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.2008年8月；10(8):935-45.
doi:10.1038/ncb1753。 Epub 2008年7月6日。

Rag GTPases对TORC1营养反应的调控

金恩忠 1, Pankuri Goraksha-Hicks公司, 李丽, 托马斯·普·纽费尔德, 关坤良
附属公司

Rag GTPases对TORC1营养反应的调控

金恩忠等。 Nat细胞生物学. 2008年8月.

摘要

TORC1（雷帕霉素复合物1的靶标）在细胞生长和大小的调节中起着至关重要的作用。已知激活TORC1的信号范围很广，包括氨基酸。在此，我们报道了Rag GTP酶作为TORC1的激活剂对氨基酸信号的反应。敲除Rag基因表达抑制了氨基酸对果蝇S2细胞TORC1的刺激作用。哺乳动物细胞中组成活性（GTP-结合）Rag的表达在缺乏氨基酸的情况下激活了TORC1，而显性负性Rag的表示阻断了氨基酸对TORC1的刺激作用。对果蝇的遗传学研究也表明，Rag GTP酶在饥饿期间调节细胞生长、自噬和动物生存能力。我们的研究建立了Rag GTPases在TORC1激活中响应氨基酸信号的功能。

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数字

图1
图1。dRagA和dRagC是TORC1的新型激活剂果蝇属S2电池
（a） dRagA和dRagC的敲除降低了dS6K磷酸化（T398）。 果蝇属用或不用每种表明的RNAi处理的S2细胞都是氨基酸（AA）饥饿1小时，然后AA刺激30分钟。用指示的抗体通过免疫印迹法测定dS6K的磷酸化和蛋白质水平。（b） dAkt磷酸化不需要dRagA和dRagC。 果蝇属用或不用每种显示的RNAi处理S2细胞后，AA饥饿1小时，用AA刺激30分钟。用所示的适当抗体通过免疫印迹法测定dAkt的磷酸化和蛋白质水平。NC：阴性对照RNAi。（c） dRagA和dRagC功能与TSC2和PTEN平行。如图所示，将dRagA或/和dRagC RNAi与dTSC2或dPTEN RNAi联合添加到S2细胞中。dTSC2或dPTEN RNAi治疗增加了pdS6K（T398），而这种增加受到dRagA或/和dRagC RNAi的影响。
图2
图2。哺乳动物Rag GTPases调节TORC1活性
（a） 组分活性RagA和RagB刺激S6K磷酸化。将200 ng的每种哺乳动物RagA、RagB、RagC或RagD构建物与HA-S6K（20 ng）共同转染到HEK293细胞中。还测试了它们相应的显性阴性突变体（RagA T21N、RagB T54N、Rag C S75N和RagD S76N）和组成活性突变体（拉格A Q66L、拉格B Q99L、拉格C Q120L和拉格D Q121L）。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。标记的分子量显示在右侧。（b） 在调节S6K磷酸化方面，RagA比RagC起主导作用。200 ng每种显示的Rag构建物与20 ng HA-S6K共转染。转染中使用的不同Rag突变体显示在每条车道的顶部。（c） Rag调节TORC1，但不调节TORC2活性。200 ng每种指定Rag构建物与20 ng HA-S6K、20 ng Myc-4EBP1或100 ng GST-AKT联合转染。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。
图3
图3。Rag GTP酶参与氨基酸反应
（a） 在没有AA的情况下，RagA Q66L和RagC S75N激活TORC1。将200ng的每个指示的Rag构建体与HA-S6K（20ng）共转染到HEK293细胞中。细胞在收获前被AA饥饿1小时。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。标记物的分子量显示在右边。（b） RagA T21N和RagC Q120L在AA刺激下阻断S6K磷酸化。将200 ng pcDNA3或每个指示的Rag构建物与HA-S6K共同转染到HEK293细胞中。细胞被AA饥饿1小时（−AA），在收获前，要么留在AA饥饿培养基中，要么用含有AA的培养基刺激30分钟（+AA）。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。（c） RagA T21N和RagC Q120L抑制胰岛素对S6K磷酸化的刺激。将200 ng pcDNA3或每个指示的Rag构建物与HA-S6K（20 ng）或GST-AKT（100 ng）共同转染到HeLa细胞中。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。
图4
图4。dRagA和dRagC促进细胞和器官生长果蝇。
（a） dRagA积极调节机翼隔间大小。野生型或突变型dRagA转基因在带有en-GAL4驱动因子的后腔室中表达。显示了具有代表性的前后室面积之比。dRagA Q61L表达导致后房室面积显著增加，dRagA-T16N表达导致后室面积减少。P值：*7.32e-04（n=7），**6.18e-04（n=12）；学生的双尾t检验，其中n代表分析的成年翅膀数量。（b） dRagA正向调节翼细胞大小。显示了en-GAL4 UAS-dRagA成人翅膀后室细胞的平均面积。表达dRagA Q61L的细胞明显大于对照组，而表达dRag A T16N的细胞则小于对照组。P值：*1.15e-03（n=7），**0.025（n=12）；学生的双尾t检验，其中n代表分析的成年翅膀数量。（c，d）dRag GTPases积极调节幼虫脂肪体细胞大小，（c） 克隆诱导表达dRagA细胞的细胞面积或dRagC公司显示了相对于邻近野生型控制细胞的纯合突变细胞。细胞面积是从喂食或48小时饥饿的幼虫的含卵磷脂的固定脂肪体样品中测定的。表达dRagA-WT或dRagA Q61L可显著增加饥饿条件下的相对细胞面积，但不增加喂食条件下的细胞面积。dRagA T16N表达细胞和dRagC公司只有在营养充足的条件下，失去功能的细胞才明显小于对照细胞。结果以n个样本的平均值±标准偏差表示。P值：*2.04E-03（n=5），**2.94e-06（n=14），***3.79e-07（n=14），*****1.36e-0（n=30）5；学生的双尾t检验。（d） 具有改变的dRagA活性的脂肪体细胞的代表性实例。dRagA转基因表达细胞的标志是GFP在左两个面板中的表达dRagC公司纯合突变细胞在右图中以GFP的缺失为标志。比例尺代表50μm。
图5
图5。Rag与TOR通路成分之间的关系
（a） Rag通过TORC1调节S6K磷酸化。用所示的结构体转染。共表达600 ng mTOR激酶死亡（mTOR KD）结构或雷帕霉素治疗（20 nM，30 min）可消除RagA Q66L和RagC S75N对S6K磷酸化的影响。用抗mTOR抗体免疫印迹法测定mTOR KD蛋白水平。标记的分子量显示在右侧。（b） RagA/RagC和TSC1/TSC2独立调节S6K磷酸化。如图所示，用200 ng的Rag和/或TSC构建物转染HEK293细胞。氨基酸饥饿1小时（−AA）。如图所示，通过使用适当抗体的免疫印迹法测定转染蛋白的磷酸化和蛋白水平。（c） TSC2和RagA/B独立影响S6K磷酸化。如图所示，将20 ng HA-S6K转染到HeLa细胞中，加入或不加入针对人类TSC2、RagA和RagB的RNAi。（d） RagA T21N和RagC Q120L不能阻止Rheb诱导的S6K磷酸化。将RagA T21N和RagC Q120L（各200 ng）转染到HEK293细胞中，加入或不加入Rheb构建物（20 ng）。共同转染中包括S6K。如图所示，通过使用适当抗体的免疫印迹法测定转染蛋白的磷酸化和蛋白水平。
图6
图6。Rag GTPases与Rheb平行作用，促进脂肪体细胞生长
（a，b）Rheb诱导的细胞生长不需要dRagC。（a） 对照组或dRagC公司突变体(dRagC公司−/−）背景，相对于赋值为1的相邻对照细胞。Rheb的过度表达导致对照组和对照组的细胞面积显著增加dRagC公司突变背景*P=3.4e-02（n=5），**P=6.1e-03（n=6）；学生双尾t检验，其中n表示实验样本的数量。。（b） Rheb过度表达细胞的典型例子数据标签C突变背景。Rheb转基因表达细胞以GFP的共同表达为标志。细胞边界用指骨蛋白染色标记为红色；细胞核被DAPI标记为蓝色。比例尺代表50μm。（c，d）dRagA Q61L的表达未能挽救Rheb公司突变细胞。（c） 克隆诱导的相对面积Rheb公司26.2对照背景和动物体内的纯合突变细胞在脂肪体中表达dRagA Q61L。克隆诱导的Rheb公司26.2在野生型和dRagA Q61L表达背景中，纯合突变细胞明显小于相邻的对照细胞*P=2.91e-04（n=7），**P=2.59e-08（n=5）；学生双尾t检验；fed条件，其中n表示实验样本数。（d） 脂肪体中广泛表达UAS-dRagA Q61L的Rheb纯合突变细胞（以缺乏GFP为标志，箭头所示）的典型例子。本实验中GFP阳性对照细胞是Rheb公司+/−和Rheb公司+/+.比例尺代表50μm。
图7
图7。Rag对自噬的调节
（a–d）dRagA Q61L抑制自噬。（a） 克隆表达dRagA Q61L的果蝇脂肪体细胞（绿色标记为GFP表达）在饥饿4小时后无法积累自体溶酶体（点状Lysotracker红染色在周围的对照细胞中明显可见）。DAPI用蓝色标记细胞核。（b–d）GFP-Atg8a在对照脂肪体细胞（b）中的点状表达模式表明，在饥饿4小时后诱导自噬体反应，但在表达dRagA Q61L（c）的细胞中没有。对照组和dRagA Q61L表达克隆中每个细胞GFP-Atg8a标记的自噬体平均数量如（d）所示（*P=2.91E-06，每个基因型33个脂肪体样本的学生双尾t检验）。比例尺表示每个面板中的25μm。（e） RagA调节哺乳动物细胞中LC3的转化。如图所示，Myc-LC3与RagA-QL和RagC-SN或RagA-SN和Rag C-QL共同转染到HEK293细胞中。转染后一天，细胞在氨基酸充足培养基（+AA）或氨基酸耗尽培养基（−AA）中培养4小时，然后收获。对Myc-LC3和HA-Rag进行蛋白质印迹。活性RagA阻断LC3I自噬转化为脂化LC3II形式，显性负性RagA刺激LC3I转化。
图8
图8。高dRagA活性致敏果蝇属饿死
（a，b）dRagA激活增加了对饥饿的敏感性。与对照组相比，使用脂肪体特异性Cg-GAL4驱动因子表达dRagA Q61L显著降低了成年雌性苍蝇在饥饿（a）条件下的存活率，但没有喂食（b）条件下（仅Cg-GAL 4）。星号表示与对照组相比具有显著差异的时间点（*P<0.05；学生双尾t检验；n=150只苍蝇/基因型/治疗）。（c） Rag GTPase调控TORC1活性的拟议模型。Rag GTPases独立于TSC-Rheb并与之平行，激活TOR信号，可能通过转换营养素依赖信号。Rag GTPases调控TOR的机制是间接的，可能涉及其他未知因素。
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中的注释

  • 营养感应：TOR的Ragtime。
    Meijer AJ、Codogno P。 Meijer AJ等人。 自然细胞生物学。2008年8月；10(8):881-3. doi:10.1038/ncb0808-881。 自然细胞生物学。2008 采购管理信息：18670446 没有可用的摘要。

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