结果
在富含营养素的条件下，mTORC1与UVRAG相互作用
为了了解mTOR在自噬途径中的作用，我们测试了几种自噬蛋白与mTOR的相互作用。我们发现内源性mTOR与Beclin 1、UVRAG和RUBICON共同免疫沉淀(). mTOR对Vps34和Vps15的结合亲和力相对较弱。我们无法检测到mTOR与其底物S6K1或膜相关控制蛋白PA-PLA的任何相互作用，这表明在实验条件下，与S6K1与mTORC1的结合相比，含有UVRAG的Vps34复合物与mTOR的结合相对较强。mTOR形成两种不同的蛋白质复合物，mTORC1和mTORC2，其中猛禽和猛禽分别是其代表成分(Kim等人，2002年;Sarbassov等人，2004年). UVRAG与猛禽共同免疫沉淀(和图S1A)，但几乎没有和rictor在一起。一直以来，rictor基因敲除并不影响mTOR和UVRAG之间的相互作用(图S1B). 我们证实了猛禽和UVRAG在内源性水平上的相互作用(). 我们无法检测到UVRAG和RagB之间的任何相互作用(图S1A)，表明mTORC1可能独立于Rag GTP酶与UVRAG结合，Rag GTP酶介导溶酶体上的氨基酸-mTORC1信号传导(Kim等人，2008a;Sancak等人，2008年).
mTORC1与UVRAG结合并诱导UVRAG-磷酸化(A类)mTOR与含UVRAG的Vps34复合物结合。Myc-tagged蛋白在HEK293T细胞中瞬时表达。采用免疫印迹法（WB）分析用myc免疫沉淀物（IP）恢复的内源性mTOR。(B类)mTORC1与UVRAG相互作用。Myc-tagged蛋白在HEK293T细胞中用HA-UVRAG瞬时表达。WB分析用myc IP恢复的UVRAG。中间一条不相关的车道被取消。(C类)通过WB分析用RUBICON、猛禽和对照IgG IP回收的内源性UVRAG。(D类)UVRAG-mTORC1相互作用受Torin1或HBSS负调控，但不受雷帕霉素负调控。瞬时转导HEK293T细胞表达myc-UVRAG，在HBSS中孵育2h或用Torin1或雷帕霉素处理1h。WB分析用myc-UVRAG分离的内源性mTOR或雷帕藤。(E类)mTOR抑制诱导SDS-PAGE上UVRAG带的迁移。HEK293T细胞在DMEM或HBSS中培养2 h，或用Torin1处理1 h。细胞也在亮氨酸产生的培养基（−）中培养，然后补充亮氨酸（+）。(F类)MEF中TSC1或TSC2的缺乏导致UVRAG的迁移率改变(G公司)mTOR在体外磷酸化UVRAG。从细菌中制备GST标记的UVRAG片段，并与活性mTOR片段在32P-ATP。成立32通过放射自显影术分析UVRAG片段中的P。另请参见图S1.
为了阐明相互作用是否受诱导自噬的条件调节，我们用mTOR抑制剂（如Torin1或雷帕霉素）处理HEK293T细胞，或在缺乏营养的Hank平衡盐溶液（HBSS）中培养。Torin1或HBSS干扰mTORC1和UVRAG之间的相互作用(). 雷帕霉素适度降低了mTOR-UVRAG相互作用，同时显著降低了raptor-UVRAG的相互作用。雷帕霉素对raptor-UVRAG相互作用的剧烈影响可能是因为雷帕霉素干扰了mTOR-受体相互作用(Kim等人，2002年). mTOR需要全长的UVRAG才能稳定结合，而除C末端501-699片段外，所有测试片段对mTOR的结合亲和力都很弱(图S1C). 这表明UVRAG的整个结构构象可能对稳定的相互作用很重要。或者，分散的UVRAG的多个位点可能参与与mTOR的相互作用。
mTORC1诱导UVRAG磷酸化
我们观察到HBSS或Torin1，而不是雷帕霉素，在低百分比聚丙烯酰胺凝胶上诱导了UVRAG带的降低(和图S1D). 在培养基中，亮氨酸（mTORC1活性的一种有效刺激物）的缺乏也会导致降档。小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中负性调节mTORC1的TSC1（结节性硬化复合物1）或TSC2的耗竭，或HEK293T细胞中mTORC2阳性调节物Rheb的过度表达，导致UVRAG带的上移(和图S1E)确认mTORC1负责流动性变化。为了确定迁移率变化是否是由于磷酸化引起的，我们使用细菌表达系统制备了几个截短的UVRAG片段(图S1F)并将片段与含有残基1362–2549的mTOR活性形式在存在32P-ATP。mTOR的活性形式强烈诱导了含有271-699残基的片段和含有401-699残基的片断的磷酸化(). mTOR还分别含有残基1–170、1–300和301–500的弱磷酸化片段。这一结果表明，mTOR可能磷酸化UVRAG上的多个残基，这些残基分布在蛋白质的整个区域，尤其是C末端附近。
UVRAG mTORC1依赖性磷酸化位点的鉴定
为了确定UVRAG的mTORC1依赖性磷酸化位点，我们在HEK293T细胞中用HA-Rheb表达myc-UVRAG。作为对照，从没有Rheb过度表达的HEK293T细胞中分离出myc-UVRAG，并用Torin1处理1h。免疫沉淀的UVRAG-通过SDS-PAGE进行解析，并从凝胶中分离出UVRAG带。胰蛋白酶化后，磷酸化肽被富集并通过质谱分析。用UVRAG从Rheb表达细胞而非Torin1处理细胞中鉴定出总共七个磷酸化位点（S493、S498、S508、S522、S549、S550和S582）。S498、S522和S550的周围序列显示了mTORC1靶共识基序的特征(Kang等人，2013年) (和图S2A). 我们能够成功地产生识别UVRAG S498磷酸化状态的多克隆抗体(图S2B和S2C).
UVRAG Ser498是mTORC1依赖性磷酸化位点(A类)围绕UVRAG S498的序列与已知mTORC1靶点的序列对齐。(B类)Rheb诱导UVRAG S498磷酸化。HA-Rheb在HEK293T细胞中用myc-UVRAG表达。WB分析UVRAG S498磷酸化。(C类)MEF中的UVRAG磷酸化被Torin1、Akt抑制剂VIII或HBSS抑制，但不被雷帕霉素抑制。免疫沉淀UVRAG通过WB分析磷酸化。(D类)Akt和Rheb增强了S498磷酸化。HA-UVRAG仅在HEK293T细胞（−）中瞬时表达，或与myc标记的组成活性Akt突变体（cAkt）或Rheb一起瞬时表达。转染后两天，用载体（−）或Torin1（+）处理细胞1小时(E类)MEF中AMPK、PTEN或TSC1的缺乏会增强UVRAG磷酸化。MEF用载体（−）或Torin1（+）处理1h。UVRAG磷酸化通过免疫沉淀和WB分析。另请参见图S2.
mTORC1诱导UVRAG Ser498磷酸化
使用我们开发的磷酸化特异性抗体，我们发现Rheb在HEK293T细胞中过度表达可显著增加UVRAG S498磷酸化(). Torin1治疗MEF几乎完全抑制了S497处UVRAG的磷酸化，小鼠相当于人类UVRAGS498(). 磷酸化也被Akt抑制剂或HBSS（抑制mTORC1的条件）完全抑制(). 相反，雷帕霉素即使在高浓度下也几乎不抑制磷酸化(和图S2D). 这表明Ser498可能是雷帕霉素的敏感位点，就像其他一些mTORC1靶点一样(Kang等人，2013年). Torin1抑制Rheb或组成活性突变体Akt在HEK293T细胞中诱导S498磷酸化()，证实Ser498磷酸化依赖于mTORC1。我们一致发现，MEF中AMPK、PTEN（磷酸酶和张力蛋白同系物）或TSC1（mTORC1的负调控因子）的缺乏在很大程度上增加了UVRAG磷酸化，并且这种增加被Torin1抑制(和图S2E). ULK1缺陷，其在mTORC1上游和下游都起作用(Dunlop等人，2011年;荣格，2011年)在MEF中，UVRAG磷酸化仅略微增加(图S2F). HBSS仍然抑制这种增加，表明mTORC1独立于ULK1诱导UVRAG磷酸化。
mTORC1磷酸化UVRAG Ser498
为了确定mTOR是否磷酸化UVRAG S498，我们进行了体外激酶测定。活性mTOR 1362–2549片段诱导细菌纯化UVRAG的S498磷酸化显著增加(). 我们还发现mTOR野生型（WT），而不是其激酶缺失突变体（KD），在体外表现出对UVRAG磷酸化的激酶活性(). 内源性mTOR IP也大大增加了体外UVRAG 271-699片段的磷酸化(). mTOR或猛禽IP诱导多种形式的UVRAG携带S498磷酸化，在SDS-PAGE上表现出不同的迁移率()这意味着可能存在其他mTOR介导的磷酸化。相对于猛禽IP，mTOR IP诱导了更多缓慢的UVRAG形式，这意味着mTOR IP可能包含一个对S498以外位点的UVRAG磷酸化很重要的分子因子。当从高度表达rictor的HeLa细胞中分离出rictor IP时，我们能够检测到边际水平的S498磷酸化，但远低于由raptor IP诱导的水平(). 敲除HEK293T细胞中的mTOR或猛禽，但不敲除rictor，显著降低S498磷酸化(). 当S498被丙氨酸取代（S498A）或在反应过程中加入Torin1时，mTOR对UVRAG的体外磷酸化没有检测到(和图S3). 综合这些结果，证明mTORC1在S498磷酸化UVRAG。
mTORC1磷酸化UVRAG Ser498(A类)mTOR在体外磷酸化UVRAG S498。mTOR活性形式在ATP存在下与纯化的UVRAG孵育。Akt1作为阴性对照。WB分析UVRAG S498磷酸化。(B类)使用抗Myc抗体通过免疫沉淀法分离在HEK293T细胞中瞬时表达的Myc-mTOR WT或其激酶死亡突变体（KD），并与UVRAG和ATP孵育。(C类)从HEK293T细胞中分离出内源性mTOR IP，并以UVRAG 271-699片段为底物分析其激酶活性。(D类)mTOR、raptor或rictor IP是从HEK293T或HeLa细胞中获得的，激酶反应分析如（C）所示。(E类)分析从shRNA转导的HEK293T细胞中分离的内源性UVRAG中S498的磷酸化状态。(F类)Torin1在体外抑制UVRAG S498磷酸化。mTOR活性片段与从细菌中纯化的UVRAG WT或S498A孵育。在有或无Torin1的情况下进行激酶反应。另请参见图S3.
UVRAG Ser498磷酸化正调控UVRAG-RUBICON相互作用
为了了解UVRAG磷酸化的功能后果，我们研究了磷酸化状态是否可以调节mTORC1-UVRAG-相互作用。S498A突变只略微减少了mTOR-UVRAG的相互作用，并且这种相互作用仍然被Torin1破坏(图S4A). 这表明S498磷酸化可能不是相互作用的关键，而是在营养丰富的条件下，它们相互作用后的一个事件。接下来，我们检查S498A突变是否对UVRAG-RUBICON相互作用有影响。我们在HEK293T细胞中表达UVRAG WT、S498A或S498D（一种用天冬氨酸替代S498的突变），其中内源性UVRAGs被靶向UVRAGmRNA 3′-UTR的shRNA沉默(图S4B). S498A突变体与RUBICON相互作用，与WT相比亲和力较弱(和图S4C). S498D突变体与RUBICON的相互作用比S498A突变体更强。然而，S498D突变体不能完全恢复WT的亲和力，这表明天冬氨酸并不是残基上磷酸丝氨酸的完美模拟物。综合起来，结果表明S498的去磷酸化状态可能干扰UVRAG-RUBICON相互作用。
UVRAG-Ser498磷酸化正向调节UVRAG-RUICON相互作用(A类)S498磷酸化正向调节UVRAG-RUBICON相互作用。Myc-UVRAG WT或突变体在UVRAG-沉默的HEK293T细胞中瞬时表达。WB分析用myc-UVRAG IP恢复的内源性RUBICON。(B类)Torin1负调控UVRAG-RUICON相互作用。用Torin1处理HEK293T细胞4h。通过免疫沉淀和WB分析内源性UVRAG和RUBICON之间的相互作用。(C类)亮氨酸剥夺减少UVRAG-RUBICON相互作用。HEK293T细胞在含有（+）或不含亮氨酸（-）的培养基中培养2 h。用WB分析用UVRAG IP回收的内源性RUBICON。(D类)S498A突变对RUBICON与含UVRAG的Vps34复合物之间的相互作用产生负面影响。所示蛋白在UVRAG-沉默的HEK293T细胞中表达。转染后两天，用Torin1处理细胞，如（B）所示。另请参见图S4.
如果S498磷酸化正调控UVRAG-RUBICON相互作用，我们预测Torin1可能会抑制这种相互作用。正如预测的那样，Torin1抑制了UVRAG-RUICON的相互作用(). 同样，培养基中的亮氨酸缺失抑制了UVRAG-RUBICON相互作用(). Torin1和亮氨酸均未改变UVRAG或Atg14L与Beclin 1的相互作用(和图S4D). S498A突变也显著抑制了RUBICON-Vps34相互作用(). 这些结果表明，UVRAG S498磷酸化可能促进RUBICON与含UVRAG-的Vps34复合物的结合。Torin1对RUBICON与UVRAG和Vps34相互作用的抑制作用仍在S498A突变体中观察到(). 这表明可能还有其他mTOR依赖性磷酸化调节RUBICON和Vps34复合物之间的相互作用。
UVRAG Ser498磷酸化负调节Vps34
知道S498磷酸化正向调节RUBICON-Vps34相互作用，我们想知道磷酸化是否可能调节Vps34的激酶活性。我们在WT或突变UVRAG重组细胞中表达RFP-标记的2xFYVE，并监测RFP-FYVE-点状物的形成，这反映了磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）的产生(Sun等人，2011年;Zhong等人，2009年). 与WT细胞相比，我们观察到S498A细胞中RFP-FYVE点状物的诱导率更高(和图S5A–S5C). 在S498D细胞中FYVE点状结构也增加，但与S498A细胞相比显著减少。虽然我们没有观察到WT细胞和突变细胞之间FYVE点的细胞分布模式有任何显著变化，但与内胚体标记蛋白共同染色的FYVE-阳性区域，如Rab5和Rab7，在S498A细胞中比WT细胞高出很多(图S5D). 这可能是由于与WT细胞相比，突变细胞中FYVE点的积累更高。
UVRAG Ser498磷酸化对RUBICON对Vps34的抑制作用很重要(A类)阻止S498磷酸化增加了HeLa细胞中PI3P的积累。RFP标记的2xFYVE在WT或突变UVRAG重组HeLa细胞中瞬时表达，并通过荧光显微镜进行监测。比例尺，10μm。(B类)FYVE斑点形成的定量分析。结果表示为平均值±标准偏差（SD）（*，第页<0.05 vs WT；**，与WT相比，p<0.01；#,第页<0.01; n≥17）。(C类)阻止S498磷酸化增加Vps34的激酶活性。HA-Vps34在UVRAG缺失的HEK293T细胞中单独或与myc UVRAG一起表达。获得HA-Vps34 IP，并与磷脂酰肌醇（PI）和ATP在存在或不存在沃特曼（200 nM）的情况下孵育。PI3P的含量按照实验程序进行分析。(D类)Vps34激酶活性的定量分析。结果表示为平均值±SD（*，第页<0.01 vs空向量；#,第页<0.01; NS，无显著性；n=3）。(E类)RUBICON依赖S498磷酸化来抑制UVRAG诱导的PI3P的产生。如（A）所述，分析空腹载体或UVRAG转导的HCT116细胞中单独（−）或与RUBICON一起表达的RFP-2xFYVE。比例尺，5μm。(F类)PI3P斑点形成的定量分析。误差条表示平均值±SD(#,第页<0.01; n=20）。(G和H)RUBICON依赖S498磷酸化来抑制UVRAG介导的Vps34激酶活性刺激。用空载体或RUBICON构建物瞬时转染UVRAG重建的HEK293T细胞。体外激酶测定如（C）所示。该图代表了两个独立的实验。(我)WB分析用Vps34 IP恢复的Vps34。另请参见图S5.
为了阐明细胞中PI3P的增加是否是由于Vps34活性的增加，我们在体外分析了Vps34的激酶活性。我们从WT和突变重组HEK293T细胞中分离出Vps34。按照之前建立的程序，通过测量与PI3P结合的p40 phox结构域多肽的量来分析Vps34的催化活性(Farkas等人，2011年). 与空载体转导细胞相比，从WT细胞分离的Vps34显示出较高的PI3P生成(和图S5E). 这一结果与其他研究显示的UVRAG对Vps34的积极影响一致(Liang等人，2006年;Sun等人，2011年). 与WT细胞相比，从S498A细胞分离的Vps34显著增加了PI3P的生成(和图S5E). 相反，从S498D细胞分离的Vps34表现出与WT细胞相似的活性。这表明S498磷酸化可能抑制UVRAG介导的Vps34激酶活性的刺激。
UVRAG Ser498磷酸化对RUBICON对Vps34的抑制作用很重要
知道S498磷酸化对Vps34活性有负面影响，我们假设磷酸化作用可能是通过增强RUBICON与Vps34的结合来实现的。RUBICON在WT重组HCT116细胞中的表达显著减少FYVE点的数量(和图S5F)，这一结果与RUBICON对Vps34的负面作用一致(Sun等人，2011年). RUBICON的这种抑制作用在S498A细胞中显著减弱，而点刺大小没有任何剧烈变化(和图S5F和S5G). 这一结果表明RUBICON可能依赖S498磷酸化来抑制Vps34活性。我们通过观察RUBICON显著降低了从WT细胞分离的Vps34的激酶活性来证实体外结果，而从S498A细胞分离的Vps34没有观察到这种显著降低(). 一贯地，RUBICON敲除大大增加了WT细胞中的激酶活性，但敲除作用在S498A细胞中减弱(图S5H–S5M). 这些结果表明，S498磷酸化可能在RUBICON介导的Vps34激酶活性抑制中发挥重要作用。
UVRAG Ser498磷酸化负调控UVRAG-HOPS相互作用和Rab7
众所周知，RUBICON可以防止UVRAG与HOPS复合物结合(Sun等人，2010年). 由于S498A突变抑制了UVRAG-RUBICON相互作用，我们预测该突变可能会增加UVRAG-HOPS相互作用。正如预测的那样，与WT相比，与S498A突变体共同免疫沉淀HOPS复合物中较高水平的Vps39和Vps16(). 相对于S498A突变体，S498D突变体与Vps39和Vps16的亲和力较弱。Torin1模拟了S498A突变对UVRAG-HOPS相互作用的积极影响(). 与WT细胞相比，S498A细胞中UVRAG与HOPS的共定位增加(图S6A). Torin1进一步增加了WT和S498A细胞的共定位(图S6B)这表明其他mTOR依赖性磷酸化也可能参与调节共定位。RUBICON基因敲除大大增加了Vps16与WT的结合，但仅略微增加了与S498A突变体的结合(和图S6C). 一直以来，RUBICON过度表达显著抑制了Vps39与WT的相互作用，但与S498A突变体的相互作用不明显(图S6D). 综上所述，这些结果表明S498磷酸化对RUBICON介导的UVRAG-HOPS相互作用的抑制很重要。
预防UVRAG Ser498磷酸化促进自噬体成熟(A类)S498磷酸化负调节UVRAG-Vps39相互作用。HA-Vps39在UVRAG重组HEK293T细胞中瞬时表达，并通过免疫沉淀和WB分析其相互作用。(B类)S498磷酸化负调节UVRAG-Vps16相互作用。WB分析用GFP-UVRAG IP从HEK293T细胞中回收的Myc-Vps16。(C类)Torin1增强了UVRAG-Vps39的相互作用。用Torin1或载体（−）处理瞬时表达HA-Vps39和myc-UVRAG的HEK293T细胞。WB分析用myc-UVRAG IP回收的HA-Vps39。(D类)RUBICON敲除增强了WT细胞中的UVRAG-Vps16相互作用，但在S498A细胞中没有。通过WB分析用myc UVRAG IP从shRNA转导的HEK293T细胞中回收的GFP-Vps16。(E类)S498磷酸化负调控Rab7-RILP相互作用。用HA-RILP从WT或突变UVRAG-重组HEK293T细胞中回收的Rab7用WB分析。(F类)S498磷酸化负调节Rab7。如实验程序所述，检测到GTP结合的Rab7。(G公司)（F）的定量分析。数据为平均值±SD（n=2）。(H（H）)S498磷酸化负调控自噬体成熟。mCherry-GFP-LC3在空载体或UVRAG转导的HCT116细胞中表达。用Torin1或载体处理细胞。LC3用荧光显微镜监测。比例尺，5μm。(单元节点号)GFP puncta（I）和mCherry putta（J）的定量分析（*，第页<0.01 vs空向量；#，p<0.01；NS；n≥35）。平均值显示为水平条。(K（K）)纯樱桃斑点的定量分析（*，第页<0.01 vs空向量；#,第页<0.01; n≥35）。平均值和SD显示为水平条。(L（左）)S498A突变增强了自噬通量。在Bafilomycin A1（exp1）或E-64/Pepstatin A（exp2）存在或不存在的情况下，用Torin1处理用UVRAG构建物重建的HEK293T细胞。(M（M）)定量分析溶酶体抑制剂诱导Torin1处理细胞中LC3-II水平增加的倍数。数据为平均值±SD（*，第页<0.05; n=5）。另请参见图S6.
已知UVRAG结合可以增强HOPS活性，作为鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）朝向Rab7，Rab7是一种小GTPase，其激活对自噬体和内体成熟很重要(Liang等人，2008年;Sun等人，2010年). 我们通过监测RILP（Rab7-相互作用溶酶体蛋白）对Rab7的补充来评估Rab7活性状态。我们发现，与WT或S498D细胞相比，S498A细胞中RILP-Rab7相互作用显著增加(). 一致地，在S498A细胞中检测到更高水平的GTP结合的Rab7(和图S6E). 我们还询问S498磷酸化是否可能通过Mon1-Ccz1复合物调节Rab7，最近研究表明，该复合物对酵母和植物细胞中的Rab7起到了全球环境基金的作用(崔等，2014;Nordmann等人，2010年). 我们发现UVRAG与Ccz1和Mon1B相互作用(图S6F和图S6G)但与UVRAG-HOPS相互作用不同，S498突变并未改变这种相互作用。虽然这种相互作用意味着UVRAG和Ccz1复合物之间存在功能联系，但我们的结果表明S498磷酸化可能对HOPS而不是Cczl复合物有特定影响。
预防UVRAG Ser498磷酸化促进自噬体成熟
我们知道S498磷酸化负调节Vps34和HOPS，因此预测磷酸化可能调节自噬体成熟。为了解决这种可能性，我们使用了双标记LC3结构（mCherry-GFP-LC3）(Zhong等人，2009年). 与WT细胞相比，S498A细胞中mCherry-LC3点的形成显著增加，其可能反映了以自噬体或溶酶体为目的地的LC3(和图S6H–S6J). Torin1在WT和S498A细胞中诱导了绿色和黄色LC3点的形成，这可能反映了自噬体的形成，但与WT细胞相比，Torin1诱导了S498A中mCherry-LC3点形成的程度更大(和图S6H–S6J). 与WT细胞相比，S498A细胞对Torin1的反应中mCherry-LC3-only puncta的诱导率更高，这可能是因为残留的WT UVRAG在S498没有去磷酸化。支持这一点，Torin1不能完全抑制重组WT UVRAG的S498磷酸化()和Torin1诱导重组UVRAG S498去磷酸化的速率低于内源性UVRAG(图S6K和S6L). 与此相关，当S498突变为丙氨酸时，Torin1更严重地破坏了UVRAG介导的与RUBICON和mTOR结合的相互作用(和图S4A). 因此，S498A突变可能在某种程度上促进Torin1诱导的与UVRAG介导的自噬体成熟相关的蛋白质相互作用的变化。我们发现的那些额外的UVRAG磷酸化是可能的(图S2A)可能与Torin1效应有关。
为了进一步证实S498磷酸化负调控UVRAG介导的自噬体成熟，我们进行了自噬通量分析。与富含营养素或Torin1处理的WT细胞相比，溶酶体抑制剂在S498A细胞中更大程度地增加了LC3-II水平(和图S6M和S6N). 这一结果与LC3点分析结果一致，表明突变细胞中的自噬体成熟可能被促进。与WT细胞相比，突变体细胞对Torin1的反应中LC3-II水平的增加更高，这可以解释为上述结果，我们解释了与WT相比，S498A突变体细胞中自溶体中LC3的积累更高。WT和S498A细胞自噬体形成无显著差异()，S498A突变对DFCP1和WIPI2点的形成没有任何显著影响(图S6O–S6Q). 因此，S498A突变的影响不太可能是由于自噬早期步骤的上调。
预防UVRAG Ser498磷酸化促进UVRAG介导的EGFR内体溶酶体降解并减少EGFR信号传导
UVRAG通过增强HOPS活性积极调节内体-溶酶体融合(Liang等人，2008年;Sun等人，2010年). 内胚体成熟增强的一个结果是EGFR在溶酶体中易于降解(Liang等人，2008年). 由于S498A突变增强了UVRAG-HOPS的相互作用和Rab7的活性状态，我们预测S498A突变可能促进内体成熟和EGFR的溶酶体降解。HEK293T细胞中WT-UVRAG的重组增强了EGFR对EGF的降解(). 与WT细胞相比，S498A细胞中EGFR的降解显著增加(、和图S7A). 与EGF处理前的WT细胞相比，S498A细胞中EGFR的水平较低，这表明磷酸化也可能影响EGFR的基础内体-溶酶体降解。EGFR的促进降解伴随着EGF刺激的ERK1/2和AKT磷酸化的减少(和图S7B). 与S498A突变类似，Torin1增加了EGF刺激的EGFR降解，甚至在用EGF处理细胞之前也降低了EGFR水平(图S7C–S7F)，表明mTORC1抑制可能增强基础内体成熟。与WT细胞相比，在S498A细胞中，Torin1对EGFR的减少是微乎其微的(图S7G和S7H)支持我们的解释，即S498去磷酸化可能有助于Torin1刺激的EGFR降解。突变体细胞中Torin1对EGFR的进一步降低暗示了参与EGFR下调的其他mTORC1依赖机制。尽管存在其他潜在机制，但S498A细胞EGFR基础水平的降低可能是由于促进了内体-溶酶体融合。
预防UVRAG Ser498磷酸化增强EGFR降解，减少EGFR信号传导，抑制癌细胞增殖和肿瘤生长(A类)S498A突变增强EGFR降解。用空载体（−）或UVRAG构建物稳定转导的HEK293T细胞隔夜缺乏血清，并处理EGF。WB分析细胞裂解液中EGFR水平。(B类)EGFR水平是相对于时间零点的水平。数据为平均值±SD（n=4）。(C类)S498A突变抑制EGFR信号。HEK293T细胞，如（A）所示转导，隔夜无血清，并用EGF处理。通过WB分析pERK1/2（Thr202/Tyr204）或pAKT（Thr308）。(D类)S498A突变抑制癌细胞增殖。用空载体（−）或UVRAG构建物稳定转导的HCT116细胞在DMEM中培养。用血细胞仪计数活细胞数。数据为平均值±SD（n=3）。(E类)使用MTT分析活细胞。数据为平均值±SD（n=3）。(F类)S498A突变显著抑制癌细胞的凤尾鱼非依赖性生长。使用按（D）制备的HCT116细胞。数据显示为平均值±SD（*，第页与空载体相比，<0.01；#,第页<0.01; n=3）。(G公司)S498A突变显著抑制小鼠肿瘤生长。数值表示平均值±SD（*，第页=0.012; n=5）。(H（H）)分析肿瘤重量与全身重量的关系。数值代表平均值±SD（*，第页<0.01; n=5）。(我)UVRAG S498磷酸化在自噬体和内体成熟中的调节作用。另请参见图S7.
预防UVRAG Ser498磷酸化抑制癌细胞增殖和肿瘤生长
我们知道S498A突变促进EGFR降解并减少EGFR信号传导，因此我们询问该突变是否会抑制癌细胞增殖。HCT116结肠癌细胞WT UVRAG表达降低细胞增殖(). 这一结果与UVRAG已知的肿瘤抑制功能一致(Liang等人，2006年). 当表达S498A突变体而不是WT时，UVRAG的抑制作用更强。S498A细胞的增殖率分别是空载体转导细胞和WT细胞的5倍和2.9倍(). 在克隆形成分析中，HCT116细胞中S498A突变体的表达显著抑制了克隆形成（与空载体转导细胞和WT细胞相比，克隆数量分别减少了70%和54%）(和图S7I). 此外，与空载体转导细胞和WT细胞相比，S498A细胞的菌落尺寸要小得多(图S7I).
为了解决S498A突变对细胞增殖的抑制作用能否在体内重现，我们进行了异种移植实验。我们将WT或S498A HCT116细胞皮下注射到免疫缺陷Balb/c小鼠的侧面，并分析肿瘤大小。S498A细胞形成的肿瘤尺寸明显小于WT细胞形成的(和图S7J). S498A细胞衍生肿瘤的平均体积约为WT细胞衍生肿瘤体积的47.3%(). S498A突变显著降低了肿瘤重量（相对于全身重量）(和图S7K和S7L). 这一结果表明，Ser498磷酸化可能对UVRAG的肿瘤抑制功能很重要。
讨论
在本研究中，我们确定mTORC1在Ser498磷酸化UVRAG，从而调节后期自噬和内体成熟。mTORC1-介导的UVRAG磷酸化可能取决于mTORC1与UVRAG-相互作用的能力。就此而言，值得注意的是，mTOR定位于营养丰富条件下的晚期内体和溶酶体(Sancak等人，2008年). mTOR的营养调节定位符合我们的模型，即mTOR通过结合和磷酸化UVRAG以及HOPS复合物来抑制自噬体和内吞体的成熟，HOPS复合体也定位于晚期内吞体和溶酶体(Itakura等人，2008年;Pols等人，2013年). 根据我们的结果，磷酸化正调控UVRAG-RUBICON相互作用并抑制UVRAG在自噬体和内体成熟中的功能(). 尽管我们的研究结果支持S498磷酸化在调节溶酶体融合机制中的作用，但我们不排除S498A突变对自噬的影响可能是由于内吞途径的紊乱而导致的溶酶体功能变化的次要影响。
在许多癌症中经常发现mTORC1的过度激活(拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年). mTORC1对癌症的贡献主要归因于蛋白质合成的增加。我们的研究表明，mTORC1可能通过磷酸化UVRAG从而保护EGFR免受溶酶体降解而导致癌症。许多抑制EGFR溶酶体降解的基因突变与肿瘤发生和肿瘤进展有关(Grandal和Madshus，2008年;Kuan等人，2001年). 因此，mTORC1抑制可能有助于抑制肿瘤生长，至少部分是通过促进EGFR的溶酶体降解，尽管其作用程度可能因癌症类型而异。
最近的几项研究对UVRAG在自噬体-溶酶体融合中的作用提出了质疑(Farre等人，2010年;Jiang等人，2014年;Takats等人，2014年). UVRAG参与早期自噬事件，如向Beclin 1-Vps34复合物招募Bif-1（N-BAR域蛋白），这促进了自噬体形成所需的膜弯曲(Takahashi等人，2007年). 在自噬过程的早期阶段，UVRAG还起着协调Golgi-ER逆行和自噬膜运输的作用(He等人，2013年). 然而，由于UVRAG S498A突变没有改变ω体和吞噬细胞的形成，S498磷酸化不太可能参与自噬的早期过程。UVRAG还具有非自噬功能，如维持染色体稳定性(赵等，2012). mTORC1是否通过磷酸化调节UVRAG的非自噬功能尚待探索。
我们的发现将mTORC1-UVRAG通路定义为一个重要的调控轴，细胞通过该调控轴协调自噬和内体-溶酶体降解途径。在生长因子和营养物质不断变化的环境下，协调调节可能对维持正常的细胞生理学很重要。一些癌细胞可能通过降低UVRAG水平和抑制内胚体降解途径来干扰协调，这与乳腺癌、结直肠癌和胃癌中UVRAG基因位点的频繁改变有关(Kim等人，2008b;Knaevelsrud等人，2010年). 或者，癌细胞可能通过mTORC1介导的UVRAG磷酸化维持良好的细胞生长状态。进一步阐明膜过程中mTORC1调节的相互作用和磷酸化可能有助于阐明协调自噬和内体途径的分子网络，并有助于深入了解网络在癌症和其他疾病中是如何受到干扰的。
实验程序
UVRAG磷酸化位点的鉴定
用HA-Rheb在HEK293T细胞中表达Myc-UVRAG，并用抗Myc抗体进行免疫沉淀。作为对照，myc-UVRAG单独表达，并用Torin1处理1h。免疫沉淀UVRAG-通过SDS-PAGE溶解。UVRAG带经过胰蛋白酶化，随后磷酸化肽富集。用质谱法分析肽的胰蛋白酶消化液的洗脱部分。质谱分析的详细程序在补充实验程序.
质粒
通过PCR扩增，将人UVRAG cDNA（IMAGE:6186851）及其DNA片段克隆到pRK5载体中。用pLKO.1载体敲除UVRAG或RUBICON。利用CSII-EF-MCS稳定表达UVRAG。将UVRAG、Vps16、Rab5a、Rab7、DFCP1和WIPI2的cDNA克隆到pEGFP-N3和/或pmCherry-C1（Clontech Lab.Inc.，Palo Alto，CA）进行细胞成像实验。mCherry-GFP-LC3和RFP-2xFYVE构造分别由T.Johansen和N.Mizushima提供。所有其他构造都已在前面描述过(Jung等人，2009年;Vander Haar等人，2007年).
细胞图像分析
通过使用Deltavision荧光显微镜监测荧光蛋白标记构建物，分析自噬体成熟、ω体和吞噬细胞形成以及蛋白质共定位。详细程序在补充实验程序.
mTOR体外检测UVRAG磷酸化
使用免疫沉淀的mTOR或含有残基1362–2549的mTOR纯化形式（Millipore，Bedford，MA）在体外分析mTOR激酶对UVRAG磷酸化的活性。作为底物，使用ArcticExpress系统纯化UVRAG片段及其全长WT或S498A（加利福尼亚州拉霍拉市斯特拉赫内）。激酶反应如前所述进行(Jung等人，2009年).
体外Vps34激酶活性测定
如前所述，对Vps34激酶活性进行分析(Farkas等人，2011年). 简单地说，通过免疫沉淀获得的Vps34复合物与PI和ATP孵育。使用GST标记的p40 phox结构域多肽结合PI3P，分析反应产生的PI3P量。详细程序在补充实验程序.
自噬流量测定
在存在或不存在Bafilomycin A1（100 nM）或E-64/Pepstatin（10μg/mL）的情况下，用Torin1（250 nM）处理稳定表达UVRAG WT或S498A的HEK293T细胞4小时。用WB分析细胞裂解液中LC3-I和LC3-II的含量。
EGFR降解与EGFR信号分析
如前所述，对EGFR的细胞内降解进行分析(Liang等人，2008年;Sun等人，2010年). 简单地说，用EGF（100 ng/ml）处理隔夜缺乏血清的细胞达指定时间段，并在含有0.3%Chaps的裂解缓冲液中进行裂解。为了分析EGFR信号的活性，分别以20 ng/ml或10 ng/ml的EGF刺激缺血HCT116或HEK293T细胞10分钟。用WB分析ERK1/2和AKT的磷酸化状态。
肿瘤形成的异种移植分析
将WT和S498A HCT116稳定细胞皮下注射到裸鼠侧腹部。注射三周后，取出肿瘤并称重。肿瘤体积通过使用电子游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度（单位：毫米）进行评估。详细程序在补充实验程序.
其他实验程序
其他实验程序，包括材料、细胞培养、转染、诱变、免疫沉淀、western blotting、慢病毒制备、稳定细胞生成、重组蛋白制备、细胞增殖试验、Rab7活性状态分析、集落形成试验和统计分析，在补充实验程序.
补充材料
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图S1。mTOR与UVRAG相互作用，并在SDS-PAGE上诱导UVRAG的迁移率改变。(A类)mTOR和猛禽与UVRAG结合。用编码所示基因的质粒瞬时转导HEK293T细胞。转染后两天，分析myc免疫沉淀物的相互作用。中间不相关的车道被拆除。(B类)Rictor基因敲除不影响UVRAG和mTORC1之间的相互作用。(C类)UVRAG全长需要与mTOR稳定结合。在内源性UVRAG沉默的HEK293T细胞中，用HA-mTOR表达经Myc-tagged的全长和UVRAG片段。WB分析与UVRAG构建物共免疫沉淀的HA-mTOR数量。(D类)雷帕霉素不会改变SDS-PAGE上UVRAG带的迁移率。用雷帕霉素（rapa；100 nM）或Torin1（250 nM）处理HEK293T细胞1小时。作为载体（−），DMSO以相同体积使用。WB分析SDS-PAGE上UVRAG带的迁移率以及S6K1（Thr389）和4EBP1（Thr 37/46）的磷酸化状态。(E类)Rheb过度表达诱导UVRAG迁移。Myc-Rheb在HEK293T细胞中短暂过度表达。通过WB分析细胞裂解物。(F类)使用细菌表达系统纯化UVRAG片段。蛋白质用考马斯蓝G-250染色。
图S2。UVRAG Ser498是一个mTORC1依赖性磷酸化位点。(A类)质谱鉴定UVRAG磷酸化位点周围残基的序列比对。红色丝氨酸残基显示了已知mTORC1底物的共同特征(Kang等人，2013年). (B类)Ser498磷酸化特异性多克隆抗体的验证。用抗凝抗体结合琼脂糖免疫沉淀法分离标记的UVRAG。使用磷酸化特异性抗体通过WB分析UVRAG Ser498的磷酸化状态。多克隆抗体检测到UVRAG WT，但没有检测到S498A突变。用Torin1（250 nM）处理HEK293T细胞1小时，可显著抑制UVRAG带的检测。(C类)mTORC1激活特异性诱导Ser498磷酸化。HA-标记的Rheb与myc-标记的UVRAG WT或S498A一起在HEK293T细胞中表达，内源性UVRAG沉默。用多克隆抗体对Myc免疫沉淀物进行WB分析。(D类)雷帕霉素不抑制Ser498磷酸化。用雷帕霉素（0、0.1、0.25、0.5或1μM）或Torin1（250 nM）处理HEK293T细胞1 h。用WB分析UVRAG Ser498的磷酸化。(E类)多克隆抗体检测细胞裂解液中内源性UVRAG的磷酸化。如（B）所述，用Torin1治疗TSC1 KO MEF。获得细胞裂解液，用WB分析UVRAG和S6K1（pT389）的磷酸化状态。(F类)UVRAG磷酸化不需要ULK1。ULK1 MEF在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）或Hank缓冲盐溶液（HBSS）中培养2 h。如（B）所述分析Ser498的磷酸化。
图S3。mTOR在Ser498磷酸化UVRAG。将含有残基1362–2549的mTOR活性片段与从细菌表达系统纯化的UVRAG 271–699片段在有或无ATP的情况下培养。在反应期间添加Torin1（250 nM），并通过WB分析UVRAG Ser498的磷酸化状态。
图S4。UVRAG S498A突变降低了UVRAG-RUBICON之间的相互作用。(A类)Ser498磷酸化状态对UVRAG-mTORC1相互作用的调节并不重要。Myc-UVRAG WT或S498A在内源性UVRAG-缺失的HEK293T细胞中用HA-mTOR瞬时表达。用Torin1处理转染细胞1 h。WB分析与myc-UVRAG结合的HA-mTOR量。(B类)在HEK293T和HeLa细胞中敲除UVRAG。通过慢病毒转导靶向UVRAG mRNA 3′-UTR序列的shRNA来实现敲除（详见实验程序）。(C类)Ser498磷酸化状态调节UVRAG和RUBICON之间的相互作用。HA-标记的RUBICON与myc标记的UVRAG WT或突变构建物在HEK293T细胞中共同表达，内源性UVRAG-沉默。WB分析myc-UVRAG免疫沉淀回收的HA-RUBICON量。(D类)Torin1不会改变Beclin 1和Atg14L之间相互作用的结合亲和力。HEK293T细胞用载体（DMSO）或Torin1（250 nM）处理指定的时间段。WB分析用Atg14L免疫沉淀物回收的Atg14L和Beclin 1的数量。
图S5。取消UVRAG Ser498磷酸化可增加Vps34的激酶活性。（A）RFP-2xFYVE与myc-tagged UVRAG（WT、S498A或S498D）在HeLa细胞中瞬时表达，其中内源性UVRAG沉默。用荧光显微镜监测2xFYVE斑点。比例尺，10μm。(B类)RFP-2xFYVE在稳定表达UVRAG（空载体、WT或S498A）的HCT116细胞中瞬时表达。FYVE的累积分析如下所述.比例尺，5μm。(C类)RFP-2xFYVE点状物形成的定量分析（B）。误差条表示平均值±SD（n≥55）。(*,第页与空载体相比，<0.01；#,第页<0.01 WT与S498A相比。(D类)2xFYVE阳性区域与Rab5和Rab7共定位。通过RFP-2xFYVE构建物和GFP-Rab5或GFP-Rab 7瞬时转导HCT116 WT和S498A突变细胞。荧光显微镜监测RFP和GFP阳性区域。比例尺，5μm。(E类)防止UVRAG磷酸化增加Vps34的脂激酶活性。脂质激酶试验按照在没有或存在LY294002（100μM）的情况下保持30分钟(F类)UVRAG Ser498磷酸化对RUBICON抑制UVRAG-诱导的细胞内PI3P生成的作用很重要。通过UVRAG构建物稳定转导的HCT116细胞被瞬时转导以单独表达RFP-2xFYVE（−）或同时表达RFP-2-xFYVe和RUBICON（+）。荧光显微镜监测2xFYVE阳性区域。比例尺，5μm。(G公司)RUBICON不会显著改变2xFYVE阳性区域的大小。误差条代表平均值±SD[单独重量（n=121）；单独重量与RUBICON（n=77）；单独S498A（n=220）；S498A与RUBICON（n=116）]。(H–K型)UVRAG S498A突变可显著降低RUBICON敲除引起的Vps34激酶活性增加。通过shRNA稳定转导的HEK293T细胞被瞬时转导以表达指示的蛋白质。转染后两天，用HA抗体免疫沉淀法分离Vps34复合物。这个在体外Vps34的激酶测定按照. (五十、 M（M）)H-K中Vps34激酶活性的定量分析。误差条表示平均值±SD（*，第页WT和S498A之间<0.05；n=2）。
图S6。取消UVRAG Ser498磷酸化可增加自噬体成熟。(A、 B类)与WT细胞相比，UVRAG在S498A突变细胞中与Vps16的共定位更高，Torin1处理进一步增强了这种共定位。内源性UVRAG沉默的HeLa细胞被瞬时转导以表达GFP-Vps16和mCherry-UVRAG-结构。在荧光显微镜下对转导的细胞进行分析。右侧的强度线扫描显示Vps16和UVRAG之间的共定位程度。线扫描是沿着合并图像的插入框中绘制的黄色线进行的。箭头表示UVRAG和Vps16的共定位。比例尺，5μm。(C类)RUBICON基因敲除增强了UVRAG WT和Vps16之间的相互作用，但几乎没有增强UVRAG S498A和Vps16。将shRNA稳定转导的HEK293T细胞瞬时转导到一起表达myc-UVRAG和GFP-Vps16结构。WB分析与myc-UVRAG共免疫沉淀的GFP-Vps16数量。(D类)RUBICON过度表达降低了UVRAG WT和Vps39之间的相互作用，但几乎没有降低UVRAG S498A和Vps39。内源性UVRAG被沉默的HEK293T细胞被瞬时转导以表达myc-UVRAG和HA-Vps39结构，并与HA-RUBICON结合或不结合。通过WB分析与myc UVRAG共免疫沉淀的HA-RUBICON和HA-Vps39的量。(E类)特异性识别Rab7-GTP而非Rab7-GDP的单克隆抗体的验证（Abcam，ab173250）。GFP-Rab7突变体在HEK293T细胞中瞬时表达，用Rab7活性状态特异性抗体免疫沉淀GTP-结合的Rab7，并用抗GFP抗体进行WB分析。抗体免疫沉淀了Rab7的活性突变体（Q67L），而不是Rab7（T22N）的非活性突变体。(F类)Ccz1与UVRAG的相互作用具有类似于UVRAG-Vps16/39相互作用的亲和力。将HEK293T细胞瞬时转染以表达所示的myc标记的结构体和GFP-UVRAG。用WB分析myc免疫沉淀物中与myc标记结构体结合的GFP-UVRAG的数量。(G公司)UVRAG-Ser498磷酸化对UVRAG和Mon1/Ccz1复合物之间的相互作用没有影响。将HEK293T细胞瞬时转导以表达myc标记的UVRAG构建物以及HA标记的Mon1B和Ccz1。转染后两天，获得myc免疫沉淀。用WB分析myc免疫沉淀物中HA-Mon1B和HA-Ccz1的含量。(H–J)UVRAG S498A突变增加自噬体成熟。mCherry-GFP-LC3构建物在HCT116细胞中瞬时表达，这些细胞由空载体（H）、野生型（I）或S498A（J）稳定转导。用Torin1（250 nM）处理转导的细胞4小时，用荧光显微镜监测mCherry和GFP点。比例尺，5μm。(K（K）)重组UVRAG对Torin1的反应中Ser498的去磷酸化反应比内源性UVRAG的反应稍微延迟。在指定的时间段内，用Torin1（250 nM）处理稳定表达U VRAG标记的HEK293T细胞。用WB分析标记免疫沉淀物中UVRAG的Ser498的磷酸化状态。为了进行比较，用Torin1处理的HEK293T细胞中的抗UVRAG抗体通过免疫沉淀法分离内源性UVRAG。(L（左）)定量分析内源性和重组UVRAG之间的UVRAG-磷酸化相对水平(M（M）)与WT细胞相比，溶酶体融合抑制剂BAFA1增加了S498A细胞中LC3-II的水平。将由UVRAG WT或S498A稳定转导的HEK293T细胞在有或无Bafilomycin A1（100 nM）的DMEM中培养4小时(N个)定量分析Torin1处理的WT和S498A突变细胞中溶酶体抑制剂处理诱导的LC3-II水平增加的倍数。(哦)Ser498磷酸化对omegasome和吞噬细胞的形成没有影响。GFP-DFCP1在HCT116 WT和S498A突变细胞中瞬时表达，而GFP-WIPI2在HeLa细胞中用myc标记的UVRAG（WT或S498A）瞬时表达，内源性UVRAG-沉默。用Torin1（250 nM）处理细胞4 h，用荧光显微镜监测GFP-DFCP1和GFP-WIPI2。(P、 问)DFCP1点（P）和WIPI2点（Q）的定量分析。平均值和SD显示为水平条。DFCP1-和WIPI2-染色图像的比例尺分别为5μm和10μm。
图S7。预防UVRAG Ser498磷酸化可增强EGFR的内体-溶酶体降解，减少EGFR信号传导，并抑制癌细胞和肿瘤生长。(A类)防止UVRAG Ser498磷酸化可增加EGFR的溶酶体降解。稳定表达UVRAG（WT或S498A）标记的HCT116细胞用EGF（100 ng/ml）处理指定的时间段。WB监测EGFR水平。(B类)防止UVRAG Ser498磷酸化可抑制EGF刺激的ERK1/2磷酸化。将稳定表达UVRAG WT或S498A标记的HCT116细胞饥饿过夜，并用EGF（20 ng/ml）处理10分钟(C类)Torin1促进EGFR降解。HEK293T细胞在无血清培养基中饥饿过夜，用载体（DMSO）或Torin 1（250 nM）处理2 h，然后用EGF（100 ng/ml）刺激。(D和E)图S7C中EGFR降解的定量分析。EGFR的水平分别相对于DMSO在时间零点时的水平（D）或相对于DMSO和Torin1在时间零点时的水平（E）。(F类)Torin1降低EGFR的基础水平。将HEK293T细胞血清饥饿过夜，孵育DMSO或Torin（250 nM）4 h，然后进行EGF治疗（10 ng/ml）。(G公司)相对于WT细胞，Torin1略微降低了S498A突变细胞中EGFR的基础水平。如（F）所述，用Torin1和EGF处理细胞。(H（H）)（G）EGFR水平的定量分析。(我)UVRAG S498A突变显著抑制癌细胞集落形成。HCT116细胞（1×104/6孔板），按照，接种并在软琼脂中培养2周。如方法所述，用0.005%结晶紫对菌落进行染色。(J-L公司)消除UVRAG磷酸化抑制肿瘤生长体内将稳定表达UVRAG WT或S498A标记的HCT116细胞皮下注射到Balb/c nu/nu小鼠（n=5）的侧面。在处死荷瘤小鼠之前，对其进行拍照（J）和称重（K）。从小鼠体内取出肿瘤并称重（L）。误差条表示平均值±SD（n=5）。(*,第页<0.01，重量vs S498A）。
