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.2013年12月；9(12):1983-95.
doi:10.4161/auto.26058。

MTOR对营养应激诱导自噬中PIK3C3/VPS34复合物的调控

海鑫源, 瑞安·C·拉塞尔, 关坤良

MTOR对营养应激诱导自噬中PIK3C3/VPS34复合物的调控

海鑫源等人。 自噬. 2013年12月.

摘要

自噬是细胞对应激条件的一种防御反应，例如营养素饥饿。III型磷脂酰肌醇（PtdIns）3-激酶的催化亚单位为PIK3C3/VPS34，在细胞内膜转运和自噬诱导中起着关键作用。PIK3C3形成多种复合物，含ATG14的PIK3C特异性参与自噬诱导。雷帕霉素（MTOR）复合物1的机械靶点MTORC1是一种关键的细胞营养传感器和整合器，可刺激合成代谢和抑制分解代谢。营养素饥饿使TORC1失活在自噬诱导中起着关键作用。在本报告中，我们证明了MTORC1失活对自噬特异性（含ATG14）PIK3C3激酶的激活至关重要，而它对不含ATG14的PIK3C3复合物没有影响。MTORC1通过磷酸化ATG14抑制含ATG14的PIK3C3的PtdIns 3-激酶活性，这是MTORC1在体内外抑制PIK3C所必需的。我们的数据表明，氨基酸饥饿和通过自噬特异性PIK3C3激酶的直接激活而诱导自噬之间存在着机械联系。

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数字

无
图1。与自噬相关的PIK3C3复合物调控需要MTOR。(A类)含有PIK3C3的ATG14在MTOR抑制的条件下被激活。HEK293细胞在以下条件下培养：富营养（NR）、无氨基酸（AA-，指示时间）、Torin1（100 nM，1 h）或雷帕霉素（50 nM，1h）处理。用ATG14抗体免疫沉淀含ATG14的PIK3C3复合物，并用于脂质激酶测定。(B类)量化(A类). (C类)MTOR抑制诱导自噬。HEK293细胞的处理与(A类)含或不含巴非霉素A1（Baf A1)（100 nM）处理1小时，然后采集细胞。使用特异性抗体检测LC3和SQSTM1水平。(D类)RHEB通过激活MTOR抑制含有PIK3C3的ATG14。将Flag-ATG14、Myc-BECN1和HA-PIK3C3与pcDNA3或RHEB一起转染HEK293细胞。用Flag抗体免疫沉淀含ATG14的PIK3C3复合物，并用于脂质激酶分析。(E类)量化(D类). 误差条表示同一治疗组内独立实验平均值的标准误差。星星表示统计上的显著差异。
无
图2。Rag GTPases-MTOR通路介导对氨基酸饥饿的自噬反应。(A类)Rag GTPases在氨基酸饥饿时抑制ATG14-PIK3C3激活。用Flag-ATG14、Myc-BECN1和HA-PIK3C3以及pcDNA3、RRGA-QL和RRAG-SN或RRAGA-TN和RRAG-QL转染HEK293细胞。用Flag抗体免疫沉淀含有PIK3C3复合物的ATG14，并进行脂质激酶测定。(B类)量化(A类). (C类)组成活性RRAGB通过MTORC1激活阻断自噬。稳定表达控制载体或RRAGB的HEK293A细胞Q99升接受过氨基酸饥饿或Torin1（100 nM）治疗，有或没有巴非霉素A1（100 nM）处理1小时，然后采集细胞。免疫印迹法检测LC3水平。LE：长时间接触；SE：短期接触。误差条表示同一治疗组内独立实验平均值的标准误差。星星表示统计上的显著差异。
无
图3。MTORC1而非MTORC2参与不同PIK3C3复合物的调节。(A类)氨基酸饥饿只激活含ATG14的PIK3C3脂激酶活性。从MEF中免疫沉淀出不同的PIK3C3复合物，这些MEF在富营养或无AA培养基中培养1h，并进行脂质激酶分析和免疫印迹。(B类)量化(A类). (C类)RPTOR击倒激活ATG14-PIK3C3。不同的PIK3C3复合物反应器用相应抗体免疫沉淀KD MEF，并进行脂激酶分析。右侧面板显示对照组或反应器KD MEFs公司。(D类)里克托敲除对ATG14-PIK3C3活性无影响。来自RICTOR WT或里克托用相应抗体免疫沉淀KO MEF，并进行脂激酶分析。右侧面板显示WT或里克托KO MEF公司。
无
图4。MTORC1而非MTORC2调节自噬特异性PIK3C3活性。(A类)RPTOR敲除增强基础自噬和自噬特异性PIK3C3活性。加扰或Rptor公司KD MEF在富营养或无氨基酸培养基中培养1 h。细胞固定，并用LC3抗体和GST-FYVE探针进行免疫染色。(B类)染色定量(A类). (C类)里克托敲除对氨基酸饥饿诱导自噬没有影响。WT和里克托KO MEF的处理和染色与(A类). (D类)染色定量(C类). 误差条表示同一治疗组内独立实验平均值的标准误差。星星表示统计上的显著差异。
无
图5。MTORC1（而非MTORC2）在体外调节含ATG14的PIK3C3复合物。(A类)MTORC1在体外抑制ATG14-PIK3C3活性。用ATG14抗体免疫沉淀含ATG14的复合物，并用体外从HEK293细胞纯化的MTORC1或MTORC2处理。对于MTORC1治疗，将存在Torin1（50 nM）或不存在ATP的反应设置为对照。然后对免疫复合物进行脂激酶分析。右侧面板显示分析中使用的MTORC1和MTORC2的相对量。(B类)量化(A类). 误差条表示同一治疗组内独立实验平均值的标准误差。星星表示显著差异。(C类)MTORC1对ATG14-PIK3C3的剂量依赖性抑制。在体外用增加的MTORC1处理含ATG14的复合物，并进行脂激酶分析。显示Torin1的存在（最后一条车道）。(D类)BECN1-PIK3C3复合物不受MTORC1或MTORC2的调节。体外用MTORC1或MTORC2处理BECN1-PIK3C3复合物，然后进行脂激酶分析。(E类)ATG14增加了PIK3C3的基础活性，并通过MTORC1给予抑制。用BECN1抗体免疫沉淀BECN1-PIK3C3复合物，并用Flag-ATG14蛋白（50 ng）孵育10 min。洗涤后，用MTORC1进一步处理免疫复合物，最后进行脂激酶分析。免疫印迹显示Flag-ATG14与BECN1-PIK3C3复合物结合。中顶部面板下的数字(C–E类)表示每个点归一化为PIK3C3水平的相对密度。
无
图6。MTORC1通过磷酸化ATG14抑制ATG14-PIK3C3复合物的活性。(A类)通过MTOR实现ATG14的磷酸化。重组GST标记的ATG14或RPS6KB表达并纯化自大肠杆菌，并用作体外MTOR激酶测定的底物。磷酸化测定方法32用免疫印迹法测定P-放射自显影和蛋白水平。GST-RPS6KB作为MTOR激酶检测的阳性对照。(B类)五个磷酸化残基的突变在体外通过MTOR消除ATG14磷酸化。用Flag-ATG14-WT或5S/TA突变体以及Myc-BECN1和HA-PIK3C3转染HEK293细胞。用Flag抗体免疫沉淀法纯化Flag-ATG14蛋白，并进行体外MTOR激酶检测。(C类)稳定表达HA-ATG14-WT或HA-ATG1-5S/TA的HEK293细胞。HA-tagged ATG14的运行速度略慢于内源性ATG14（顶部面板）。(D类)氨基酸饥饿会激活ATG14-WT，但不会激活ATG145S/TA相关的PIK3C3活性。在富含营养或饥饿条件下，使用HA抗体从HEK293稳定细胞中免疫沉淀含ATG14的PIK3C3复合物。用MTORC1处理免疫复合物，然后进行脂激酶分析。(E类)量化(D类). 误差条表示同一治疗组内独立实验平均值的标准误差。星星表示统计上的显著差异。
无
图7。ATG14-5S/TA突变促进自噬水平。(A类)ATG14-5S/TA的表达增强了LC3-II。将稳定表达对照载体ATG14-WT或ATG14-5S/TA的HEK293细胞用富营养或无AA-培养基处理1h，并加入或不加入巴非霉素A1（100 nM）。免疫印迹法检测LC3水平。斑点下的直方图表示微管蛋白归一化的每个LC3-II带的定量。(B类)ATG14-5S/TA增强了SQSTM1降解。印迹下的直方图表示通过肌动蛋白归一化的每个SQSTM1带的量化。(C类)ATG14-5S/TA促进自噬。稳定表达对照载体ATG14-WT或ATG14-5S/TA的HEK293A稳定细胞在富含营养的培养基中培养1h。细胞固定，并用GST-FYVE探针（PtdIns3P）和HA和LC3抗体进行免疫染色。比例尺：10μm。(D类)染色定量(C类). 误差条表示同一治疗组内独立实验平均值的标准误差。星星表示统计上的显著差异。
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