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.2008年6月13日；320（5882）：1496-501。
doi:10.1126/science.1157535。 Epub 2008年5月22日。

Rag GTPases结合猛禽并介导mTORC1的氨基酸信号

亚塞米·桑卡 1, 蒂莫西·彼得森, 约夫·D·绍尔, 罗伯特·林德奎斯特, 卡森·C·托林, 锂离子棒电极, 大卫·M·萨巴蒂尼
附属公司

Rag GTPases结合猛禽并介导mTORC1的氨基酸信号

亚塞米·桑卡等。 科学类. .

摘要

多蛋白mTORC1蛋白激酶复合物是一种促进生长的途径的核心成分，该途径对胰岛素、能量水平和氨基酸作出反应，在常见癌症中被解除调控。我们发现Rag蛋白——一个由四种相关的小鸟嘌呤三磷酸酶（GTPases）组成的家族——以氨基酸敏感性的方式与mTORC1相互作用，并且是氨基酸激活mTORCl途径所必需的。一种与三磷酸鸟苷组成性结合的Rag突变体与mTORC1强烈相互作用，其在细胞内的表达使mTORC1途径对氨基酸剥夺具有抗性。相反，二磷酸鸟苷结合Rag突变体的表达阻止了氨基酸对mTORC1的刺激。Rag蛋白不直接刺激mTORC1的激酶活性，但与氨基酸一样，促进mTOR在细胞内定位到一个含有其激活物Rheb的隔间。

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数字

图1
图1
Rag异二聚体与重组和内源性mTORC1的相互作用取决于RagB的核苷酸结合状态。在（A）通过（D）用表达载体中的指定cDNA转染HEK-293T细胞，制备细胞裂解物，并通过免疫印迹分析裂解物和HA-或FLAG免疫沉淀物中特定重组或内源性蛋白的量。（E）纯化的FLAG-raptor与野生型RagB-D或RagB的体外结合全球技术伙伴-D类国内生产总值.
图2
图2
过表达RagB的影响全球技术伙伴-mTORC1通路上含有异二聚体及其对亮氨酸、氨基酸或胰岛素的反应。表达指示蛋白对共同表达的S6K1磷酸化状态的影响（A）亮氨酸，（B）总氨基酸，或（C）胰岛素。从剥夺50分钟血清和（A）亮氨酸或（B）氨基酸的HEK-293T细胞制备细胞裂解物，然后，如有指示，用亮氨酸或氨基酸刺激10分钟。HEK-293E细胞（C）被剥夺血清50分钟，如有指示，用150 nM胰岛素刺激10分钟。分析裂解物和FLAG免疫沉淀物中特定蛋白质的水平和S6K1的磷酸化状态。（D）氨基酸剥夺对胰岛素介导的mTORC1激活的影响。HEK-293E细胞需要血清和氨基酸或仅需要血清50分钟，如果需要，用10或150 nM胰岛素刺激。分析细胞裂解液中S6K1的水平和磷酸化状态。
图3
图3
稳定表达RagB细胞中mTORC1通路对氨基酸剥夺的不敏感性全球技术伙伴.（A）稳定表达RagB、Rheb1、Rag的细胞的细胞大小分布（图）和S6K1磷酸化（免疫印迹）全球技术伙伴或Rap2A。平均细胞直径±S.D.（μm）为：Rap2A，16.05±0.07；Rheb1，16.79±0.06；RagB，16.40±0.08；和RagB全球技术伙伴，16.68±0.06（n=4，与表达Rap2A的细胞的所有比较p<0.0008）。用编码特定蛋白质的慢病毒转导的HEK-293T细胞被剥夺50分钟的血清和（B）亮氨酸或（C）总氨基酸，如有指示，用亮氨酸或氨基酸重新刺激10分钟。分析细胞裂解液中特定蛋白质的水平和S6K1的磷酸化状态。（D）氨基酸刺激Rag蛋白与mTORC1的相互作用。稳定表达FLAG-tagged RagB、RagD或RagB的HEK-293T细胞全球技术伙伴饥饿氨基酸和血清50分钟，如有指示，用氨基酸重新刺激10分钟。然后用化学交联分析对细胞进行处理，并对细胞裂解物和FLAG免疫沉淀物进行分析，以确定指示蛋白的水平。（E）氨基酸刺激对RagB GTP负荷的影响。n=3时，数值为平均值±标准差（氨基酸刺激引起的GTP负荷增加，p<0.02）。（F）表达所示shRNAs的HeLa细胞中RagA、RagB、RagC和RagD的丰度。（G）表达靶向RagC和RagD的shRNAs的HeLa细胞中S6K1磷酸化。细胞被剥夺血清和亮氨酸50分钟，如有指示，用亮氨酸重新刺激10分钟。（H）dsRNA介导的RagB或RagC果蝇同源基因敲除对氨基酸诱导的dS6K磷酸化的影响。
图4
图4
氨基酸对mTOR细胞内定位的Rag依赖性调节。（A）HEK-293T细胞饥饿血清和氨基酸50分钟或饥饿，然后在有或无雷帕霉素的情况下用氨基酸重新刺激指定时间。然后在免疫荧光分析中处理细胞以检测mTOR（绿色），用DAPI共同染色以检测DNA含量（蓝色），并成像。80-90%的细胞显示出mTOR定位模式。（B）和（C）mTOR在表达所示shRNAs的HEK-293T细胞中的定位，并用（A）中的氨基酸剥夺和重新刺激。猛禽表达水平的免疫印迹。（D）mTOR在稳定表达RagB、Rheb1、RagB的HEK-293T细胞中的定位全球技术伙伴，或Rheb1全球技术伙伴并用（A）中的氨基酸剥夺和再刺激。
图5
图5
氨基酸促进mTOR定位到Rab7-阳性隔间，该隔间也含有Rheb。（A）mTOR和Rab7在被氨基酸剥夺或刺激的细胞中的定位。瞬时转染dsRed-Rab7 cDNA的HEK-293T细胞在50分钟内缺乏血清和氨基酸，如有指示，则用氨基酸刺激10分钟。然后处理细胞检测mTOR（绿色）、Rab7（红色）和DNA含量（蓝色），并成像。显示了在氨基酸存在下mTOR定位的两个示例。（B）稳定表达RagB的HEK-293T细胞GTP公司并瞬时转染dsRed-Rab7的cDNA，按（a）处理和处理。（C）Rheb1和Rab7在被氨基酸剥夺或刺激的细胞中的定位。瞬时转染1–2 ng GFP-Rheb1和dsRed-Rab7 cDNA的HEK-293T细胞按（A）处理，处理后检测Rheb2（绿色）、Rab7（红色）和DNA含量（蓝色），并成像。（D）Rag GTPases在向mTORC1发送氨基酸可用性信号中的作用模型。
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中的注释

  • mTOR复合物1活性的溶酶体裂解。
    亚伯拉罕RT。 亚伯拉罕RT。 单元格元数据。2010年5月5日；11(5):341-2. doi:10.1016/j.cmet.2010.04.010。 单元格元数据。2010 PMID：20444413

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