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.2007年10月；9（10）:1142-51。
doi:10.1038/ncb1634。 Epub 2007年9月23日。

Bif-1通过UVRAG与Beclin 1相互作用并调节自噬和肿瘤发生

高桥吉诺里 1, 多梅尼科·科波拉, 松下诺里玛萨, 埃尔纳尼·D·库林, 孙美儿, 佐藤裕雅, 华裔科学家梁澄玉, Jae U Jung先生, 金庆成, 詹姆斯·穆雷, W Jack抵押人, 王洪刚
附属公司

Bif-1通过UVRAG与Beclin 1相互作用并调节自噬和肿瘤发生

高桥吉诺里等人。 Nat细胞生物学. 2007年10月.

摘要

自噬是一个进化上保守的“自我吞噬”过程。虽然酵母中已鉴定出自噬（命名为Atg）所必需的基因，但Atg蛋白如何控制哺乳动物细胞中自噬体形成的分子机制仍有待阐明。在此，我们证明Bif-1（也称为嗜内素B1）通过抗紫外线相关基因（UVRAG）与Beclin 1相互作用，并作为III类PI（3）激酶（PI（3，KC3）的阳性介质发挥作用。为了应对营养缺乏，Bif-1定位于自噬体，与Atg5以及微管相关蛋白轻链3（LC3）共定位。此外，Bif-1的丢失抑制了自噬体的形成。虽然Bif-1的SH3结构域足以与UVRAG结合，但Bif-1激活PI（3）KC3并诱导自噬体形成需要BAR和SH3结构区。我们还观察到Bif-1消融延长了饥饿条件下的细胞存活时间。此外，Bif-1基因敲除显著促进小鼠自发肿瘤的发生。这些发现表明，Bif-1与UVRAG-Beclin 1复合物结合，是一种潜在的自噬激活剂和肿瘤抑制剂。

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数字

图1
图1
Bif-1缺失可抑制营养剥夺诱导的半胱氨酸蛋白酶非依赖性细胞死亡。在指定的时间点，通过台盼蓝排除试验测定死亡细胞的百分比（平均值±标准差。；n个= 3). (一)双歧杆菌-1+/+（WT）和-/-（KO）MEF在EBSS中培养0、3、6或12小时(b条)双歧杆菌-1用Bif-1表达质粒或对照空载体稳定转染的KO MEF在EBSS中孵育0或12小时双歧杆菌-1通过免疫印迹分析（inset）检测KO细胞。(c（c）)双歧杆菌-1WT和KO MEF在EBSS中在50μM z-VAD-fmk或对照DMSO存在下培养0、3、6或12小时(d日)巴克斯+/+贝克+/+（重量）和巴克斯-/-贝克-/-（DKO）MEF在EBSS中在50μM z-VAD-fmk或对照DMSO存在下培养0、6或12小时。
图2
图2
抑制自噬可增强caspase-3的激活，但抑制caspase-非依赖性细胞死亡。(a、 b)双歧杆菌-1WT和KO MEF或巴克斯/贝克WT和DKO MEF感染shBECN1或控制shSCR慢病毒。感染后24小时，用新鲜培养基代替培养基，并使细胞再恢复48小时。然后将细胞在EBSS中培养0、6或12小时，并通过台盼蓝排斥试验测定死亡细胞的百分比（平均值±标准差。；n个= 3). 通过免疫印迹分析（插图）确认Beclin 1表达下调。(c、 d日)双歧杆菌-1用10 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、0.2μM沃特曼（WM）或对照DMSO预处理WT和KO MEF 30 min，然后在EBSS中培养指定时间。用台盼蓝排除法测定死亡细胞百分比（平均值±标准差。；n个= 3). 免疫印迹分析检测LC3修饰和caspase-3激活。(e（电子）)附件5+/+和-/-MEFs在50μM z-VAD-fmk或对照DMSO存在下在EBSS中培养0、6或12小时。通过台盼蓝排斥试验测定死亡细胞的百分比（平均值±标准差。；n个= 3). (（f）)总细胞裂解物（TCL）由附件5+/+和-/-MEFs在EBSS中培养指定时间并进行免疫印迹分析。免疫印迹的完整扫描显示一，b条，d日和（f）补充信息如图S5所示。
图3
图3
Bif-1缺失抑制自噬。(一)双歧杆菌-1将WT和KO-MEFs在完全培养基（CM）或EBSS中培养3小时，并通过透射电子显微镜进行分析。箭头表示自噬体。计算每个横切面细胞的自噬体数量（平均值±标准差。；n个= 42). (b条)双歧杆菌-1用GFP-LC3转染WT和KO MEF，在EBSS或CM中培养3h，然后用荧光显微镜进行分析。比例尺指示10μm。计算每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点数（平均值±s.d。；n个= 35). (c（c）)Bif-1 WT（W）和KO（K）MEF在EBSS中培养指定时间，并用抗LC3、α-微管蛋白和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析。(d日)双歧杆菌-1将稳定转染Bif-1表达质粒或对照空载体的KO MEF在EBSS中培养0、3或6 h，并进行免疫印迹分析。LC3的免疫印迹结果c（c）和d日被量化为LC3-II占总LC3（LC3-I+LC3-II）的百分比，并以条形图表示。(e（电子）)稳定表达shBif-1的克隆或转染GFP-LC3的对照HeLa细胞在CM或EBSS中培养2h，并通过荧光显微镜进行分析。定量每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点数（平均值±标准差。；n个= 66). (（f）)将GFP-LC3与shBif-1耐药的Bif-1-HcRed、Bif-1ΔBAR-HcRed或空的Hc Red载体联合转染Bif-1敲低的HeLa细胞20 h。然后将细胞在EBSS或CM中培养2 h，并用荧光显微镜测定每个Hc red阳性细胞的GFP-LC3-点数（平均值±s.d。；n个= 35). 统计显著性一，b条，e（电子）和（f）通过Student t检验确定。免疫印迹的完整扫描显示c（c），d日和e（电子）补充信息如图S5所示。
图4
图4
Bif-1定位于自噬体。(一)将Bif-1-HcRed与GFP-Atg5或GFP-LC3一起转染COS7细胞。转染后20小时，细胞在EBSS或CM中培养2小时，并进行共聚焦显微镜分析。放大后的图像显示为插图。代表性的Bif-1-Atg5或Bif-1-LC-3双阳性病灶用箭头表示。插图中的比例尺为1μm。(b条)转染Bif-1-GFP的COS7细胞在EBSS中培养2h，用抗GFP抗体的免疫金电镜检测Bif-1-GFP的定位。箭头表示在自噬体膜上检测到的具有代表性的金颗粒。
图5
图5
Bif-1通过UVRAG与Beclin 1相互作用(一)双歧杆菌-1WT和KO MEF在EBSS中培养0或6小时，并用抗Bif-1单克隆抗体进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹法分析产生的免疫复合物和TCL。(b条)293T细胞与所示质粒共转染24小时，并用抗Flag单克隆抗体进行免疫沉淀。使用抗Myc或抗Flag多克隆抗体进行免疫印迹，分析产生的免疫复合物和TCL。(c（c）)293T细胞与所示质粒共转染22 h，在EBSS中饥饿2 h，并用抗Flag单克隆抗体进行免疫沉淀。使用抗Myc或抗Flag多克隆抗体进行免疫印迹，分析产生的免疫复合物和TCL。(d日)用siGFP或siUVRAG转染293T细胞24小时，在EBSS中饥饿2小时，并用抗Bif-1单克隆抗体进行免疫沉淀。使用抗Bif-1和Beclin 1多克隆抗体通过免疫印迹分析产生的免疫复合物和TCL。通过免疫沉淀和抗UVRAG多克隆抗体（Abgent）的免疫印迹分析证实siUVRAG降低了UVRAG-蛋白表达。免疫印迹的完整扫描如补充信息图S5所示。
图6
图6
Bif-1的SH3结构域的过度表达而非内皮素A1的过度表达抑制了自噬体的形成。(一)用0.2μg GFP-LC3和0、0.2或0.6μg Bif-1（SH3）-Myc表达质粒转染HeLa细胞24 h。用pcDNA3载体将质粒DNA总量调整为每次转染0.8μg。然后将细胞在EBSS或CM中培养3 h，并使用荧光显微镜测定每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点数（平均值±s.d。；n个= 40). (b条)将GFP-LC3与Bif-1（SH3）-HcRed、Endophilin A1（SH3。；n个= 46). 统计显著性一和b条通过Student t检验确定（*p<0.0001）。(c（c）)将所示质粒转染293T细胞24小时，并用抗Flag单克隆抗体进行免疫沉淀。使用抗Myc和抗Flag多克隆抗体进行免疫印迹，分析产生的免疫复合物和TCL。免疫印迹的完整扫描显示c（c）补充信息如图S5所示。
图7
图7
Bif-1的缺失抑制了营养饥饿期间PI3KC3的激活。(一)双歧杆菌-1用Flag-PI3KC3转染WT和KO MEF，然后在CM或EBSS中孵育2 h，并用在体外PI3KC3激酶测定。通过免疫印迹分析确认Flag-PI3KC3的表达（左图）。显示了代表性的自动射线照片（中间面板）。结果通过台风扫描仪的磷化成像进行量化，并显示为折叠激活（右侧面板）。数据以五个独立实验的平均值±标准差表示。(b条)双歧杆菌-1用p40（phox）PX-EGFP转染WT和KO MEF，在CM或EBSS中培养2h，并用荧光显微镜进行分析。计数每个细胞p40（phox）PX EGFP阳性囊泡的数量（平均值±s.d。；n个= 35). 统计显著性一和b条通过Student t检验确定。(c（c）)将稳定的shBif-1克隆或对照HeLa细胞单独转染Flag-PI3KC3或与Flag-Taged Beclin 1和UVRAG联合转染48 h，并用在体外PI3KC3脂激酶测定。结果被量化并显示为相对活性（平均值±标准差。；n个= 3). (d日)293T细胞与Flag-PI3KC3和野生型Bif-1、Bif-1ΔSH3或对照空载体共转染24 h，并用在体外PI3KC3激酶测定（平均值±标准差。；n个= 3). (e（电子）)Bif-1-UVRAG-Beclin 1-PI3KC3蛋白复合物的示意图。
图8
图8
Bif-1基因敲除增强小鼠自发肿瘤发生。(一)双歧杆菌-1-/-小鼠表现出中度脾肿大。切除脾脏的重量双歧杆菌-1+/+ (n个=27）和-/-(n个=34）只小鼠（6至18个月大）被测量。通过Wilcoxon秩检验确定统计显著性。(b条)肿瘤组织苏木精和伊红染色。21只Bif-1野生型小鼠中有3只（14.3%）和29只（89.7%）尸检小鼠中有26只（89.5%）出现肿瘤。比例尺指示50μm。
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中的注释

  • 将膜形成自噬体。
    Mari M、Reggiori F。 Mari M等人。 自然细胞生物学。2007年10月；9(10):1125-7. doi:10.1038/ncb1007-1125。 自然细胞生物学。2007 PMID：17909525 没有可用的摘要。

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