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癌症研究。作者手稿；PMC 2016年5月15日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症研究2015年5月15日；75(10): 2061–2070.
2015年4月2日在线发布。 数字对象标识：10.1158/0008-5472.CAN-14-2564
预防性维修识别码：项目经理4467991
NIHMSID公司：NIHMS673350标准
PMID：25836719

KIT在胃肠道间质瘤中激活MET信号的药理抑制作用

诺亚·A·科恩,1 单曾,1 阿德里安·塞弗特,1 特蕾莎·S·金,1 埃里克·索伦森,1 乔纳森·格里尔,1 迈克尔·贝克曼,1 胡安·A·桑塔玛利亚·巴里亚,1 梅根·H·克劳利,1 本杰明·L·格林,1 费迪南德·罗西,1 彼得·贝斯默,2 克里斯蒂娜·安东尼斯库,三和罗纳德·德马特奥1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的成人肉瘤，致癌因素通常是KIT或PDGFRA突变。虽然GIST最初通常对伊马替尼或其他酪氨酸激酶抑制剂敏感，但耐药性通常会形成必要的备用治疗策略。在本研究中，我们确定获得伊马替尼耐药的人类GIST样本子集获得了MET癌基因激活形式的表达。在GIST小鼠模型（KitV558del/+小鼠）中，伊马替尼治疗后MET激活也发生了，MET激活与肿瘤缺氧增加有关。体外伊马替尼治疗后，伊马替尼敏感性人GIST细胞系中也出现MET活化。克里佐替尼或RNA干扰对MET的抑制对伊马替尼耐药的人GIST细胞群具有细胞毒性。此外，在伊马替尼敏感的GIST模型中，联合克唑替尼和伊马替尼比单独伊马替尼更有效。最后，卡波坦丁尼是一种双重MET和KIT小分子抑制剂，在伊马替尼敏感性和伊马替尼耐药性GIST的多个临床前模型中，其疗效明显优于伊马替宁。总之，我们的研究结果表明，KIT抑制激活代偿MET信号可能有助于肿瘤抵抗。此外，我们的工作为卡波坦尼抑制MET作为GIST治疗的有效策略提供了临床前概念证明。

关键词：MET，KIT，胃肠道间质瘤，靶向治疗

简介

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的肉瘤，发生于整个胃肠道(1,2). 多达80%的GIST在配套元件原癌基因，编码受体酪氨酸激酶（RTK）KIT(三). 大约5-10%的GIST含有激活突变PDGRA公司原癌基因，编码血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）(4). 另有5-10%的GIST在两种基因中都没有突变配套元件或PDGFRA公司，其中一些缺乏琥珀酸脱氢酶(5).

手术切除是局限性原发性GIST的主要治疗方法。历史上，高达50%的患者在初次切除后发生肿瘤复发，最常见于肝脏或腹膜表面，复发后的中位生存期不到2年(6). 不幸的是，GIST对传统的细胞毒性化疗和放疗反应不佳(7). 用小分子抑制剂甲磺酸伊马替尼（Gleevec；诺华）靶向治疗KIT和PDGFRαRTK，彻底改变了GIST治疗(2). 高达80%的转移性GIST患者用伊马替尼治疗后获得部分缓解或病情稳定(8). 然而，伊马替尼很少有疗效，最初对伊马替尼敏感的肿瘤在2年内获得耐药性(9,10). A次级配套元件突变约占获得性伊马替尼耐药病例的一半(11). 或者，配套元件在一小部分伊马替尼耐药肿瘤中检测到扩增和过度表达(12). 额外RTK的上调已被证明发生在体外在伊马替尼培养的人GIST细胞系中，直到产生耐药性。抑制这些上调的RTK具有细胞毒性，表明激酶转换可能导致伊马替尼耐药(13,14). 激酶转换尚未演示体内伊马替尼失败后，剩下的治疗选择很少。舒尼替尼（Suntent；Pfizer）和雷戈拉非尼（Stivarga；Bayer）是多激酶抑制剂，为伊马替尼耐药肿瘤患者提供暂时益处，进展的中位时间为4.8至6.8个月(15,16). 因此，迫切需要确定GIST耐药性的其他组成部分和新的治疗方法。

RTK MET是遇见原癌基因，对胚胎发生和伤口愈合至关重要，也与肿瘤发生、肿瘤血管生成和转移有关(17).遇见在多种癌症中发现过表达，包括胃癌、结直肠癌、胰腺癌和黑色素瘤，以及遇见发生于肾癌、肺癌、卵巢癌和结直肠癌(18). MET的激活也被证明在非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌和结直肠癌中产生耐药性(19–21). 缺氧加剧遇见通过缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与遇见启动子并通过使受体对配体刺激敏感来增加MET受体的激活(22). 肝细胞生长因子（HGF）连接MET可激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Janus激酶、信号转导子和转录激活子（JAK-STAT）以及Src信号转导通路(17)，所有这些都是KIT的下游。

而半数伊马替尼耐药肿瘤含有继发性配套元件突变，伊马替尼耐药性的其他机制需要进一步阐明。在本研究中，我们试图确定是否有其他RTK被激活体内在GIST中。使用磷酸化RTK阵列，我们发现MET在伊马替尼耐药的人类GIST细胞系中被激活，并在多个高级人类GIST标本中验证了这一点。此外，我们发现伊马替尼增加了激活MET在伊马替尼敏感性人类GIST细胞系和GIST基因工程小鼠模型中的表达。我们确定伊马替尼耐药细胞系依赖MET生存，并用小分子抑制剂克里唑替尼（Xalkori；辉瑞）靶向MET(23)或用siRNA特异性MET敲除是细胞毒性的。我们还显示了双重KIT/MET抑制剂卡波坦丁尼（Cometriq；Exelixis）(24)或者在多个GIST临床前模型中，伊马替尼和克里佐替尼联合使用比单独使用伊马替尼更有效。综上所述，我们的研究结果表明，MET激活发生在GIST中，MET上调可能有助于伊马替尼耐药体内此外，靶向MET是治疗伊马替尼敏感和耐药GIST的一种有希望的策略。

方法

小鼠和治疗

年龄和性别匹配配套元件V558del版/+(25)，节点。Cg公司-Prkdc公司科学情报部Il2rg公司tm1Wjl公司/使用SzJ（NSG）和C57BL/6J（B6）小鼠（Jackson实验室）。所有程序和治疗均由我们的机构动物护理和使用委员会批准。对于异种移植实验，106将PBS中的GIST-T1、HG129或HG209细胞与BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced（BD Biosciences）1:1混合，并皮下注射到NSG小鼠的右侧。使用改进的椭球体公式（1/2×长×宽×高）测量异种移植瘤，当平均肿瘤体积达到约100 mm时开始治疗三Imatinib、sunitinib和crizotinib购自LC实验室。服用伊马替尼（饮用水中600 mg/L）、舒尼替尼（每日灌胃53.6 mg/kg）、克雷唑替尼（每日60 mg/kg）和卡波佐丁尼（每日50 mg/kg，ChemieTek）。对照组小鼠定期饮用水并灌胃给药。

细胞系、细胞活力和信号分析以及磷酸化RTK阵列

已经描述了GIST882、GIST-T1和HG129细胞系(26–28). HG209人GIST细胞系是根据IRB批准的方案建立的。HG209来源于伊马替尼和舒尼替尼耐药的腹膜转移瘤，其中含有配套元件外显子11缺失（Y570-L576）和a配套元件外显子17点突变（c.2446 c>G p.D816H）。Western blot证实KIT和ETV1在所有细胞系中的表达，并且配套元件测序证实突变。细胞在含有RPMI 1640和10%胎牛血清、2mM/L L-谷氨酰胺、50单位/mL青霉素-链霉素和10mM/L Hepes的完全培养基中培养。测量生存能力，2×104GIST882细胞或104将GIST-T1、HG129或HG209细胞分5个重复接种在96周的平底培养板（Falcon）中，并与伊马替尼、克氏菌素、卡波坦丁尼、HGF 100 ng/mL或H培养72小时2O或DMSO溶剂控制。按照制造商的说明，使用比色四氮唑盐分析法（细胞计数试剂盒-8，Dojindo分子技术公司）测量存活率，并将所有值归一化为对照值。药物IC50使用Prism 6.0（GraphPad软件）中的非线性回归确定值。用于蛋白质分析，4×106细胞接种在100×20mm的无血清培养皿（Falcon）中。用伊马替尼或H处理细胞2O或DMSO溶剂。对于人类磷酸化RTK阵列，GIST882、HG129和HG209细胞被血清饥饿3h，收集细胞裂解物，并使用人类磷酸受体酪氨酸激酶阵列试剂盒（R&D Systems）分析250µg蛋白质。使用ImageJ（NIH）测量所有阳性信号的像素密度，并减去背景信号。报告了重复信号的像素密度平均值±SEM。

定量实时PCR

总RNA提取自配套元件V558del版/+小鼠肿瘤或人GIST细胞，逆转录，并用PCR TaqMan探针扩增小鼠遇见（Mm01156972_ml），老鼠Hif1a型（Mm00468869_ml），人类遇见（Hs01565584_ml）和GAPDH公司（应用生物系统）。使用ViiA™7实时PCR系统（Applied Biosystems）进行定量PCR。数据由2-ΔΔCt方法如制造商协议所述，并表示为所示对照组的倍数增加。

MET击倒

对于短暂MET敲除，GIST882、GIST-T1和HG209细胞转染30 nM ON-TARGET加SMARTpool siRNA（人类MET特异性L-003156-00）或非靶控siRNA（D-001810-01-05）（Thermo Scientific），使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）转染48或96小时。然后用H处理GIST882细胞2O对照或伊马替尼48小时。测量细胞活力，并将其归一化为经载体处理的非靶控siRNA转染细胞。

人体标本和蛋白质印迹

如前所述，对速冻GIST组织或细胞系中的蛋白质进行分析(29). 手术标本中的肿瘤块取自36名GIST患者，他们同意按照机构审查委员会协议进行组织分析。使用抗体对抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、总MET（25H2）总和磷酸化KIT（Tyr719）、AKT（Ser473）、STAT3（Ser727）、ERK1/2（Thr202/Tyr204）、Src（Tyr 416）、Gab1（Tyr307，全细胞信号技术）和pMET（Try1240/1234/1235，生命技术）。

流式细胞术

流式细胞术分析配套元件V558del版/+小鼠肿瘤和以前一样(28). 在FACSAria（BD Biosciences）上对所有细胞进行分析。小鼠特异性抗体包括来自eBioscience的CD45（克隆30-F11）和Met（eBioclone 7），以及来自BD Bioscinces的Kit（CD117；2B8）、大鼠IgG2aκ同型（R35-95）和大鼠Ig G1κ同型（R3-34）。

HGF测量

配套元件V558del版/+使用Quantikine ELISA小鼠/大鼠HGF试剂盒（R&D Systems），通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定小鼠血清、肿瘤和肝脏以及B6小鼠血清HGF浓度。

组织学

将肿瘤固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并切割成5µm的切片。如前所述，对KIT（Cell Signaling Technology#3074；1:200）、Ki67（Vector Laboratories#VP-K451；1:1000）和CD31（Abcam#ab28364；1:50）进行免疫染色(29). 肿瘤内缺氧是在处死肿瘤细胞前1小时通过静脉注射吡莫硝唑（60 mg/kg，Hypoxyprobe-1）检测的配套元件V558del版/+老鼠。在用CC1缓冲液（Ventana）提取抗原并用Background Buster溶液（Innovex）封闭30分钟后，使用Discovery XT处理器（Ventna Medical Systems）使用脱蜡组织切片检测吡莫达唑。以0.12µg/ml的浓度应用抗-莫诺唑小鼠单克隆抗体（Hypoxyprobe Inc.），并将切片孵育5h，然后用生物素化马-抗-小鼠IgG（Vector Labs，cat#MKB-22258）以1:200的稀释度孵育1h，然后使用链霉亲和素-HRP D（DABMap试剂盒的一部分，Ventana），然后用Tyramide Alexa Fluor 488（Invitrogen，猫#T20922号). 对载玻片进行复染，并在Axio2 Imaging宽视场显微镜（Zeiss）上进行分析。

统计分析

使用Prism 6.0（GraphPad软件）分析数据。未配对双尾学生t吨-如适用，进行测试或带Tukey多重比较校正的单向方差分析。当p<0.05时，数据被认为是显著的。

结果

MET在人类GIST的一个子集中被激活

我们试图确定伊马替尼耐药GIST中激活的其他RTK，并可能作为治疗靶点。我们通过阵列检测了未经治疗的伊马替尼敏感人类GIST细胞系GIST882和HG129以及来自伊马替尼可抵抗肿瘤患者的HG209细胞系中的49个磷酸化酪氨酸激酶。HG209显著降低活化KIT和PDGFRα的表达，升高活化MET和AXL的表达(图1A). 此外，HG209激活的EGFR略有增加。其他受体酪氨酸激酶未表达，包括VEGFR2、Tie-2、RET、ALK和FGFR1-4。定量PCR证明遇见与伊马替尼敏感细胞（GIST882、GIST-T1和HG129）相比，伊马替尼耐药性HG209细胞系中的mRNA也升高(图1B). 通过western blot，与GIST882细胞相比，HG209细胞系的活化和总KIT较少，但活化和总MET较高(图1C).

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MET在人类GIST的一个子集中被激活

(A类)未经处理的GIST882、HG129和HG209细胞的磷酸RTK阵列密度测定。*，p<0.05，方差分析。(B类)定量RT-PCR遇见相对于GIST-T1细胞，伊马替尼敏感（敏感）和伊马替尼耐药（耐药）人类GIST细胞系中的mRNA表达。*，p<0.05，t吨-测试。(C类)GIST882和HG209细胞系的Western blot。(D类)未经处理（UT）、敏感（Sens.）或耐药的人类GIST标本的Western blot。使用Miettinen分类法计算原发性胃GIST的临床风险评分(42). 提示来源于HG209细胞系的肿瘤标本(↑). (E类)Western blot和pMET:MET像素密度测定法，对使用对照药物或伊马替尼0.5µM治疗24小时的人GIST细胞系进行测定，代表3个独立实验。对于A、 C和E，细胞保存在无血清培养基中。棒材，平均值±SEM。

为了确定人类GIST中激活MET表达的频率，我们对一组手术标本进行了western blot。我们发现，MET在一些未经治疗的原发性GIST、一种伊马替尼敏感肿瘤和一些伊马替尼耐药性肿瘤中被激活(图1D)包括来源于HG209细胞系的原始肿瘤。在我们进一步检测的36例人类GIST标本中，20例（56%）表达激活的MET：12例未治疗中的4例，10例伊马替尼敏感中的7例，14例伊马替尼耐药肿瘤中的9例（数据未显示）。MET激活存在于一些胃和非胃GIST以及一些配套元件外显子11和PDGFRA公司突变肿瘤（数据未显示）。我们分析了6个伊马替尼耐药标本中的KIT信号，发现其中4个标本中激活的KIT表达较低，而激活的MET表达较高，这增加了这些肿瘤现在依赖MET而非KIT生存的可能性(图1D). 在其他癌症中，MET可以通过多种机制激活，包括过度表达、扩增或突变(30). 使用FISH分析，我们无法发现遇见肿瘤标本或HG209衍生细胞系的拷贝数变化（数据未显示），尽管其高度表达遇见mRNA并激活MET。桑格测序遇见对HG209细胞系进行DNA检测，未发现任何突变（数据未显示）。

为了证实伊马替尼治疗可诱导MET激活，正如70%的伊马替尼敏感性人类标本中所观察到的那样，我们对伊马替宁敏感人类GIST细胞系GIST882、GIST-T1和HG129进行了治疗。MET在每个细胞系中被激活(图1E). 总的来说，MET在一些人类GIST的基线和对伊马替尼的反应或耐药性期间被激活。

KIT抑制在GIST小鼠模型中诱导MET激活

配套元件V558del版/+小鼠形成一个单一的肠道GIST，最初对伊马替尼治疗有反应，然后随着KIT的持续激活，其大小保持稳定，并在停止治疗后再生(28). 我们治疗过配套元件V558del版/+小鼠确定MET是否激活体内伊马替尼治疗后。的确，遇见伊马替尼治疗延长后信使核糖核酸表达增加(图2A). 虽然载体治疗无法检测到激活的MET，但伊马替尼延长治疗可增加活化的MET表达(图2B). 生长因子受体结合蛋白2（GRB2）相关结合蛋白1（GAB1）(31)是MET的一个关键下游对接蛋白，在伊马替尼治疗后也被磷酸化，与激活的MET一致，表明MET信号传导活跃。为了确定MET激活是否对伊马替尼治疗特异，我们对配套元件V558del版/+使用舒尼替尼的小鼠再次发现更多活化的MET(图2C). 为了确定哪些细胞群表达MET，我们对配套元件V558del版/+小鼠肿瘤。我们发现MET在大约一半的肿瘤细胞[CD45上表达−配套元件+]基质细胞[CD45低表达−配套元件−]和免疫细胞[CD45+] (图2D).

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KIT抑制在GIST小鼠模型中诱导MET激活

(A类)配套元件V558del版/+用载体或伊马替尼治疗小鼠遇见定量RT-PCR检测mRNA表达。n=每组4-5只小鼠。*，p<0.05，t吨-测试。(B、 C类)配套元件V558del版/+用载体、伊马替尼或舒尼替尼治疗小鼠。(D类)MET表达的代表性FACS直方图（蓝色）与肿瘤内CD45的同型（实心灰色）（左侧）和MET阳性百分比（右侧）的比较+，CD45−配套元件−和CD45+配套元件+未经处理的细胞配套元件V558del版/+小鼠肿瘤。*，p<0.05，方差分析。(E类)配套元件V558del版/+用载体或伊马替尼治疗小鼠2周，用ELISA测定肿瘤HGF浓度，并与载体治疗的小鼠进行比较配套元件V558del版/+小鼠肝脏。*，p<0.05，t吨-测试。(F类)配套元件V558del版/+对小鼠肿瘤进行治疗Hif1a型定量RT-PCR检测mRNA表达。n=每组4-5只小鼠。*，p<0.05，t吨-测试。(G公司)配套元件V558型号/+给小鼠治疗4周，然后在处死前1小时注射吡莫硝唑。肿瘤的典型免疫荧光图像。绿色，吡莫硝唑。蓝色，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）。比例尺，100µM。n=每组4只小鼠。棒材，平均值±扫描电镜。

在骨肉瘤和胶质母细胞瘤模型中，MET的配体依赖性自分泌和旁分泌激活已被描述(32). 为了确定伊马替尼治疗是否通过增加HGF生成而激活MET，我们测量了配套元件V558del版/+肿瘤。基线时HGF的肿瘤浓度较高（与肝脏相比），但伊马替尼没有改变(图2E). 同样，伊马替尼也不影响配套元件V558del版/+小鼠，与未经治疗的B6小鼠相似（数据未显示）。

低氧是公认的遇见表达MET受体并使其对HGF刺激敏感(22). 确定是否配套元件V558del版/+伊马替尼治疗后肿瘤缺氧，我们对其进行定量RT-PCRHif1a型伊马替尼治疗的肿瘤增加Hif1a型mRNA表达与车用治疗肿瘤的比较(图2F). 为了证实我们的RT-PCR发现，我们注射了配套元件V558del版/+吡莫硝唑在缺氧组织中蓄积的小鼠(33).配套元件V558del版/+伊马替尼治疗肿瘤4周后，与车辆治疗的肿瘤相比，吡莫硝唑染色显著增加(图2G). 因此，我们决定配套元件V558del版/+伊马替尼治疗的小鼠肿瘤缺氧遇见mRNA过度表达，MET被激活。

MET抑制增强伊马替尼对人GIST细胞株的作用

为了进一步确定MET在HG209细胞中表达的作用，我们用HGF刺激它们。与GIST882和GIST-T1细胞不同，HGF对伊马替尼耐药的HG209细胞系具有强大的促有丝分裂作用(图3A)提示MET可能是GIST中重要的促生存信号。接下来，我们用环唑替尼靶向MET，环唑替尼是一种小分子抑制剂，对MET、间变性淋巴瘤激酶（ALK）和ROS（ROS1）具有强效活性(34). Crizotinib在抑制HG209细胞增殖方面比伊马替尼更有效(图3B). MET对HG209存活的重要性通过选择性敲除MET进一步得到证实，MET显著降低细胞活力(图3C左侧面板）。western blot证实MET敲除，表明MET成熟的145-kDaβ亚基减少(图3C右侧面板）。综上所述，HG209伊马替尼耐药细胞系具有低水平的活化KIT，但高表达活化MET，其生存能力因MET抑制而降低。

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MET抑制增加伊马替尼在人GIST细胞系中的作用

(A类)用溶媒或HGF 100 ng/mL处理72小时后，血清缺乏的人GIST细胞系的细胞活力*，p<0.05，t吨-测试。(B类)在指定浓度下用伊马替尼或克雷佐替尼处理的HG209人GIST细胞系的细胞活力。使用非线性回归，IC50测定HG209的伊马替尼和克里佐替尼值（>1000 nM vs.109 nM）。(C类)用非靶控siRNA（Neg siRNA）或ON-target加SMARTpool siRNA（MET siRNA）转染HG209细胞。显示转染后72小时的细胞活力。*，p<0.05，t吨-测试。Western blot显示MET击倒效率。(D类)无菌水对照（CTRL）、HGF 100 ng/mL或伊马替尼50 nM（IM）处理GIST882细胞72小时后的细胞存活率*，p<0.05，t吨-测试。(E类)用二甲基亚砜对照（CTRL）、克里唑替尼（Criz）或伊马替尼（IM）处理72小时后的人GIST细胞系的存活率*，p<0.05，方差分析。(F类)用非靶控siRNA（Neg siRNA）或ON-target加SMARTpool siRNA（MET siRNA）转染GIST882和GIST-T1细胞。然后用无菌水对照或伊马替尼0.1µM处理GIST882细胞48小时，用无菌水对照或伊马替尼0.05µM处理GIST-T1细胞48小时，并测量细胞活力。*，p<0.05，t吨-测试。Western blot显示MET击倒效率。(G公司)如图所示，将已建立HG129 s.q.异种移植物的NSG小鼠治疗42天。*，p<0.05，t吨-测试。n=每组4-5只小鼠。数据来自B、 C、D、E和F代表了≥3个独立实验。棒材，平均值±SEM。

为了确定激活MET表达在伊马替尼敏感细胞系中的重要性，我们用HGF刺激GIST882细胞。正如HGF在HG209细胞上有丝分裂(图3A)，伊马替尼治疗后，HGF对伊马替尼敏感性GIST882细胞也有丝分裂(图3D)，与MET上调一致。因此，MET信号可以从伊马替尼中拯救细胞。重要的是，经伊马替尼或对照处理24小时的GIST882、GIST-T1和HG129细胞，通过培养上清液ELISA测定，未产生HGF（数据未显示）。

由于MET激活能够从伊马替尼治疗中拯救伊马替尼敏感细胞，并且MET抑制在表达高水平激活MET的伊马替宁耐药细胞系中有效，因此我们测试了克里唑替尼对MET的抑制在伊马替妮敏感GIST中是否具有细胞毒性。伊马替尼中添加克唑替尼显著降低伊马替尼敏感细胞系的细胞活力(图3E). 为了证实克里唑替尼的抗肿瘤作用是通过MET抑制特异性介导的，我们对MET进行了选择性敲除。伊马替尼治疗MET致敏GIST882和GIST-T1细胞的敲除(图3F左面板），概述克里唑替尼和伊马替尼联合治疗的效果。western blot证实MET敲除(图3F右侧面板）。

将这些发现转化为体内在模型中，我们用克唑替尼和伊马替尼治疗携带已建立的HG129人GIST异种移植物的NSG小鼠。Crizotinib增加了伊马替尼的疗效，与单独使用伊马替尼比，肿瘤体积更小（平均肿瘤体积368 mm vs.775 mm三，p<0.05）(图3G). 总之，伊马替尼治疗后MET激活具有促生存作用，MET抑制增强了伊马替尼效在体外在人类异种移植模型中。

MET抑制增加伊马替尼在配套元件V558del版/+老鼠

接下来，我们研究了MET抑制是否增强了伊马替尼治疗的反应配套元件V558del版/+老鼠。联合伊马替尼和克里唑替尼治疗2周的肿瘤小于单独伊马替尼治疗的肿瘤（平均肿瘤重量57 mg对78 mg，p<0.001）(图4A). 为了进一步研究双重抑制的作用，我们分析了MET和KIT信号。与单独使用伊马替尼治疗的肿瘤相比，MET和KIT联合抑制显著降低磷酸化KIT和MET及其下游介质STAT3、AKT和ERK1/2(图4B). 免疫组织化学分析显示联合治疗后KIT和细胞增殖显著下降(图4C). 相反，克里唑替尼单药治疗对肿瘤大小、KIT免疫染色、细胞增殖或活化的KIT及其下游介质没有影响。在整个治疗期间，小鼠没有表现出毒性迹象，体重保持不变。

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MET抑制增加伊马替尼在配套元件V558del版/+老鼠

配套元件V558del版/+用载体（Veh）、伊马替尼（IM）或克里唑替尼（Criz）治疗小鼠2周，然后(A类)对肿瘤进行称重(B类)受到西方印迹的影响，以及(C类)KIT和Ki67的免疫染色。比例尺，100µM。数据代表了2个独立实验，每组5–7只小鼠。棒材，平均值±SEM.*，p<0.05。

Cabozantini是一种双重MET和KIT小分子抑制剂，对多种GIST临床前模型有效

为了验证MET和KIT双重抑制增加的抗肿瘤效果，我们测试了卡波金汀尼，一种批准用于甲状腺髓样癌的小分子抑制剂，对KIT、MET、VEGFR2、RET、AXL、TIE-2和FLT3具有活性(24,35). 在对伊马替尼敏感的人GIST细胞系GIST882、GIST-T1和HG129中，卡波坦丁尼比伊马替尼能更有效地降低细胞活力(图5A). 在伊马替尼耐药的HG209细胞中，卡波坦尼在纳米摩尔浓度下也具有细胞毒性。我们测试了这些发现体内已建立的皮下HG129或HG209异种移植物。正如我们之前观察到的那样，伊马替尼仅在HG129肿瘤中获得稳定的疾病(28)而卡波坦丁尼在引起肿瘤消退方面非常有效(图5B)（平均肿瘤体积：载体728，伊马替尼313，卡波坦丁尼37 mm三，p<0.05，t吨-测试）并减少KIT和Ki67染色(图5C). 同时，对伊马替尼耐药的HG209异种移植物对卡博扎替尼有着令人印象深刻的反应，肿瘤体积缩小(图5D)（平均肿瘤体积：载体2131，伊马替尼2560，卡波坦丁尼104 mm三，p<0.05，方差分析）和Ki67染色(图5E). 最后，我们给卡波坦丁尼配套元件V558del版/+老鼠。与伊马替尼相比，卡博扎丁尼治疗的肿瘤在2周时较小(图5F)（平均肿瘤重量：载体197，伊马替尼72，卡波坦丁尼33 mg，p<0.0001，t吨-试验），KIT染色和细胞增殖较少，CD31染色测量的血管较少(图5G). 用卡波坦丁尼治疗8周的肿瘤实际上完全缺乏KIT和Ki67染色(图5H). 综上所述，在伊马替尼敏感性和伊马替尼耐药性GIST的多个临床前模型中，卡波佐丁尼表现出比伊马替宁更大的抗肿瘤作用。

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Cabozantini是一种双重MET和KIT小分子抑制剂，对多种GIST临床前模型有效

(A类)伊马替尼或卡波坦丁尼在指定浓度下处理的人GIST细胞系的存活率。使用非线性回归，IC50计算伊马替尼和卡博替尼在GIST882（80对30 nM）、GIST-T1（37对15 nM）和HG129（38对14 nM）细胞中的值，以及卡博替尼在HG209（10 nM）细胞中的值。(B–E类)将已建立HG129或HG209皮下异种移植瘤的NSG小鼠治疗15天。显示了肿瘤的代表性大体外观（比例尺，1 cm）、肿瘤生长曲线以及代表性KIT和Ki67免疫组织化学（比例栏，100µM）。n=3-9只/组。(F类)配套元件V558del版/+给小鼠治疗2周，然后称重肿瘤（G）KIT、Ki67和CD31染色（代表性图像，比例尺，100µM）。n=每组6-7只小鼠。（H） 配套元件V558del版/+对小鼠进行8周的治疗，并对肿瘤进行KIT和Ki67染色（代表性图像，比例尺，100µM）。n=2只/组。数据来自A、 F类和G公司是3个独立实验的代表。棒材，平均值±SEM.*，p<0.05。

讨论

以酪氨酸激酶为靶点的小分子抑制剂的出现给癌症治疗带来了革命性的变化，然而治愈仍然很难，获得对现有药物的耐药性是常见的。在这里，我们发现MET激活可能发生在未经治疗的GIST、对伊马替尼的反应期间以及伊马替尼耐药性期间。虽然我们在一些未经治疗的人类原发性胃GIST中发现了MET激活，但在未经治疗的肿瘤中并不存在配套元件V558del版/+因此我们无法评估其对肿瘤生存能力的贡献。然而，MET活化是在配套元件V558del版/+伊马替尼治疗数周后的小鼠及其对生存的重要性通过伊马替尼加克里唑替尼联合治疗的抗肿瘤作用的增强而明显。大多数对伊马替尼耐药的人GIST也表现出MET激活，我们获得了一种肿瘤生存所必需的MET细胞系在体外以及在小鼠异种移植物中。有趣的是，肿瘤有继发性配套元件突变，已知存在于一半以上的耐药肿瘤中(11). 然而，原始肿瘤标本和衍生细胞系的KIT活性较低。因此，似乎在这些肿瘤细胞中发生了“激酶转换”。然而，应该注意的是，激活的MET的存在并不能确保对MET抑制剂的敏感性，因为其他途径可能被激活。

激酶转换在其他肿瘤中被描述为对靶向治疗的反应。表皮生长因子受体突变的非小细胞肺癌显示遇见在吉非替尼治疗的反应中发生扩增，并驱动ERBB3依赖性PI3K信号的激活(19). Johannessen等人以类似的方式报道，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一个成员大阪甲状腺癌（COT）激活了BRAF-突变黑色素瘤中的MAPK通路，从而介导vemurafenib耐药性(36). 通过多个RTK进行补偿似乎没有必要，因为我们的磷酸化RTK阵列显示，未经治疗的伊马替尼敏感细胞株和伊马替尼耐药性HG209细胞株之间除了活化MET增加外，几乎没有信号变化。补偿信号以前在GIST中已被发现，但仅在伊马替尼培养的细胞系中发现，而在人体标本或小鼠模型中未发现。伊马替尼耐药GIST-T1亚克隆显示FYN和黏着斑激酶（FAK）磷酸化增加(13). 同时，伊马替尼耐药GIST882亚克隆降低了磷酸化KIT和AXL及MET的过度表达(14). 补偿信号可能在一定程度上解释了为什么GIST等肿瘤成瘾肿瘤在药物抑制驱动癌基因后不会完全退化。事实上，我们最近报道，尽管小分子PLX3397是一种比伊马替尼更有效的KIT抑制剂（IC508 nM对42 nM（GIST-T1细胞），在配套元件V558del版/+即使在19周的治疗后(28). 更强的KIT抑制可能会导致患者产生更大的全身毒性。因此，亚最大限度地抑制KIT和额外的补偿性激酶信号可能是更好的治疗策略。

之前已经证明HIF-1α激活遇见启动子，在缺氧期间导致转录增加(22). 我们在配套元件V558del版/+延长伊马替尼治疗后，由于吡莫尼唑免疫染色和Hif1a型mRNA。尽管如此，即使在伊马替尼治疗4周后，CD31免疫染色测定的肿瘤内微血管密度也没有降低。伊马替尼诱导小鼠缺氧的机制配套元件V558del版/+目前尚不清楚老鼠。其他模型已经证明MET通过增加HGF的自分泌或旁分泌而激活(32). 虽然我们检测到肿瘤内高水平的HGF配套元件V558del版/+尽管Pennacchietti等人在低氧环境下发现MET受体的敏感性增加，但伊马替尼并未改变小鼠肿瘤(22). 值得注意的是，用伊马替尼治疗的伊马替尼敏敏细胞株增加了活化MET的表达，但不产生HGF。此外，伊马替尼敏感细胞系在伊马替尼治疗后1小时内增加了MET活化，这表明除缺氧外，MET活化可能还有其他机制，至少在体外.在我们的配套元件V558型号/+小鼠模型，我们假设缺氧有助于MET激活体内然而，可能有多种途径导致MET活化，其机制尚待完全阐明。尽管遇见伊马替尼治疗后的转录，western blot未检测到更多的MET总蛋白。然而，MET激酶结构域中酪氨酸残基（Tyr1230、Tyr123和Tyr125）的磷酸化与活化GAB1的同时表达一样明显，表明MET信号是活跃的。KIT和MET均激活PI3K、MAPK和JAK-STAT信号转导通路，因此无法轻易确定KIT或MET抑制对这些信号通路的选择性作用。然而，伊马替尼和克里唑替尼联合治疗配套元件V558del版/+小鼠对这些下游介质的抑制作用比KIT或MET单独的抑制作用更强。

除缺氧或对配体刺激敏感性增加外，GIST中MET激活增加的其他可能机制包括遇见扩增和突变。在EGFR-mutated NSCLC中，遇见扩增已被证明通过MET/EGFR串扰介导抗EGFR治疗的耐药性(19). 在EGFR抑制的基础上添加MET抑制剂似乎是安全和可耐受的，并可能改善临床结果(37). 伊马替尼耐药HG209人GIST细胞系中激活的KIT表达水平较低，伊马替尼可治疗后伊马替宁敏感细胞中激活的KIT减少，表明MET和KIT不直接相互作用。的细胞外sema结构域和膜旁结构域的突变遇见发现于非小细胞肺癌、间皮瘤、肾癌和黑色素瘤(30). Xu等人对125个GIST样本进行了基因测序，并检测到遇见16.8%的样本发生错义突变(38). 然而，在我们的细胞系中，我们没有检测到遇见扩增或突变。

在我们的伊马替尼敏感性和伊马替尼耐药性GIST的多个临床前模型中，卡波佐丁尼显示出深刻的抗肿瘤作用。Van Looy及其同事在2013年结缔组织肿瘤学学会的一张海报上展示了卡博扎尼在伊马替尼敏感的人GIST异种移植物中增强的抗肿瘤效果。此外，计划在EORTC临床试验中对难治性GIST进行卡波坦尼测试。我们观察到的深度抗肿瘤作用的机制可能是多因素的。由于伊马替尼和克里唑替尼联合治疗有效，MET抑制似乎有助于提高卡波坦丁尼的疗效。众所周知，卡波坦丁尼是一种比伊马替尼（IC）更有效的KIT抑制剂505 nM对100 nM）(24,39). 事实上，卡波坦丁尼的长期治疗配套元件V558del版/+小鼠头部和面部出现毛发脱色，表明KIT具有强大的抑制作用，因为KIT是黑素细胞发育所必需的(40). 这与PLX3397治疗后观察到的色素脱失相似，但要少得多(28). 鉴于卡波坦尼抑制MET、VEGFR2和TIE-2，因此可能具有抗血管生成作用。人类GIST具有很强的血管性，高微血管密度与肿瘤大小、有丝分裂计数、VEGF表达和细胞增殖增加有关，是预后不良的标志(41).配套元件V558del版/+与伊马替尼和伊马替尼加克里唑替尼联合治疗相比，卡波坦丁尼治疗的小鼠肿瘤微血管密度较低。虽然卡波坦丁尼可能作用于其他激酶靶点，但我们的磷酸化RTK阵列没有识别ALK、FLT3或RET被激活。重要的是，接受卡波坦替尼（或伊马替尼和克里唑替尼联合用药）的动物没有出现毒性迹象。

因此，激活的MET似乎是伊马替尼敏感和伊马替尼耐药性GIST的重要靶点，正如多个临床前模型所证明的那样。鉴于大多数出现伊马替尼耐药性的患者最终会使用3种目前已获批准的酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼可、舒尼替尼和雷戈拉非尼，因此迫切需要额外的治疗方案，我们的研究结果具有直接的临床意义。

致谢

作者感谢Sloan Kettering研究所分子细胞学核心设施的Ke Xu、Yevgeniy Romin和Mesruh Turkekul、比较病理学实验室的成员以及Russell Holmes提供的行政支持。

给予支持

研究人员得到了NIH拨款R01 CA102613和T32 CA09501、杰弗里·比恩癌症基金会、生存周期、横渡美国、斯蒂芬妮和弗雷德·舒曼通过风车巷基金会以及大卫和莫妮卡·戈林（RPD）的支持；GIST癌症研究基金（RPD和CRA）；F32 CA162721和马萨诸塞州总医院（TSK）的Claude E.Welch奖学金；和P01 CA47179（CRA）和P50 CA140146-01（CRA-PB）。分子细胞学核心设施由癌症中心支持拨款P30-CA008748支持。

脚注

披露

作者没有经济利益冲突。

参考文献

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