子匹配类有显著差异(P（P）< 10−14通过秩和检验）。(G公司)分析和控制与C类用于集合的siRNAs。保守和非保守mRNA集的CDF没有显著差异(P（P）>秩和检验0.05）。其他统计数据见补充表S1。
图2。
图2。
条件Dicer敲除（CDKO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的特性。(一个)显示了未经处理的野生型（wt）和CDKO MEF(左边面板）或邻羟基三苯氧胺（OHT）治疗后4天(正确的面板）。对细胞进行LacZ染色，显示LacZ阳性细胞的百分比(右上角). (B类)未经处理或添加OHT后的野生型和CDKO MEF扩散。误差线表示三个独立计数的标准偏差。(C类)未经处理的MEFcdko细胞的Western分析（lane4)或添加OHT后（车道5)显示添加OHT后Dicer蛋白水平降低了三到四倍。GAPDH是一种加载控制。使用不同浓度重组Dicer蛋白的西方人显示为阳性对照（lanes1，2). (D类)通过Northern分析（对数标度，双轴）测量八种miRNA（miR-21、miR-22、miR-23b、miR-34a、miR-92、miR-191、miR-199a*和miR-200b）的微阵列杂交强度变化和表达水平变化。
图3。
图3。
mRNA去抑制Dicer公司淘汰因种子匹配类型和保存状态而异。(一个)三类mRNA组中位LFC的CDF。表达类别为：（1）mRNA集合，包含与80个miRNA家族的扩展种子匹配，这些家族的表达通过微阵列检测到高于背景值（黑色曲线，显示选定的miRNA家族名称）；（2） 包含与未检测到表达的50个miRNA家族的扩展种子匹配的mRNA集合（灰色曲线）；（3） 随机选择的mRNA集（虚线）。检测集和未检测集的分布显著不同(P（P）经秩和检验<0.01），但未检测和随机mRNA集的分布不一致。(B类)MZdicer斑马鱼胚胎数据中含有指定miR-430种子匹配类型或无miR-430-种子匹配类型的mRNAs的LFC CDF（灰色曲线）（Giraldez等人，2006年）；仅包含一个miR-430种子匹配的mRNA（种子匹配型mRNA集相互排斥）。所有种子匹配类型的LFC分布与非种子匹配类显著不同(P（P）< 10−7通过秩和检验），合并的扩展种子匹配类型与6 mer类不同(P（P）秩和检验<0.01）。（实心垂直灰色线）LFC，低于该LFC，97.5%的无种子匹配的mRNA集合下降。(插入条形图）每个种子匹配类型的LFC值，误差条指示标准误差。(C类)在CDKO MEF实验中，mRNAs的LFC的CDF包含保守（红色）或完全非保守（蓝色）扩展种子匹配，或没有与31个“响应”miRNAs集合的种子匹配（灰色）（补充材料）。种子匹配计数、UTR总保守性和mRNA表达水平在组间进行控制。保守和非保守种子匹配的mRNA分布显著不同(P（P）秩和检验<0.05）。其他统计数据见补充表S6。
图4。
图4。
mRNA折叠变化随着种子匹配数的增加而增加。(一个)对于miR-1（开圆圈）和miR-124（实心黑圆圈），枚举了每个mRNA的扩展种子匹配总数，并确定了Lim转染实验中按种子匹配计数分组的mRNA组的平均nLFC（组大小显示在上述点或以下点）。（实线）最小二乘法适用于整个数据集。误差条对应于标准误差。对于每一个样地，不同种子匹配类型对不同种子匹配计数的比例保持相当恒定。(B类)与相同一个对于miR-430扩展种子匹配计数如下Dicer公司斑马鱼胚胎中的基因敲除（Giraldez等人，2006年）。(C类)与相同一个对于CDKO MEF中31个“反应性”小鼠miRNAs的保守扩展种子匹配计数（见补充材料）。
图5。
图5。
腺苷或尿苷在t9位增加mRNA的下调。(一个)包含siRNA M8 7 mer和M8-A1 8 mer两侧t9位置所示核苷酸的mRNA的平均nLFC（秩和检验P（P）-价值观；NS=不显著P（P）-值截断0.05）。误差条表示标准误差，而mRNA的数量则显示在误差条的上方。每个mRNA包含与任何给定siRNA精确匹配的一个种子（即t9组相互排斥），四个t9组中的每个mRNA的3′UTR GC含量受到控制。其他变量，如mRNA表达、3′UTR保守性或m9组成，在t9组之间没有显著差异。(B类)与相同一个，但通过t9碱基与siRNA m9配对（匹配）与否（不匹配）对受控mRNA集进行重新分类。(C类)人类3′UTR中保守与非保守miRNA M8 7和M8-A1 8侧边t9W核苷酸的富集（χ2测试P（P）-值）。miRNA集合由Lewis等人（2005）在去除具有共同m2-m8种子区域但不同m9核苷酸的miRNA以及同一超家族中的成对miRNA后用于靶预测的保守人类miRNA组成。对非匹配的种子进行采样，以匹配保守集的种子匹配类型、miRNA和总UTR-CG含量。(D类)基于计数和准确CG含量匹配的对照寡核苷酸队列（Lewis et al.2005），匹配和不匹配配置中M8 7 mer和M8-A1 8 mer与t9W或t9S的平均信噪比（误差条表示基于14个对照队列的标准偏差）。（虚线）基线S:N值为1。P（P）-基于指示集合之间的Wilcoxon秩和检验的值（NS=在P（P）-值截断0.05）。
图6。
图6。
局部保守和AU含量增强了siRNA-directed mRNA抑制。(一个)UTR位置100 bp 5′内的平均守恒百分比(左边)和3′(正确的)Lewis等人（2005年）使用的一组保守脊椎动物miRNAs的保守（红色）或非保守（蓝色）扩展种子匹配；在比较保守和非保守种子匹配时，控制了总体UTR保护。种子配对的100个碱基5′和3′的平均保守性差异显著(P（P）< 10−200通过秩和检验）。(B类)平均AU含量（UTR AU含量控制集）；种子配合子5′和3′的平均AU含量均存在显著差异(P（P）< 10−18，P（P）< 10−30)分别是。(C类)三个相等大小的mRNA集的平均nLFC由50-nt区域中的百分比保守位置（HMRD中）组成，紧接着5′（橙色）或3′（紫色）的siRNA种子匹配（5′区域在t10位置结束；3′区域从t1位置的一个碱基3′开始），用于包含与相关siRNA的单个扩展种子匹配的mRNA。条形图表示平均值的标准误差。每组的集合大小和平均守恒百分数分别在每个栏的上方和下方报告。P（P）-值用于第一个和第三个箱子之间的双边秩和测试。对于5′和3′保守性，对三个库进行取样，以确保它们的总体UTR保守性、5′（或3′）AU含量、总体UTR AU含量的分布、种子匹配类型和初始表达水平没有显著差异（P≥0.05）（补充图S9）。(D类)与相同C类但在相同的50-nt地区，UTR被非盟内容装箱。对Bin进行取样以控制UTR AU含量、5′（或3′）保守性、总体UTR保守性，种子匹配类型和初始表达水平（NS=在P（P）-值截断0.05）。
图7。
图7。
TargetRank评分区分强下调和弱下调mRNA。(一个)根据TargetRank得分排序的八个随机选择的siRNA转染实验的测试集中，mRNA的前20%（红色）和后20%（绿色）的LFC对相关siRNA的CDF（如图1所示）。只使用包含一个7 mer种子匹配的表达mRNA，而不使用任何类型的其他种子匹配。作为参考，显示了与相关siRNA缺乏种子匹配的mRNA的CDF（灰色）。（实心垂直灰色线）LFC，97.5%的非匹配mRNA集位于LFC之上。(插入条形图）见图1。其他统计数据见补充表S7。(B类)与相同一个，但Rodriguez等人（2007年）的miR-155敲除T细胞数据。(C类)在八个测试siRNA转染实验（与一个)使用TargetRank评分。平均TargetRank得分和平均nLFC用由TargetRank得分装箱的mRNA集合的标准误差条绘制（以上点指示的mRNA集合大小）。直线对应于整个数据集的最小二乘拟合（ANOVAP（P）< 10−100); r=0.23（皮尔逊相关）。(D类)与相同C类，但来自miR-155敲除T细胞的数据（Rodriguez等人，2007年）。直线对应于整个数据集的最小二乘拟合（ANOVAP（P）< 10−18); r=0.24（皮尔逊相关）。
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