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.2006年10月；146(1):169-80.
doi:10.1111/j.1365-2249.2006.03188.x。

炎症性肠病巨噬细胞中的组织蛋白酶B、L和D以及组织蛋白酶抑制在体内的潜在治疗作用

K门泽尔 1, M豪斯曼, F Obermeier公司, K Schreiter公司, N Dunger公司, F巴塔利, W福克, J Scholmerich出版社, H赫法特, G罗格勒
附属公司

炎症性肠病巨噬细胞中组织蛋白酶B、L和D的表达及组织蛋白酶抑制在体内的潜在治疗作用

K门泽尔等。 临床实验免疫学. 2006年10月.

摘要

组织蛋白酶D（CTSD）、B（CTSB）和L（CTSL）对蛋白质的细胞内降解非常重要。组织蛋白酶表达增加与炎症性疾病有关。我们之前已经证明了炎症性肠病（IBD）患者炎症粘膜中肠巨噬细胞（IMAC）中CTSD的诱导表达。在这里，我们研究了IBD期间IMAC中CTSB和CTSL的调节，以及体内CTSD和CTSB/CTSL抑制的影响。从正常和炎症粘膜中分离出人IMAC。对CTSB和CTSL mRNA进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。免疫染色用于确认PCR结果。应用胃蛋白酶抑制素A（CTSD抑制剂）、CA-074（CTSB抑制剂）和Z-Phe-Tyr-aldehyde（CTSL抑制剂）在小鼠右旋糖酐-硫酸钠（DSS）结肠炎模型中研究组织蛋白酶的抑制作用。从IBD粘膜分离的IMAC中CTSL mRNA显著上调。免疫染色显示，蛋白表达上调主要见于粘膜损伤区域。抑制小鼠DSS结肠炎中的CTSD后，疾病得到改善。与对照组相比，经抑制剂治疗的小鼠表现出显著的组织学评分（HS）较低和结肠减少较少。同样，同时抑制CTSB/CTSL后，结肠炎明显改善。IBD患者IMAC组织降解组织蛋白酶的表达增加。抑制CTSD和CTSB/CTSL后，实验性结肠炎得到改善。组织蛋白酶抑制预防粘膜损伤可能为IBD的治疗提供一种新的途径。

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图1
图1
（a） 一名无炎症（NI）粘膜患者和两名炎症性肠病（IBD）患者[溃疡性结肠炎（UC）、克罗恩病（CD）]CD33阳性肠巨噬细胞（IMAC）中组织蛋白酶B和L mRNA的表达。如图所示，CTSB、CTSL和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。阳性对照（+）：酶切CTSB或CTSL DNA片段的凝胶提取；阴性对照（–）：无DNA。本实验分别与不同患者的IMAC独立进行三次。（b） 对照组（NI）和IBD患者IMAC中CTSB和CTSL表达分析。从粘膜标本的IMAC中分离出mRNA，通过逆转录和扩增塔克man®–PCR。如图所示，组织蛋白酶/GAPDH mRNA比率（任意单位）。每个方框包含每个患者三重mRNA定量的平均值。显示了接受测试的患者数量。对照组和IBD患者IMAC中均检测到CTSB和CTSL的表达。CTSL在IBD中的表达显著增加(*P（P）< 0·05). CTSB在IBD中有较高表达的趋势。
图2
图2
免疫组织化学法检测人肠粘膜组织蛋白酶L（CTSL）表达细胞。用NovaRED（棕色）和巨噬细胞标记物CD68（盐酸联苯胺（BDHC）（蓝色反应产物）观察CTSL阳性细胞。（a） 对照粘膜中的单色CTSL阳性细胞（棕色）。用苏木精对细胞进行复染。（b–e）对照组（b）、溃疡性结肠炎（UC）（c，d）和克罗恩病（CD）（e）患者的粘膜中，CTSL（棕色）可与巨噬细胞（蓝色）共存。黑色箭头表示双染色细胞。CTSL阳性巨噬细胞聚集在严重炎症和组织损伤区域（c，e）。（f） 同型对照（无火焰粘膜）。（g） 对照粘膜中的单染巨噬细胞（蓝色）。在第一步免疫染色中，未检测到CTSL同型对照抗体的免疫染色（棕色）。原始放大倍数为200×（a，b，c，f）和400×（d，e，g）。该图代表了另外两个实验。
图3
图3
免疫荧光检测非炎症性肠病（NI）患者和炎症性肠疾病（IBD）患者的人类肠粘膜中组织蛋白酶B（CTSB）表达细胞。石蜡包埋切片对CTSB（绿色）、巨噬细胞特异性CD68（红色）和二氨基苯吲哚（DAPI）进行荧光单染和双染。在NI患者（a）、溃疡性结肠炎患者（b）和克罗恩病患者（c）的粘膜中检测到表达CTSB的肠巨噬细胞（IMAC）。白色箭头表示双染色细胞。原始放大倍数400×。该图代表了另外两个实验。
图4
图4
抑制剂处理小鼠的体重过程与PBS治疗对照小鼠。由于死亡或提前杀死四只小鼠导致从第8天起体重曲线发生误导性变化，因此只显示了实验前7天的体重。箭头表示第一剂胃蛋白酶抑制素A。数据点为各组的平均值±平均值的标准误差(n个= 5). 右旋糖酐-硫酸盐-钠/磷酸盐缓冲盐水（DSS/PBS）组的体重过程显示出显著差异与DSS/胃蛋白酶抑制素A组（方差分析，P（P）<0.001）以及与H2O/胃蛋白酶抑制素A组（方差分析，P（P）= 0·006).
图5
图5
胃蛋白酶抑制素A治疗小鼠（三角形）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）治疗小鼠（圆形）的结肠长度（有和无实验性结肠炎）。水平线表示平均值。除右旋糖酐-硫酸盐-钠/PBS组包含四只小鼠外，每组包含五只小鼠(*P（P）= 0·039).
图6
图6
右旋糖酐-硫酸钠诱导小鼠结肠炎的组织学表现。根据组织学评分（HS）为2.1±0.8（灰色三角形），消化抑素A治疗的结肠炎小鼠出现炎症，而磷酸盐缓冲盐水（PBS）治疗的对照组出现炎症，根据3.6±0.5（严重炎症，黑圈）。没有结肠炎但用抑制剂（深灰色三角形）治疗的小鼠和PBS治疗的对照组（灰色圆圈）没有发生炎症。水平线表示每组的平均值。评分由一名独立人员（F.O.）进行盲法评分(*P（P）< 0·03).
图7
图7
苏木精和伊红（H&E）染色的小鼠结肠组织相邻切片的显微照片。（a） 右旋糖酐-硫酸钠（DSS）-结肠炎小鼠结肠切片，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理；（b） 胃蛋白酶抑制素a治疗的DSS-结肠炎小鼠结肠切片；（c） 接受纯净水和胃蛋白酶抑制素a处理的小鼠结肠；（d） 接受纯净水和PBS治疗的小鼠结肠。在胃蛋白酶抑制素a治疗的小鼠中发现粘膜增厚、淋巴滤泡增大和炎性细胞积聚显著减少。放大100倍。
图8
图8
抑制剂处理小鼠的体重过程与磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的对照小鼠。组织蛋白酶B（CTSB）和CTSL同时腹腔注射，CTSB每天给予5 mg/kg CA-074，CTSL每天给予Z-Phe-Tyr-alded。箭头表示抑制剂的第一剂量。经抑制剂处理的小鼠（开环）体重减轻显著降低与PBS处理的对照组（实心圆圈）（方差分析，P（P）< 0·01). 数据点是每组的平均值±平均值的标准误差(n个= 5).
图9
图9
组织蛋白酶B（CTSB）和CTSL-抑制剂处理的小鼠（开环）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的对照小鼠（填充环）的结肠长度。水平线表示每组的中值(*P（P）= 0·048).
图10
图10
（a） 抑制剂治疗小鼠和磷酸盐缓冲盐水（PBS）治疗小鼠的组织学评分（HS），无论是否患有实验性结肠炎。抑制剂处理的右旋糖酐-硫酸钠（DSS）-结肠炎小鼠的HS为1.8±1.3，而PBS处理的对照组HS为3.5±0.5（严重炎症）。水平线表示每组的平均值(n个= 5). 评分由一名独立人员（F.O.）进行盲法评分(*P（P）= 0·029). （b） 苏木精和伊红染色的小鼠结肠组织相邻切片的显微照片。（i） 用PBS治疗的DSS-结肠炎小鼠的结肠切片。结肠炎的特征是粘膜增厚，淋巴滤泡大，炎症细胞大量涌入。（ii）用抑制剂治疗的DSS-脊髓灰质炎小鼠的结肠切片。放大100倍；m、 肠粘膜；f、 淋巴滤泡。
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