《公共科学图书馆·病理学》。2012年6月；8（6）：e1002751。
晶体结构揭示了金黄色葡萄球菌ClfB公司
,#1,2 ,#1 ,1 ,三 ,1 ,1,4 ,2,*和1,*
华翔
1清华大学生命科学学院清华-北京生命科学中心教育部蛋白质科学重点实验室，北京
2吉林大学动物科学与兽医学院兽医药理学系，长春
岳峰
1清华大学生命科学学院清华-北京生命科学中心教育部蛋白质科学重点实验室，北京
王佳伟
1清华大学生命科学学院清华-北京生命科学中心教育部蛋白质科学重点实验室，北京
陈叶光
1清华大学生命科学学院清华-北京生命科学中心教育部蛋白质科学重点实验室，北京
刘雷（Lei Liu）
1清华大学生命科学学院清华-北京生命科学中心教育部蛋白质科学重点实验室，中国北京
4清华大学化学系，中国北京
徐明登
2吉林大学动物科学与兽医学院兽医药理学系，长春
杨茂军
1清华大学生命科学学院清华-北京生命科学中心教育部蛋白质科学重点实验室，北京
马克·萨珀，编辑器
1清华大学生命科学学院清华-北京生命科学中心教育部蛋白质科学重点实验室，北京
2吉林大学动物科学与兽医学院兽医药理学系，长春
三中国北京协和医院血管外科
4清华大学化学系，中国北京
美利坚合众国密歇根大学
#贡献均等。
构思和设计实验：MY。执行实验：HX YF JW BL LL。分析数据：MY HX YF JW BL LL YC XD。贡献的试剂/材料/分析工具：BL LL YC。论文写道：我的。
收到日期：2011年11月29日；2012年4月30日验收。
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- 补充资料
图S1：
单位细胞中的两个对称相关分子。A.单元细胞中两个对称相关分子的带状表示。这两个分子分别以橙色和青色显示。B.电子密度，表示一个分子的N末端与单位细胞中另一个分子G链之间的相互作用。标记N端的S197和L198，另一条的F和G股。（畅通节能法）
GUID:19A75B91-00CA-4FA0-9EC5-6B9BBB9C10A5
图S2：
Fgα和CK10肽的电子密度。A.ClfB的带状表示(208–542)-Fgα(316–328)复杂。肽显示在棒中，并且还显示了在1.5σ处绘制的肽周围的2Fo-Fc图。颜色方案与中的相同蛋白质和肽的N端和C端分别指定。B.ClfB的带状表示(208–531)-CK10型(499–512)复杂。肽以棒状显示，肽周围的2Fo-Fc图也显示为1.5σ。颜色方案与中的相同蛋白质和肽的N端和C端分别指定。（畅通节能法）
GUID:2E82897A-31E6-4A3C-A101-947988C91CAE
图S3：
ClfB的表面表示(208–540)，氯代脂肪酸(229–545)和SdrG(276–597)显示肽“锁定”在分子中。表面根据以红色和蓝色表示的负电荷和正电荷残留物进行颜色编码。肽显示为棒状。（A） ，ClfB-Fgα(316–328).（B），ClfB-CK10(499–512).（C），ClfA-Fgγ(395–411).（D），SdrG-Fgβ(6–20).（畅通节能法）
GUID:37281A54-4C1A-41AC-8C60-7E03DADFD1A2
图S4：
显示Fgγ肽与ClfA之间相互作用的卡通视图。碳、氧和氮原子分别以青色、红色和蓝色显示。肽的残留物显示为洋红色的棒状物。ClfA残留物用黑色标记，Fgγ残留物则用洋红色显示。氢键用红色虚线表示。（畅通节能法）
GUID:EACE56FB-BA27-49C8-B2DE-BEA435036E74
图S5：
ClfB配体结合隧道的近景。A、 肽的N末端。ClfB表示为静电表面模型，负电荷和正电荷分别用红色和蓝色表示。Fgα肽叠加在CK10肽上，它们分别显示为蓝色和黄色的棒状物。B、 肽的C末端。颜色方案与中的相同图S5A.（畅通节能法）
GUID:6BE19874-9C9B-44BD-AE73-C6CF3DAA6F62
图S6：
配体结合的详细相互作用。A.ClfB-CK10复合物中ClfB配体结合隧道的近景。ClfB表示为静电表面模型，负电荷和正电荷分别用红色和蓝色表示。CK10肽显示为黄色棒状。氢键用红色虚线表示。B.ClfB和CK10肽之间氢键相互作用的示意图。氢键显示为虚线。与CK10的相互作用来自N3域的链G，来自ClfB中N2域的AB-和CD-环。C.ClfB-Fgα复合物中ClfB配体结合隧道的近景。颜色方案与中的相同图S6A氢键用红色虚线表示。D.ClfB和Fgα肽之间氢键相互作用的示意图。氢键显示为虚线。与Fgα的相互作用来自N3结构域的链G，以及ClfB中N2结构域的AB-和CD-环。（畅通节能法）
GUID:97FE3C05-756A-4871-BEBF-FD0D7FD5AE46
图S7：
Derm15肽的电子密度。ClfB结构的带状表示(208–542)与来自Dermokine的Derm15肽结合。肽以棒状显示，肽周围的2Fo-Fc图也显示为1.5σ。蛋白质和肽的颜色方案与图S2A和B。（畅通节能法）
GUID:9ED80389-E5CF-42B5-B55E-DC52BCF55BB9
图S8：
中央情报局S236A型和ClfBW522A型单个突变体不能结合Derm15肽。A和B表面等离子体共振（SPR）显示不同浓度的合成Derm15肽与ClfB的结合(197–542)固定在GLH传感器芯片上的S236A或W522A单突变体。红色，4 mM；绿色，2 mM；蓝色，1 mM；粉红色，0.5 mM；橙色，0.25 mM.C.ClfB的动力学和亲和力结合值（197–542）用Derm15肽突变S236A或W522A。（畅通节能法）
GUID:6ACF7A5F-0D33-4EFC-BE01-643111AACB1D
摘要
金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)发病机制是一个复杂的过程，涉及多种细胞外和细胞壁成分。ClfB是一种MSCRAMM（微生物表面成分识别粘附基质分子）家族表面蛋白，被描述为纤维蛋白原结合聚集因子，是金黄色葡萄球菌鼻腔定植，但ClfB配体识别的分子基础尚不清楚。在本研究中，我们解决了载脂蛋白-ClfB及其与纤维蛋白原α（Fgα）和细胞角蛋白10（CK10）肽的复合物的晶体结构。结构比较显示，配体中存在一个保守的富含甘氨酸（GSR）的ClfB结合基序（GSSGXGXXG），该基序也存在于其他人类蛋白质中，如Engrailed蛋白、TCF20和Dermokine蛋白。随后的结合试验证实了Dermokine和ClfB之间的相互作用。ClfB与Dermokine衍生的15-残基肽的晶体结构显示出与ClfB-Fgα和ClfB-CK10晶体结构中相同的ClfB肽结合模式。这里的结果突出了ClfB的多配体结合特性，这与目前其他特征化MSCRAMM非常不同。携带GSR基序的多肽粘附在ClfB的同一口袋中，这让人想起MHC分子。我们的结果为识别其他靶向分子提供了模板金黄色葡萄球菌在其定植和感染期间。我们认为其他MSCRAMM如ClfA和SdrG也具有多配体结合特性。
作者摘要
金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)作为一种重要的机会性病原体，是对人类和动物的主要威胁，在全球范围内造成高发病率和高死亡率。它可引起多种感染，从轻微的浅表感染到严重的感染，如感染性心内膜炎、化脓性关节炎、骨髓炎和败血症。由于抗生素耐药性的增加，这种感染越来越令人担忧金黄色葡萄球菌s.为了了解金色S.aureu我们研究了一种由纤维蛋白原α（Fgα）和细胞角蛋白10（CK10）结合的细菌表面蛋白聚集因子B（ClfB）。通过对高分辨率晶体结构的分析，我们发现ClfB-结合肽具有一个延伸的一致序列（GSSGXGXXG），该序列也在Engrailed蛋白、TCF20和Dermokins中保守。ClfB与皮细胞因子衍生肽之间的相互作用通过结合试验证明。与ClfB在由金黄色葡萄球菌真皮因子在上皮组织中表达为主，在炎症性疾病中表达上调。本研究中的数据提出了一种可能性，即ClfB在金黄色葡萄球菌感染。ClfB的多配体结合特性将有助于开发新的治疗策略。
介绍
金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)是一种重要的机会性病原体，对人类和动物构成重大威胁，在全球范围内造成高发病率和高死亡率。它可引起多种感染，从轻度浅表感染到严重感染，如感染性心内膜炎、脓毒性关节炎、骨髓炎和脓毒症[1]这种感染越来越令人担忧，因为金黄色葡萄球菌秒[2],[3]身体内的多个部位可以定植，包括会阴和腋下，但最常见的部位是前鼻孔的潮湿鳞状上皮。此外，该生物体可以通过血流从表面部位传播到内部器官，从而形成感染的转移灶。约80%的侵入性金黄色葡萄球菌感染是自体的，因为它们是由病人生病前鼻子里携带的菌株引起的[4],[5].
能力金黄色葡萄球菌导致疾病的原因通常被归结为两类毒性决定因素：细胞壁相关蛋白和细胞外蛋白毒素。发病的最初步骤通常是细胞粘附，由称为MSCRAMM（微生物表面成分识别粘附基质分子）的表面粘附素介导[6],[7]。到目前为止，金黄色葡萄球菌已知可以表达20多种不同的潜在MSCRAMM[8],[9].
SD-repeat-containing（Sdr）蛋白是MSCRAMM家族的成员，包括聚集因子A（ClfA）、ClfB、SdrC、SdrD和金黄色葡萄球菌和的SdrF和SdrG表皮葡萄球菌Sdr蛋白的特征是存在一个主要由重复的SD二肽组成的R区[10]它们具有类似的结构组织，包括N末端分泌信号序列，其后是配体结合a区和主要由天冬氨酸和丝氨酸残基组成的二肽重复区（R）。LPXTG细胞壁支撑基序（W）紧跟在SD-重复区之后，其后是疏水性跨膜结构域（M）和短的带正电荷的细胞质尾部（C）。尽管它们的结构组织保守，但Sdr蛋白在序列上并不密切相关，在配体结合A结构域中只有20%-30%的相同氨基酸残基。这表明不同的Sdr蛋白可能在金黄色葡萄球菌发病机理[11].
ClfB是最具特征的表面蛋白之一金黄色葡萄球菌在过去的十年里[12]——[18]这种粘连蛋白的多功能特性非常独特，不像ClfA和SdrG被证明只与纤维蛋白原结合[19]——[21].ClfB通过与鳞状上皮细胞上表达的人类I型细胞角蛋白10（CK10）结合，在建立人类鼻定植中发挥关键作用[17],[18],[22],[23]一致地，最近的研究表明，ClfB免疫小鼠可减少鼻腔定植[24]作为一种双功能MSCRAMM，ClfB还与纤维蛋白原α（Fgα）结合，纤维蛋白原α被认为在血小板活化和聚集中具有重要作用，并已被证明有助于大鼠实验性心内膜炎的发病机制[7],[17],[25],[26]与与纤维蛋白原γ链结合的ClfA、FnBPA和FnBPB不同，ClfB与其α链柔性区域的重复序列5（NSGSSGTGSTGNQ）结合[15],[16],[27]重复序列可以形成一个环，类似于Tyr-（Gly/Ser）n个CK10的C端存在Ω环，ClfB也与之结合[18].Fgα和CK10在ClfB上具有相同或重叠的结合位点[18]，但ClfB识别Fgα和CK10的详细机制尚不清楚。
结构研究表明，ClfA和SdrG具有不同的配体结合特征和机制[21],[28]，尽管这两种MSCRAMM粘附域的结构组织非常相似。提出了一种用于SdrG配体识别的“坞、锁和闩”（DLL）模型，其中SdrG采用开放构象，允许Fg配体进入N2和N3结构域之间的结合沟[21]然而，在ClfA中，空腔是以稳定的闭合构型形成的，纤维蛋白原γ链的C末端在其中穿梭。因此，ClfA-Fg绑定机制被提议为“Latch and Dock”[28].
在这里，我们解决了载脂蛋白-ClfB粘附结构域及其与来自Fgα和CK10的肽的配合物的晶体结构。我们的结构表明，ClfB识别配体的方式与DLL模型类似。先前对ClfB与Fgα和CK10肽复合的结构的研究表明，保守肽衍生基序（GSSGXG）是它们与ClfB结合所必需的[29]然而，本研究中的数据支持至少九个氨基酸Gly-Ser-Rich（GSR）基序，该基序对于与ClfB结合是必要和充分的。利用该基序作为模板进行人类基因组挖掘，确定了几个候选的潜在ClfB结合蛋白，包括Engraired蛋白、TCF20和Dermokine。生化和结构研究证实了Dermokine与ClfB的相互作用，这表明ClfB利用几乎相同的机制识别其结合伙伴。我们的数据不仅提供了对ClfB配体结合机制的见解，而且还提出了ClfB在金黄色葡萄球菌感染。这些结果将有助于开发新的治疗策略。
结果
apo-ClfB的结构（197–542）
先前的研究表明，含有N2和N3区域的ClfB片段()足以识别Fgα和CK10[18],[27],[29]因此，我们克隆了编码ClfB蛋白两个区域（氨基酸197至542）的片段金黄色葡萄球菌并从中纯化蛋白质大肠杆菌用于我们的结构研究。ClfB的结构(208–540)-Fgα(316–328)该复合物由Se-Met衍生蛋白溶解，并用作通过分子替换法测定其他结构的起始模型().
apo-ClfB的晶体结构(197–542).A.ClfB的域组织。识别相邻结构域之间边界的氨基酸残基的数量如下所示。S、 信号序列；N1-3，N端纤维蛋白原结合区；R、 丝氨酸天冬氨酸重复区；W、 壁挂域；M、 膜锚；C、 细胞质带正电荷的尾巴。N2和N3畴用于ClfB的结晶（197–542）-肽复合物。B.apo-ClfB结构的带状表示(197–542)，并指示其N和C端子。N2和N3域分别以橙色和洋红色显示。线和环都有标记。C.单位细胞中两个对称相关分子的带状表示，分别以橙色和品红色显示。这两个分子的N和C末端都已标明。D.近距离观察两个对称相关分子之间的相互作用。一个分子（氨基酸196–201）的N末端显示为棒状，另一个分子呈洋红色，如（B）所示。这两种分子中的氨基酸分别用红色和黑色标记。氢键显示为红色虚线。
表1
数据收集和结构优化统计。
| 参数 | Fgα结合 | CK10结合 | Dermokine界限 | 无肽 |
| 数据收集 | Se-SAD公司 | 本地 | 本地 | 本地 |
| 空间组 | 第3页121
| 第3页121
| 第3页121
| 第4页三212 |
| 单位单元格（Ω） | 70.98, 70.98, 174.91 | 70.33, 70.33, 177.15 | 70.08, 70.08, 175.76 | 94.42, 94.42,86.71 |
| 波长（Ω） | 0.979 | 0.979 | 0.919 | 0.979 |
| 分辨率（Ω） | 1.92 (1.99-1.92) | 2.3 (2.34-2.3) | 2.5 (2.59-2.5) | 2.51（2.6-2.51） |
| Rsym公司*(%) | 9.9(68) | 8.6(50) | 7.8(54) | 7.5（53.1） |
| I/西格玛 | 56.5(1.75) | 28(2.5) | 22.9(2.1) | 45.6(10.1) |
| 完整性（%） | 99.5(98.1) | 99.6(99.5) | 98.3(88.1) | 100(100) |
| 冗余 | 8.2(7.6) | 10.2(7.9) | 8.5(5.9) | 14.4(9.9) |
| 威尔逊B因子（Å2) | 40.6 | 38.7 | 61.3 | 52.1 |
|
SAD分阶段
| | | | |
| 异常散射体 | 3硒 | | | |
| 直方图（FOM） | 0.387 | | | |
| DM之后的FOM | 0.687 | | | |
| 相位组合后的FOM | 0.788 | | | |
|
精炼
|
| R系数#
| 0.1792 | 0.2204 | 21.95 | 23.29 |
| R自由 | 0.2145 | 0.2546 | 25.43 | 28.87 |
| 原子数 | 2899个蛋白质原子+117 H2O+2镁2+
| 2593个蛋白质原子+5小时2O+1镁2+
| 2640个蛋白质原子+11个H2O+2镁2+
| 2558个蛋白质原子+5 Mg2+
|
|
B因素：
|
| 总体 | 38.53 | 39.47 | 63.91 | 55.95 |
| 主链条 | 36.45 | 37.11 | 62.64 | 53.21 |
| 侧链 | 40.6 | 41.84 | 65.16 | 58.48 |
| RMSD债券长度 | 0.006 | 0.008 | 0.007 | 0.01 |
| RMSD结合角 | 0.998 | 1.168 | 1.168 | 1.169 |
|
Ramachandran图统计（%）
|
| 首选区域 | 95.4 | 93.4 | 92.3 | 94.9 |
| 允许的区域 | 4.4 | 5.2 | 6.8 | 3.9 |
| 异常值 | 0.3 | 1.3 | 0.8 | 1.2 |
| PDB代码 | 4层27 | 4F1Z型 | 40层 | 4层24 |
apo-ClfB(197–534)结构以2.5º的分辨率溶解，由残基Ser197-Ala534组成(). 在apo-ClfB结构中，未观察到C末端八个残基的电子密度。载脂蛋白-ClfB多肽链(197–534)由两个不同的域N2和N3组成，如前所述金黄色葡萄球菌()[30]N末端N2-结构域包含146个残基（氨基酸213–358）和N3结构域170个残基。在晶体结构中，N2和N3都有两层相互紧密包裹的β片(). 相反，这两个结构域之间的堆积更为松散，导致它们之间形成一个大凹槽，可能是配体结合的地方。在N3结构域中，a、B、E和D股形成两个主片之一，而对面的D′、D〃、C、F和G股则形成另一个主片。类似于其他Fg结合MSCRAMM的结构[21],[28],[29],[31]与C型IgG褶皱相比，N2和N3的结构显示出典型的Dev-IgG褶皱，其特征是存在额外的D′和D〃链[30]N2和N3畴的结构可以很好地重叠，所有Cα原子的均方根偏差为0.98º。然而，它们之间的一个结构差异是N2一侧的三股β-片（A、B和E）与N3中相应一侧的四股β-板（D、F、C和G〃）相比，如ClfA、SdrG和ClfB的结构所述[21],[28],[29].
ClfB公司序列197和ClfB洛伊198甚至一个短的N末端延伸片段，如不相关的His-tag，被证明是维持ClfB的Fg结合活性所必需的[16]尽管N2的N末端段如何参与底物结合的机制尚不清楚。在apo-ClfB的晶体结构中，一个ClfB的N端（Ser197-Ala201）(197–542)分子与对称相关的ClfB分子的N3结构域结合，与链G一起形成β片(和图S1)由2对主链氢键介导。涉及ClfB的额外氢键格林235和ClfBVal200型进一步促进ClfB之间N-末端介导的相互作用(). 这些相互作用可能共同作用以稳定N3结构域的G链，从而维持其Dev-IgG折叠并模拟配体结合的过渡状态。
（本文中的所有结构图都是用PyMOL生成的[32]).
含有纤维蛋白原α（Fgα）的ClfB的结构(316–328)和I型细胞角蛋白10（CK10）(499–512)肽复合物
ClfB是一种关键的黏附素介导金黄色葡萄球菌通过结合CK10和Fg遵守[18],[27]为了研究ClfB配体识别的分子机制，我们解决了ClfB的晶体结构(208–542)与CK10（氨基酸499–512，称为CK10(499–512))或Fgα（氨基酸316–328，称为Fgα(316–328))分别为2.3º和1.92º(). 电子密度明确地定义了结构中肽的存在(图S2). 在这两种配合物中，肽采用延伸构象，并插入在N2和N3之间形成的隧道中。结构比较表明，肽结合诱导β链G在其C端延伸，覆盖结合肽(和图S2). 在与各自配体络合的ClfA和SdrG的结构中也观察到了类似的结构特征(图S3)[21],[28]肽和每个复合物中两个结构域之间的紧密接触导致广泛的相互作用，其埋藏表面积为966.62在ClfB-Fgα中(316–328)和1002.6º2在ClfB-CK10中(499–512).
ClfB-配体结合与DLL模型一致。A.apo-ClfB、ClfB-Fgα和ClfB-CK10复合物重叠的带状表示。apo-ClfB显示在柠檬中。在ClfB-Fgα复合物中，蛋白质和Fgα分别显示为洋红色和海洋色。在ClfB-CK10复合体中，ClfB和CK10分别显示为橙色和黄色。B.ClfB-Fgα复合物中N3结构域和N2结构域的C末端G′链之间的相互作用。参与G′链和N2结构域相互作用的残基分别显示为棒状，并用蓝色和黑色字符标记。Fgα肽显示为黄色的棒状物。C.本研究中解决的ClfB-Fgα复合体和V.Ganesh等人的复合体（PDB条目：3AT0）的结构对准以立体视图显示，RMSD为0.635º。本研究中的ClfB-Fgα复合物显示为橙色，肽显示为相同颜色的棒状物。V.Ganesh等人的相应结构中的ClfB显示为青色，Fgα显示为标记有N和C末端的棒。指出了ClfB在两种结构中的C端和本研究中ClfB的G′链。D.本研究和V.Ganesh等人（PDB条目：3ASW）解决的ClfB-CK10复合体的结构对准，RMSD为0.479º。本研究中的ClfB-CK10复合物显示在海洋中，肽显示为带有N和C末端标记的棒状物。V.Ganesh等人在相应结构中的ClfB用石灰表示，CK10用木棍表示。指出了ClfB在两种结构中的C末端。
对apo-ClfB和这两种配合物的结构比较表明，ClfB中Cα原子的RMSDs分别为0.46和0.49，表明配体结合后整体ClfB保持不变(). 然而，ClfB的C末端发生了明显的构象变化(499–512)在这两个复合体中。在ClfB-Fgα中(316–328)、残留物ClfBArg529-542系列在apo-ClfB结构中无序的，在Fgα之后变得很明确(316–328)结合。ClfB的远端C末端(197–542)形成短β链G′，与来自N2结构域的β链E形成平行的β片。β-片的形成由几个主链和侧链氢键介导(). 配体诱导的ClfB C末端肽的稳定使其能够穿过Fgα(316–328)在顶部。这种绑定模式与SdrG-Fgβ复合物中所示的DLL模型一致[21],[28]与Fgα相比(316–328)，肽CK10(499–512)未诱导ClfB中β链G′的形成(). 然而，与Fgα相互作用的链G的C末端部分(316–328)也变得清晰，CK10上的上限(499–512)肽。
在我们准备这份手稿时，V.Ganesh等人报道了载脂蛋白和配体结合ClfB的结构[29]有趣的是，我们在这里观察到的结构特征与Fgα/CK10-ClfB络合物的结构特征明显不同[29]在这两种结构中，尤其是在Fgα-ClfB复合物中，虽然肽采用了与我们结构中相同的保守构象，但G链的C末端表现出不同的取向，并且没有插入N2结构域以与链E形成额外的链G′，因此肽不会锁定在N2和N3之间的凹槽中(). 这样，它们的结构就不支持基于SdrG蛋白结构提出的DLL模型[21]此外，在肽结合中，N2中D和D′之间的环不会发生重排(). 虽然CK10-ClfB配合物中ClfB的C末端与我们的结构具有相似的构象，但N2域的D D′环也没有重排(). 我们和Ganesh等人工作中观察到的肽构象的差异可能归因于结晶过程中采用的方法。虽然我们在结晶之前将ClfB与肽共同纯化以形成复合物，Ganesh等人报告称，他们将肽浸泡在apo-ClfB晶体中[29]在它们的结构中，在我们的研究中观察到的适应肽并将其锁定在适当位置的构象变化可能会受到晶体内晶体堆积的阻碍。
总之，我们的结构强烈支持ClfB-配体结合的DLL模型。简言之，肽的“Dock”触发N3结构域C末端的重排，允许ClfBArg529型与ClfB形成氢键Asn238型来自N2域。这将导致肽“锁定”到底物结合槽中，而G′和N2的E链之间的强相互作用可以“锁定”肽().
ClfB、ClfA和SdrG的结构比较
尽管氨基酸序列的同源性较低，但ClfB、ClfA和SdrG的结构具有高度的相似性(). 最保守的残基主要位于它们的环区(). 虽然ClfB、ClfA和SdrG的粘附结构域组织及其配体结合位点是保守的，但这三种MSCRAMMS的配体结合特异性不同()[18],[21],[28]所有结合肽形成与G链配对的β链，并通过由N2、N3和G链末端形成的通道(图S3). 在ClfB-Fgα中(316–328)/第10页(499–512)结构，一个肽与一个ClfB结合，方向与ClfA中的Fgγ链肽相同，与SdrG中的Fgβ链肽相反()[21],[28].
ClfB、ClfA和SdrG的结构对齐。A.ClfB（氨基酸212-550）、ClfA（氨基酸229-544）和SdrG（氨基酸117-441）的序列比对。显示100%和50%同一性的残留物分别以深蓝色和浅蓝色显示。ClfB中的F406用红星标记。B.ClfB的带状表示，保守残基按照从高度保守到不太保守的顺序从红色到绿色。C.分别以橙色和青色显示的apo-ClfB和apo-SdrG的叠加。D.ClfB-Fgα、SdrG-Fgβ和ClfA-Fgγ复合物的叠加。SdrG-Fgβ和ClfB-Fgα的颜色如ClfA-Fgγ络合物呈蓝色。
在ClfA-Fgγ和SdrG-Fgβ结构中，N3结构域的C末端形成β-支架G′(). 凝聚因子泰尔338在SdrE和SdrD的结构中保守（数据未显示），与G链末端的氨基酸（ClfA中的Asn530）形成氢键，从而稳定G′链的构象(图S4). 在ClfB中，相应位置的氨基酸被苯丙氨酸（ClfB）取代菲328) (). 对ClfB的载脂蛋白和配体结合形式结构的比较表明，配体与N3的G链之间的相互作用在N3的C末端重定向中起着重要作用。ClfB公司Arg529型是ClfB中G链C末端的最后一个残基，与两种复合结构中的配体肽相互作用。ClfB公司Asn238型和ClfBArg529型形成稳定的氢键，将肽锁定在GG′覆盖的隧道中。有趣的是，尽管在ClfB-CK10结构中G′链看起来无序，但ClfBAsn238-Arg522氢键也存在()，与DLL模型一致。总之，我们的结构强烈支持ClfB-配体结合的DLL模型。
ClfB的肽识别
在ClfB-Fgα的晶体结构中(316–328)/CK10型(499–512)复合物，两种肽都位于N2和N3之间的隧道中。肽被β链G的C末端覆盖(图S2). 这两种肽的C末端具有几乎相同的构象，在Fgα处形成一个转折甘氨酸326和CK10格莱510(图S5). 相比之下，肽的N末端有显著不同。Fgα处的急剧扭转Gly318型允许肽的N末端部分退出通道并指向上方。与Fgα不同(316–328)，CK10(499–512)采用更大的构造。
观察到蛋白质和肽之间的距离小于4º的多次接触(和图S6). ClfB与肽之间的相互作用主要通过一些氢键介导。在ClfB和两个肽的中间区域之间观察到保守的氢键(). 两种肽的中间区域与ClfB的G链的疏水性接触(208–542)β-片A、B之间的环和N2结构域β-片C、D之间的环也有助于肽-蛋白质相互作用。
ClfB-CK10/Fgα复合物中ClfB配体结合之间的详细相互作用。A.ClfB-CK10复合物中配体和ClfB之间的详细相互作用。ClfB和CK10肽显示为棒状，分别为洋红色和黄色。氢键用红色虚线表示。ClfB和CK10的氨基酸分别用黑色和红色标记。B.ClfB-Fgα络合物中配体和ClfB之间的详细相互作用。ClfB和Fgα肽显示为棒状，分别呈青色和板岩色。氢键用红色虚线表示。ClfB和Fgα的氨基酸分别用黑色和红色标记。
在ClfB中(208–531)-CK10型(499–512)结构复杂，在肽的主链和N3结构域的G链之间观察到四对氢键，从而形成平行的β-片。ClfB侧链中的极性基团Trp522和Asn524在N3域中与CK10的羟基形成两个氢键503系列CK10的羟基503系列与ClfB形成第三氢键序列376N3和CK10的侧链羟基504系列与ClfB形成另一氢键序列236N2。CK10中部残基与ClfB相互作用Ser236、Asp270和Asn526通过主链氢键(和图S6A). CK10的氨基之间也观察到氢键Ser504和Gly506和ClfB的侧链羟基或羰基Asn234和Asp270在N2的环区。C末端残基CK10的羰基Ser508和Ser509与ClfB侧链羟基相互作用蒂尔273在N2的CD-回路中(和图S6A，B）。ClfB的芳香环Trp522型通过与CK10的疏水相互作用，N3的G链在锚定CK10肽的N末端中起着重要作用格莱501和CK10甘氨酸502肽的C末端位于由N2环区残基形成的疏水沟槽中，并被N3的G链覆盖(和图S6A、B).
Foster的研究表明CK10的替代甘氨酸507大量残基酪氨酸导致CK10与ClfB失去相互作用[33]结构分析表明，CK10周围的空间甘氨酸507受其相邻残基ClfB的显著限制Val528、Gly269、Val271和Phe328.建模研究（未显示数据）表明，任何带有侧链的残基都会产生空间位阻，并且不能容纳在上述四个ClfB残基定义的口袋中(和图S6C、D).
ClfB特异识别Fgα（Fgα5）重复序列5的机制
人类Fg的FgαC末端结构域（氨基酸221-610）包含10个13位串联重复序列，其中最多有8个残基是甘氨酸或丝氨酸[34]尽管重复序列相似，但只有Fgα5被ClfB识别[18]这被认为是因为其他重复序列中假定Ω环中心存在脯氨酸或精氨酸残基，尽管其确切的潜在机制尚不清楚[27]。此处所示的晶体结构为这一观察提供了解释。两个复合物的结构比较表明，肽与ClfB的相互作用主要通过肽中的保守基序G-S-G-S/T-G-S-X-G介导(). 重复序列的序列比对表明Fgα5与其他重复序列在5第个, 7第个和9第个职位(). S/T在5第个位置与氢键相互作用有关。另一方面，该位置的残留物大小受其相邻残留物的限制。因此，由于氢键相互作用的丧失或空间位阻的产生，除S/T外，该位置的其他残基预计会破坏重复序列和ClfB之间的相互作用。第7个第个位置似乎在维持肽的局部构象方面发挥作用，通过与9第个位置。在V.Ganesh等人解决的CK10-ClfB络合物结构中，7第个该位置被组氨酸残基取代，表明该位置的残基可以改变(图S6). G9残留物流向β-表D和ClfB的末尾Met280型和ClfB专业281在N2限制残留物中，任何侧链都会对其产生碰撞。此外，在G处转弯9需要允许肽流出通道，解释为什么在这个位置带有丙氨酸的重复序列2不能与ClfB结合()[18].
特异性识别Fgα重复序列5的机制。A.Fgα和CK10肽的重叠。Fgα和CK10肽显示为棒状，分别为黄色和板岩色。红色虚线边界内突出显示的残基构成了对ClfB结合很重要的片段。共识氨基酸显示在肽上方。B.Fgα、CK10（I型细胞角蛋白10，残基473–485和残基499–511）、K10（角蛋白10、I型细胞骨架10异构体-1）的重复序列2、3、4和5的序列比对黑猩猩，残基501-513），Derm（Dermokine，残基250-264），TCF20（TCF20，残基49-57），EN（工程蛋白，残基37-45）和衍生肽9。保守氨基酸以红色显示，一致序列在序列下方指定。已证明不能与ClfB结合的Fgα的重复序列2、3和4用天蓝色表示。
GSR基序在ClfB识别中的重要性
在仔细分析了ClfB的序列和肽结合特性后，我们提出了一个小的基序G1-S公司2-S公司三-G公司4-G/S/T公司5-G公司6-X（X）7-X（X）8-G公司9负责配体与ClfB粘附域的结合。取Fgα(316–328)-以ClfB复合体为例，在这个图案中，G1受到ClfB侧链的限制W522号机组由于空间的限制，Fgα肽也需要转弯才能离开通道。S系列2是最关键的残留物，因为它不仅与ClfB的侧链形成两个氢键W522号机组和ClfB问题377而且还绑定到ClfB的主链S376型类似于S2，S三与ClfB侧链形成两个氢键问题235和ClfB236美元在N2结构域中，可以被较小的残基（如丙氨酸）取代。以下残留物，尤其是G4、G/S/T/5和G6，是形成稳定的蛋白-肽复合物所必需的，因为它们与ClfB形成氢键，并且覆盖隧道的β-片G的大小不容纳具有较大侧链的残基。S系列7可能通过与G形成γ-圈来维持肽的局部构象9S的空间8对于侧链较大的残留物来说似乎足够了(和图S6). 最后，G9需要形成一个转弯，让肽离开通道。因此，ClfB有点软的结合沟能够结合一系列具有此特征的肽。
为了进一步证实我们关于9个氨基酸GSR基序重要性的假设，我们使用SPR（表面等离子体共振）系统对源自GSR基序的合成9个残基肽（GSSGSGSNG）进行了丙氨酸扫描。结果与我们的结构观察高度一致，并且清楚地表明九氨基酸肽对于与ClfB结合是必要的和充分的在体外().
ClfB与皮细胞因子肽相互作用的SPR分析。A.皮细胞因子肽小组。肽1对应于源自皮激酶蛋白（253-261）的9残基肽。被取代的肽（肽2–10）具有被丙氨酸取代的单个氨基酸，肽11是六个氨基酸肽。（B–L）。ClfB与肽1–11之间结合的SPR分析。海军，2000µM；洋红，1000µM；深青色或深黄色，500µM；蓝色，250µM；红色，125µM；绿色，62.5µM；黑色，31.25µM。K（K）D类单个结合分析的值显示在传感器图下方。
Dermokine是ClfB的潜在配体
我们的结果表明，携带GSR基序的蛋白质能够与ClfB结合。为了找到其他可能的ClfB配体，我们在NCBI蛋白质数据库中搜索包含G序列的其他蛋白质1-S公司2-S公司三-G公司4-G/S/T公司5-G公司6-X（X）7-X（X）8-G公司9三种蛋白质，TCF20、工程蛋白和Dermokine（Derm）被发现是重点，本研究对其中的Dermokin进行了更详细的评估(和). Dermokine在许多上皮组织中表达，定位于细胞内或细胞周空间，在炎症性疾病中过表达。两种主要亚型α和β是从同一位点的不同启动子转录而来的。最近，还发现了其他转录变体γ、δ和ε[35],[36].
首先，测试了Derm与ClfB的相互作用。为此，我们合成了一种源自Derm的15-氨基酸肽（250–264；GQSGSGSNGDNN，以下称为Derm15），然后使用SPR（表面等离子体共振）分析表征了其与ClfB的结合。在分析中，ClfB与肽结合，解离常数为2.37µM(). 有趣的是，结果还表明，Derm肽与ClfB以慢动力学相互作用，进一步支持DLL模型(). 为了理解这种相互作用的分子机制，我们解决了ClfB的晶体结构(208–542)以2.5º的分辨率与肽结合。正如预期的那样，Derm15与ClfB的交互方式与Fgα几乎相同(316–328)和CK10(499–512)(). ClfBArg529型与ClfB形成氢键Asn328型N3的C末端形成一条额外的链，与ClfB-Fgα类似(316–328)和ClfB-CK10(499–512)复合体(). 进行了突变研究，以进一步验证Derm15与ClfB的结合。我们更换了残留物ClfBS236，W522分别参与肽与丙氨酸的相互作用。将突变蛋白纯化至同质性，并使用SPR测试其与Derm肽的相互作用。当野生型ClfB与Derm15紧密结合时，突变蛋白ClfB(197–542)S236A或W522A与mM范围内的肽的结合亲和力低得多(图S8). 有趣的是，除了低结合亲和力外，这两种突变蛋白在实验中都表现出快速的结合和解离行为，而野生型蛋白则表现出缓慢的结合和几乎没有任何解离行为。这些结果表明，残留物ClfB第236页，第522页不仅参与与ClfB的结合，还参与稳定或“锁定”肽到位。总之，我们的结果强烈支持ClfB和Derm之间的相互作用在体外并提示Derm可能参与了由体内金黄色葡萄球菌.
Dermokine是ClfB的潜在配体。A.左：表面等离子体共振显示不同浓度ClfB的结合(197–542)从固定在蛋白质NLC传感器芯片上的Dermokine合成肽15。红色，700µM；蓝色，350µM；绿色，87.5µM。K（K）D类发现为2.37µM。右：ClfB的动力学和亲和力结合值(197–542)野生型，S236A或W522A带有Derm15肽的单一突变体。B.CK10、Fgα和Derm15与ClfB结合的比较特写视图。肽CK10、Fgα和Derm15显示为棒状，分别用黄色、石板色和绿色表示。标记了N和C端子。ClfB的N2和N3结构域的配色方案与C.载脂蛋白-ClfB和配体-ClfB复合物重叠的更近视图。N238和R529突出显示并显示为条。apo-ClfB用石灰着色，其他颜色与.
讨论
革兰氏阳性菌对宿主鼻孔的定植金黄色葡萄球菌由细胞表面蛋白家族介导，促进其与细胞外基质的粘附，即MSCRAMM[13],[18]ClfB作为该家族蛋白的一个组成部分，在过去十年中进行了研究，与仅与纤维蛋白原结合的ClfA和SdrG相比，ClfB在其多功能特性上具有独特性[18],[19],[21],[29].
与SdrG-纤维蛋白原复合物的研究一致[21]，本研究的数据支持ClfB与Fgα/CK10-衍生肽的DLL结合机制，但不支持V.Ganesh等人在之前的研究中提出的机制。[29]在他们的工作中，由于在晶体结构中没有观察到“锁存”过程，结合机制被归因于“DL”模型。然而，本研究中解决的ClfB肽复合物的结构以及SPR数据表明，DLL模型应该是ClfB与配体结合的机制。我们的结果还表明，DLL模型可能是MSCRAMM配体复合物的主要机制。
在V.Ganesh等人对ClfB复合物的研究中，他们提出了一个共同的GSSGXG基序，构成ClfB结合位点[29]这与之前对ClfB的研究不一致。例如，在十个串联Fgα重复序列中，重复序列2、3、4和5都包含GSSGXG基序，但只有重复序列5可以绑定到ClfB()[18]我们的结构和丙氨酸筛选分析表明1-S公司2-S公司三-G公司4-G/S/T公司5-G公司6-X（X）7-X（X）8-G公司9对于绑定到ClfB来说是必要且充分的在体外因此，预测结合了这样的基序的蛋白质能够与ClfB相互作用。事实上，我们的生化检测表明，含有ClfB结合基序的Dermokine衍生肽与ClfB相互作用(). 进一步支持这一预测，我们的结构研究表明，Dermokine衍生肽与ClfB的结合模式与Fgα/CK10衍生肽的结合模式几乎相同(). 总之，这些发现提出了一种挑衅性的可能性，即ClfB可能在金黄色葡萄球菌感染。鉴于ClfB是金黄色葡萄球菌鼻腔定植，这可能并不完全令人惊讶。
有趣的是，Dermokine最初被鉴定为一种表达于表皮基底层的基因，最近，除了α和β亚型外，还发现了该基因的其他亚型。该基因在各种细胞和上皮组织中表达，在炎症条件下过度表达[35],[36]，表明Dermokine可能在炎症过程中发挥作用，因为免疫细胞激活中介质的过度表达是许多炎症疾病的特征。ClfB不仅参与金黄色葡萄球菌人类鼻孔的定植，也存在于这种细菌引起的疾病中。此外，金黄色葡萄球菌也与包括角膜炎症在内的多种炎症过程有关。ClfB与Dermokine的结合增加了ClfB可能在金黄色葡萄球菌引起的炎症和Dermokine基因的过度表达可能作为生物标记物，其产物可以与ClfB结合并参与这一过程。显然，需要更多的调查来验证ClfB-Dermokine在金黄色葡萄球菌感染以及相互作用的生物学意义。
ClfB作为一种多配体结合蛋白的特性将对确定假定底物和进一步理解金黄色葡萄球菌感染途径。我们的发现也为开发能够根除疟疾的新型治疗药物提供了重要线索金黄色葡萄球菌个体携带，并有效干扰葡萄球菌感染。这一点尤其重要，因为迫切需要新的抗菌策略来对抗不断出现的耐药细菌[37],[38].
材料和方法
重组蛋白的克隆、表达和纯化
ClfB基因片段（对应197–542 aa）通过PCR从金黄色葡萄球菌纽曼基因组DNA。消化后巴姆HI和后面的III（NEB），将扩增的基因克隆到原核表达载体pQE32（GE Healthcare Life Sciences）中，产生His-tagged融合蛋白，并经DNA测序证实。预期蛋白表达于大肠杆菌高产菌株BL21。通过Ni-亲和柱层析和离子交换层析纯化重组His-tagged蛋白。为了纯化蛋白质-肽复合物，将合成的肽以10∶1的比例添加到浓缩蛋白质样品中，并在FPLC系统（GE Healthcare Life Sciences）上使用缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，2 mM DTT）进一步进行凝胶过滤色谱（Superdex-75柱）。通过SDS-PAGE监测来自不同纯化阶段（即亲和层析和凝胶过滤层析）的蛋白质。硒代蛋氨酸（Se-Met）取代的ClfB衍生物以类似方式表达和纯化。
结晶和结构测定
在pH 8.0、150 mM NaCl和2 mM DTT的10 mM Tris-HCl中，将载脂蛋白-ClfB及其与不同肽的复合物浓缩至30 mg/ml。晶体是用吊滴蒸汽扩散法生产的[39]使用Hampton Research的稀疏基质筛选试剂盒（Crystal screen试剂盒I和II），然后通过沉淀剂、pH、蛋白质浓度和添加剂的变化来改进条件。
通过将1.1µl蛋白质与1.1µl储备溶液混合并与200µl储备溶液平衡，在18°C下生长晶体。apo-ClfB晶体在0.2 M LiSO中生长4在pH值为5.6、20%异丙醇和20%聚乙二醇4000的0.1 M柠檬酸钠三元脱水溶液中，生长0.1 M Tris-HCl pH值8.5、30%聚乙二醇4000和所有与肽的配合物。类似条件用于生成Se-Met取代的ClfB晶体。在上海同步辐射设施（SSRF）使用MAR225（MAR Research，Hamburg）CCD探测器在100K下分别在0.919Å和0.979Å的波长下收集Native和Se-SAD数据，并用HKL2000进行处理[40]。使用CCP4套件中的程序进行进一步处理（协作计算项目，1994年）。
使用SHELX定位硒位点[41]根据Se-SAD数据中的Bijvoet差异。使用PHASER的SAD实验相位模块细化重原子位置并计算相位[42].实际空间约束应用于DM中的电子密度图[43].所得图谱质量足以用于COOT中ClfB分子的建模[44]。在CCP4中用分子置换法解决了与其他肽的结构，并用PHENIX对所有结构进行了精炼[45]包装。数据收集和结构统计汇总于.
合成肽
肽的合成和纯化已在前面描述过[18],[27]对于以下肽，给出了氨基酸残数，序列如下：来自Fgα链C末端重复序列5的肽（NSGSSGTGSTGNQ）；CK10尾部的一个肽（YGGGSSGGGSSGG）；Dermokine蛋白肽15（SQSGSSGSNGDNN）；GSR基序肽9（GSSGSGSNG）及其丙氨酸扫描突变形式；六个氨基酸的肽（GSSGSG）。
表面等离子体共振光谱
ClfB的绑定(197–542)使用ProteOn XPR36设备（Bio-Read Laboratories，Inc.）通过SPR对肽15进行评估。每个SPR实验都使用多通道检测。用缓冲液（10 mM HEPES pH 7.2，150 mM NaCl）平衡系统。在每个通道中，以100µl/min的流速在25°C下将肽捕获到ProteOn NLC传感器芯片（BIO-RAD）中。这导致肽在460 RU的响应水平上偶联。对于结合措施，ClfB(197–542)以100µl/min的流速同时以不同浓度注入。实验重复三次。
使用BIAcore T200仪器（GE Healthcare）在10°C下通过表面等离子体共振（SPR）测定ClfB与10个9氨基酸肽和6氨基酸肽之间的结合亲和力。采用标准胺偶联法，将ClfB蛋白固定在10 mM pH 5.0的醋酸钠中的研究级CM5传感器芯片上的约5300响应单元（RU）上。流动池1留空作为参考。为了收集亲和力分析的数据，将pH为7.4的10 mM HEPES缓冲液中的11个肽和150 mM NaCl，再加上0.005%（v/v）吐温20，以30µl/min的流速以各种浓度注入流动细胞。允许配体缔合60 s，解离120 s。数据通过BIAcore T200评估软件拟合1∶1 Langmuir结合拟合模型进行分析。
支持信息
图S1
单位细胞中的两个对称相关分子。A.单元细胞中两个对称相关分子的带状表示。这两个分子分别以橙色和青色显示。B.显示单位细胞中一个分子的N末端和另一个分子的G链之间相互作用的电子密度。标记N端的S197和L198，另一条的F和G股。
（畅通节能法）
图S2
Fgα和CK10肽的电子密度。A.ClfB的带状表示（208–542）-Fgα(316–328)复杂。肽以棒状显示，肽周围的2Fo-Fc图也显示为1.5σ。颜色方案与中的相同蛋白质和肽的N端和C端分别指定。B.ClfB的带状表示(208–531)-CK10型(499–512)复杂。肽以棒状显示，肽周围的2Fo-Fc图也显示为1.5σ。颜色方案与中的相同蛋白质和肽的N端和C端分别指定。
（畅通节能法）
图S3
ClfB的表面表示（208–540）、ClfA(229–545)和SdrG(276–597)显示肽“锁定”在分子中。表面根据以红色和蓝色表示的负电荷和正电荷残留物进行颜色编码。肽显示为棒状。（A） ，ClfB-Fgα(316–328).（B），ClfB-CK10(499–512).（C），ClfA-Fgγ(395–411).（D），SdrG-Fgβ(6–20).
（畅通节能法）
图S4
卡通视图显示Fgγ肽与ClfA之间的相互作用。碳原子、氧原子和氮原子分别以青色、红色和蓝色表示。肽的残留物显示为洋红色的棒状物。ClfA残留物用黑色标记，Fgγ残留物则用洋红色显示。氢键用红色虚线表示。
（畅通节能法）
图S5
ClfB配体结合隧道的近距离观察。A、 肽的N末端。ClfB表示为静电表面模型，负电荷和正电荷分别用红色和蓝色表示。Fgα肽叠加在CK10肽上，它们分别显示为蓝色和黄色的棒状物。B、 肽的C末端。颜色方案与中的相同图S5A.
（畅通节能法）
图S6
配体结合的详细相互作用。A.ClfB-CK10复合物中ClfB配体结合隧道的近景。ClfB表示为静电表面模型，负电荷和正电荷分别用红色和蓝色表示。CK10肽显示为黄色的棒状物。氢键用红色虚线表示。B.ClfB和CK10肽之间氢键相互作用的示意图。氢键显示为虚线。与CK10的相互作用来自N3结构域中的G链，来自ClfB中N2结构域的AB和CD环。C.ClfB-Fgα复合物中ClfB配体结合隧道的近景。颜色方案与中的相同图S6A氢键用红色虚线表示。D.ClfB和Fgα肽之间氢键相互作用的示意图。氢键显示为虚线。与Fgα的相互作用来自N3结构域的链G，以及ClfB中N2结构域的AB-和CD-环。
（畅通节能法）
图S7
Derm15肽的电子密度。ClfB结构的带状表示(208–542)与Dermokine中的Derm15肽结合。肽以棒状显示，肽周围的2Fo-Fc图也显示为1.5σ。蛋白质和肽的颜色方案与图S2A和B。
（畅通节能法）
图S8
中央情报局第236页和ClfBW522A型单个突变体不能结合Derm15肽。A和B表面等离子体共振（SPR）显示不同浓度的合成Derm15肽与ClfB的结合（197–542）固定在GLH传感器芯片上的S236A或W522A单突变体。红色，4 mM；绿色，2 mM；蓝色，1 mM；粉红色，0.5 mM；橙色，0.25 mM.C.ClfB的动力学和亲和力结合值(197–542)用Derm15肽突变S236A或W522A。
（畅通节能法）
致谢
我们要感谢蔡继杰（清华大学）对手稿的有益讨论和批判性阅读。我们感谢SSRF BL17U光束线的工作人员在数据采集方面提供的帮助。
脚注
提交人声明，不存在相互竞争的利益。
这项工作得到了中国科学技术部（2011CB910500和2012CB911100）和国家自然科学基金（31030020、31170679和31101824）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
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